張瑤 宋小雙 張值榮 刁桂萍 李亞洲 鄧勛

(東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040) (黑龍江省森林保護研究所) (東北林業(yè)大學(xué)) (黑龍江省森林保護研究所)

松樹天牛主要危害松科、杉科植物,主要危害方式是通過幼蟲鉆蛀樹干、枝條的韌皮部及木質(zhì)部,破壞和切斷輸導(dǎo)組織,影響水分和養(yǎng)分運輸,進而影響樹木的生長,嚴重時可造成植株死亡[1]。松樹天牛的部分種類是松材線蟲病的傳播媒介[2],松材線蟲病的傳播可對松林資源造成重大危害,因此有效防控天牛危害一直是我國森林保護的重要工作和研究重點[3]。

近年來,化學(xué)藥劑的使用對控制天牛等害蟲的種群密度具有良好的效果,趙鵬等[4]通過打孔注入吡蟲啉或啶蟲脒等內(nèi)吸性較好的化學(xué)藥劑對天牛進行防控;馬海麗等[5]通過“樹干注藥+樹冠噴藥”的有機結(jié)合來防治黃斑星天牛;徐云等[6]使用“辛硫磷+克百威+橙皮桔油”直接噴干,防治光肩星天牛幼蟲。目前,由于缺乏對化學(xué)藥劑的有效安全管理策略,使用化學(xué)農(nóng)藥的負面影響會持續(xù)存在于土壤、濕地、地下水、非目標植物、脊椎動物的環(huán)境中[7],因此,利用生物防治害蟲越來越受歡迎。蟲生真菌具有寄主廣、防治害蟲不產(chǎn)生抗藥性、對環(huán)境友好等優(yōu)點[8],將其加工制作成真菌殺蟲劑,可作為有毒化學(xué)殺蟲劑的安全替代品[9]。

蟲生真菌廣泛分布于自然界中,能寄生于多種昆蟲,且致病能力強、改良潛力大、對非靶標生物毒性低,是一種具有巨大開發(fā)潛力的環(huán)境友好型殺蟲劑[10]。目前,已作為殺蟲菌劑應(yīng)用的昆蟲病原真菌菌種包括球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)、羅伯茨綠僵菌(Metarhiziumrobertsii)、淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinum)、蠟蚧輪枝菌(Lecanicilliumlecanii)等。本研究從黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū)收集67份土樣,使用黃粉蟲誘集和稀釋涂布平板法分離純化出蟲生真菌,通過逐步測定菌株對松樹天牛幼蟲、成蟲的致病力篩選出高致病菌株,并結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析確定菌株分類地位,初步探究昆蟲病原真菌防治松樹天牛的潛力。

1 材料與方法

供試菌株:土壤樣品于2021年8月份采自黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū),使用黃粉蟲誘集和稀釋涂布平板法分離純化獲得純菌株。將純菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基的試管斜面上,26 ℃恒溫培養(yǎng)10 d后,放入冰箱內(nèi)4 ℃保存。供試菌株詳細信息見表1。

表1 供試菌株的基本情況

供試蟲源:松樹天牛幼蟲于2022年4月份收集于野外的紅松(PinuskoraiensisSieb. et Zucc.)蟲害木,通過木段解剖獲取灰長角天牛幼蟲共328只,實驗時挑選活力好、蟲齡一致的幼蟲進行實驗。松樹天牛成蟲于2022年5月份收集于野外的紅松蟲害木,將蟲害木置于養(yǎng)蟲籠內(nèi),待松樹天牛成蟲羽化后放入打孔塑料盒內(nèi),用新鮮松樹枝條飼養(yǎng),共獲得灰長角天牛成蟲372只,實驗時挑選活力好且羽化日齡差異小的成蟲進行實驗。

不同濃度孢子懸液的制備方法:用體積分數(shù)為0.05%的吐溫-80溶液洗脫平板上的孢子,并轉(zhuǎn)移至裝有玻璃珠的50 mL離心管中,然后用漩渦振蕩器振蕩,使孢子充分分散,用三層無菌紗布過濾,稀釋后在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù),計算母液的濃度,將母液稀釋成孢子濃度為107個·mL-1的孢子懸液備用。取1 mL孢子濃度為107個·mL-1的孢子懸液,加入到9 mL體積分數(shù)為0.05%的吐溫-80溶液中,將其稀釋成孢子濃度為106個·mL-1的孢子懸液,再次稀釋獲得孢子濃度為105個·mL-1的孢子懸液。

