陳成桐,楊金蘭,林頌雄,葉淑迎

(1.廣州海蘭圖檢測(cè)技術(shù)有限公司,廣州 510000; 2. 廣州市農(nóng)業(yè)機(jī)械化技術(shù)推廣站 廣州 510220)

揮發(fā)酚是指沸點(diǎn)在230 ℃以下,能與水蒸氣一同蒸出的酚類化合物[1]。揮發(fā)酚對(duì)人體或動(dòng)物都會(huì)產(chǎn)生不可逆的傷害。人體長(zhǎng)時(shí)間飲用被酚污染的水可引起各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[2-3]。魚類在含酚大于5 mg/L 的水體中,也會(huì)中毒死亡[4-5]。因此,在GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[6]中規(guī)定了Ⅰ類和Ⅱ類地表水中揮發(fā)酚的標(biāo)準(zhǔn)限值為0.002 mg/L,GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》[7]中揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)限值為0.002 mg/L,GB11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》[8]揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)限值為0.005 mg/L。目前,檢測(cè)水體中揮發(fā)酚的方法主要有液相色譜法[9]、氣相色譜法[10-11]、