蟲生真菌菌株的篩選方法:將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,放入培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng)10 d。使用爬行法[11]接種,將5只松樹天牛幼蟲放進培養(yǎng)好菌株的平板內(nèi)活動1 h,對照組放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)1 h,然后將試蟲轉(zhuǎn)移到打孔且裝有濕潤木屑的10 mL無菌離心管內(nèi),每只松樹天牛幼蟲使用1個離心管,室溫培養(yǎng),每天觀察試蟲狀態(tài)至6 d,試蟲死亡后繼續(xù)保濕培養(yǎng),觀察體表是否有菌絲長出,以確定是否被菌株感染致死。

將菌株接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng)10 d。使用爬行法接種,將3只松樹天牛成蟲放進培養(yǎng)好菌株的平板內(nèi)活動1 h,對照組放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)1 h,然后將試蟲放入底部墊有3張濕潤濾紙的組培瓶內(nèi),每2 d供應(yīng)1根新鮮的松樹枝條和補充0.5 mL無菌水作為食物和水源。每天觀察記錄試蟲狀態(tài)至6 d,試蟲死亡后繼續(xù)保濕培養(yǎng),觀察體表是否有菌絲長出,以確定是否被菌株感染致死。

不同菌株生長速度與產(chǎn)孢量的測定方法:用移液槍吸取20 μL孢子濃度為107個·mL-1的孢子懸液,滴至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基中央,放入恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)26 ℃培養(yǎng),在5、10、15 d時,采用十字交叉法測量菌落直徑。培養(yǎng)至15 d時,用體積分數(shù)為0.05%的吐溫-80溶液將平板上所有孢子沖洗下來制成孢子懸液,使用漩渦振蕩器振蕩,使孢子充分分散后,在顯微鏡下用血球計數(shù)板計算孢子懸液濃度,然后計算產(chǎn)孢量,實驗設(shè)3個重復(fù)。

不同濃度孢子懸液對松樹天牛室內(nèi)致病力的測定方法:利用M14-1、H2菌株,制備孢子濃度為107、106、105個·mL-1的孢子懸浮液,以體積分數(shù)為0.05%的吐溫-80溶液為空白對照。采用浸液法[12],將松樹天牛成蟲放入孢子懸液中浸泡5 s后取出,用濾紙吸干多余水分,放到底部墊有1張濕潤濾紙的組培瓶中,每2 d供應(yīng)1根新鮮的松樹枝條和補充0.5 mL無菌水。每2 d觀察記錄試蟲的狀態(tài),試蟲死亡后繼續(xù)補充無菌水保濕,且每天移至體視顯微鏡下觀察試蟲體表菌絲生長情況,并記錄試蟲形態(tài)特征。實驗設(shè)3個處理,每處理重復(fù)3次。

菌株M14-1、H2種類的鑒定方法:將分離得到的菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng),5 d時挑取菌絲于載玻片上,在顯微鏡下觀察并記錄菌株產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài)。培養(yǎng)至14 d時觀察并記錄菌落形態(tài)特征。然后用DNA提取試劑盒提取DNA,采用內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)序列進行分子生物學(xué)鑒定。引物:ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)或ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’);反應(yīng)體系(40 μL):2×20 μL的Taq Master Mix、2 μL的引物ITS1、2 μL的引物ITS4、2 μL的DNA模板、14 μL的ddH2O;PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次,72 ℃延伸5 min。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)擴增產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,合格后送往睿博興科生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

數(shù)據(jù)處理:利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)分析;利用DPS軟件擬合毒力回歸方程與計算半致死時間(LT50);并采用MEGA7.0軟件構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 對松樹天牛具有高毒力的蟲生真菌菌株篩選

表2為菌株對松樹天牛幼蟲、成蟲致病的累計死亡率和感染率。在松樹天牛幼蟲被接種4 d時,有16株菌接種的松樹天牛幼蟲出現(xiàn)僵蟲。在接種6 d時,18株菌接種的松樹天牛幼蟲都出現(xiàn)了僵蟲,表明這18株菌對松樹天牛幼蟲都具有致病力,其中菌株M8-2、M33-2、T11接種的松樹天牛幼蟲,在4、6 d累計死亡率分別達到了60%、100%,該菌株對松樹天牛幼蟲的致病力高于其他菌株;M14-1、H2、M3、M5等多種菌株在6 d時,累計死亡率均高達100%,感染率均達到80%及以上,對松樹天牛幼蟲致病力效果較好;菌株M25-3、M10的感染率未達到80%,通過觀察,發(fā)現(xiàn)未被菌株感染的僵蟲蟲體變黑且流出濃液,其是受培養(yǎng)條件影響致死。

表2 菌株對松樹天牛幼蟲、成蟲致病的累計死亡率和感染率

松樹天牛成蟲被接種3 d,有9株菌接種的松樹天牛成蟲出現(xiàn)僵蟲。在被接種的6 d,18株菌接種的松樹天牛成蟲出現(xiàn)了僵蟲,表明這18株菌對松樹天牛成蟲都具有致病力。其中菌株M14-1、M33-2、H2、Z1對松樹天牛成蟲致病力均高于其他菌株,被接種的松樹天牛成蟲在3、6 d累計死亡率分別達到66%、100%,且感染率均達到100%。菌株M10、M19-2、H1、T6-1對松樹天牛成蟲致病力效果次之,被接種的松樹天牛成蟲在3、6 d累計死亡率分別為33%、100%,感染率均達到100%(表2)。

松樹天牛幼蟲被菌株感染死亡后,試蟲體表黃色變深,身體略微皺縮,接著試蟲體表逐漸出現(xiàn)菌絲,且菌絲極易沾上木屑而影響觀察;松樹天牛成蟲被感染后,試蟲體表觸角、足、基節(jié)、口器變得脆弱,且很快長出菌絲,隨后菌絲逐漸長滿全身。松樹天牛幼蟲、成蟲被同一菌株感染后,菌絲、孢子堆的顏色、形態(tài)等基本特征變化不大(圖1)。

圖1 松樹天牛幼蟲、成蟲被感染后的特征

2.2 不同菌株的生長速度與產(chǎn)孢量測定

表3為不同菌株菌落在5、10、15 d的直徑及產(chǎn)孢量。其中菌株M14-1的菌落在三個時期的直徑均顯著大于其他菌株,在5、10、15 d時,其直徑分別為2.50、4.13、5.68 cm;菌株H2的直徑在5、10 d相比其他菌株沒有明顯優(yōu)勢,但在15 d時菌株直徑僅次于M14-1。菌株M14-1、H2培養(yǎng)到15 d時的產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株,其中菌株M14-1的產(chǎn)孢量為3.86×108個·板-1,菌株H2產(chǎn)孢量為4.10×108個·板-1。

表3 菌落的直徑與產(chǎn)孢量

總體上,菌株M14-1、H2對松樹天牛幼蟲和成蟲的致死率較高、致死時間短,且生長速度快,產(chǎn)孢量大,可作為優(yōu)良菌株進行下一步實驗。

2.3 菌株M14-1、H2不同濃度孢子懸液對松樹天牛室內(nèi)致病力的測定

表4為菌株M14-1、H2對松樹天牛成蟲致病的死亡率和半致死時間。隨著孢子懸液濃度的降低,菌株對松樹天牛成蟲的半致死時間逐漸增加,死亡率逐漸降低。在孢子濃度為107個·mL-1時,兩株菌的致死率均為100%,M14-1的半致死時間為4.15 d,H2的半致死時間為4.31 d。而在孢子濃度為106、105個·mL-1時,松樹天牛成蟲死亡率皆未達到100%。

表4 兩株菌對松樹天牛成蟲致病的死亡率和半致死時間

在接種5 d時,試蟲開始大量死亡,將試蟲轉(zhuǎn)移到體視顯微鏡下觀察,可在觸角、跗節(jié)、口器上觀察到少量菌絲,繼續(xù)保濕培養(yǎng)。死亡2 d時,試蟲體表可見大量白色菌絲,主要分布在基節(jié)窩、口器以及前胸與中胸之間,菌絲表面已產(chǎn)生少量墨綠色的分生孢子堆;死亡4 d時,試蟲體表已布滿墨綠色的分生孢子堆,此時試蟲觸角和足十分脆弱,很容易斷裂;死亡6 d時,試蟲體表的分生孢子堆更加密集,觸角和足變得柔軟脆弱(圖2)。

A、B為菌株M14-1;C、D為菌株H2。圖2 松樹天牛成蟲感染背面和腹面形態(tài)

表5為菌株M14-1、H2不同濃度孢子處理松樹天牛后不同時期的累計死亡率,可知孢子懸液濃度越高,累計死亡率就越高,當處理時間為2 d時,在濃度為106、107個·mL-1時已有成蟲死亡。當處理時間為8 d時,兩株菌在106、105孢子·mL-1濃度處理的天牛累計死亡率均未到達100%,表明仍有少數(shù)天牛成蟲未感染致死。

表5 菌株M14-1和H2不同濃度孢子處理后的天牛累計校正死亡率

2.4 菌株M14-1和H2的種類鑒定

圖3為菌株M14-1、H2培養(yǎng)14 d的菌落形態(tài)。菌株M14-1的菌體為圓形,直徑約6.10 cm,整體形態(tài)為灰色絨毛狀,部分呈現(xiàn)為黃色、白色,邊緣有一圈輪環(huán),中間突起,菌株H2的菌體為不規(guī)則圓形,直徑約6.91 cm,整體形態(tài)為白色絮狀,中部菌絲老化,呈現(xiàn)為淺綜色,邊緣菌絲表面有一層黑綠色分生孢子堆。兩菌株的分生孢子單個存在時均為無色透明、長圓柱形,聚集時為黑綠色,菌株H2的分生孢子顏色略深于菌株M14-1,形態(tài)微長于菌株M14-1,菌絲均光滑透明,且分枝分隔,培養(yǎng)基質(zhì)色澤為淡褐色。

圖3 菌株M14-1、H2的形態(tài)特征

以ITS1/ITS4為引物,對菌株M14-1、H2的DNA進行PCR擴增,測序結(jié)果顯示擴增條帶長度分別為522、526 bp。使用該序列在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中進行局部序列排比檢索基本工具(BLAST)比對,并下載相似性高的序列,使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。菌株M14-1與MetarhiziumanisopliaeSC44A03 (MW113483)聚為一支,同源性為99.00%,菌株H2與MetarhiziumanisopliaeBL23 (MW832543)聚為一支,同源性高達99.22%,根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析可知,菌株M14-1和H2均屬于金龜子綠僵菌(Mertarhiziumanisopliae)。

圖4 利用rDNA-ITS序列構(gòu)建的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論與結(jié)論

蟲生真菌是一種能夠主動侵染害蟲,并在害蟲體內(nèi)大量繁殖使其快速病死或衰弱的生防菌[13]。由于蟲生真菌的真菌殺蟲劑具有防控有效期長、寄主范圍廣、對非靶標生物無害等優(yōu)點,因此真菌殺蟲劑被廣泛應(yīng)用到農(nóng)林害蟲的防治上[14]。松樹天牛在黑龍江省分布廣泛且國內(nèi)針對松樹天牛的實際防治策略研究較少。致病力是衡量優(yōu)良菌株的重要指標,測定不同菌株對害蟲的致病力可以篩選出高致病力菌株,菌株的生長特性也是重要的考察指標之一[15]。為了開發(fā)針對松樹天牛綠色防控方法,本研究將從黑龍江省哈爾濱市、牡丹江市林區(qū)土壤樣品分離純化的18株蟲生真菌進行篩選。篩選獲得的菌株M14-1、H2菌落生長速度快,產(chǎn)孢量大,對松樹天牛成蟲的致病力均高于其他菌株,在接種的3、6 d累計死亡率均分別達到66%、100%,菌株M14-1、H2對松樹天牛幼蟲致病力高于其他菌株,在接種的6 d累計死亡率均達到100%,綜合考慮其應(yīng)用于生物防治的潛力較高。通過觀察形態(tài)和系統(tǒng)發(fā)育樹分析,鑒定2株菌株均為金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)。

金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae),作為應(yīng)用廣泛的一種昆蟲病原真菌,在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。目前,綠僵菌的生產(chǎn)、應(yīng)用和安全性已被許多國家做了大量細致的研究,能夠被金龜子綠僵菌寄生的昆蟲約有200余種,有些害蟲已開發(fā)出綠僵菌殺蟲劑,且具有良好防治效果[16]。劉建波[17]對星天牛成蟲采用爬行法測定了4株金龜子綠僵菌和1株球孢白僵菌的致病力,金龜子綠僵菌MaYTTR-04在15 d內(nèi)的致死率為100%,半致死時間為9.36 d,僵蟲率為40.0%;趙建偉[18]采用浸漬法測定了8株綠僵菌對草地貪夜蛾2年齡幼蟲的致病力,在孢子濃度為5×107個·mL-1時,致死率分別為88.76%、82.13%,半致死時間分別為4.81、4.93 d,獲得2株高致病力萊氏綠僵菌;何學(xué)友[19]采用浸漬法測定了7株金龜子綠僵菌對油茶象幼蟲的致病力,結(jié)果表明,菌株FJMa201101的半致死時間為1.65 d,感染率為86.60%,FJMa201205的半致死時間為1.71 d,感染率為91.10%。本試驗篩選獲得的2株菌M14-1、H2在孢子濃度為107個·mL-1時,用浸液法接種松樹天牛成蟲的半致死時間分別為4.15、4.31 d,其致病性要高于其他供試菌株;劉玉軍[20]在篩選高致病力白僵菌時,發(fā)現(xiàn)菌株的平均生長速度、產(chǎn)孢量、萌發(fā)率均與致病力相關(guān);蔡守平[21]篩選高致病力白僵菌和綠僵菌時,發(fā)現(xiàn)菌株產(chǎn)孢量與致病力也具有相關(guān)性。而本試驗中M14-1、H2的菌落生長速度和產(chǎn)孢量均顯著高于其他菌株,表明其應(yīng)用于生物防治的潛力較高。

本研究雖然通過松樹天牛幼蟲、成蟲進行毒力測定篩選獲得了2株高致病力金龜子綠僵菌,但其培養(yǎng)方法、生物特性、林間實際害蟲防治效果等尚未明確,今后可繼續(xù)開展相關(guān)研究,為利用金龜子綠僵菌防治松樹天牛提供更多支持。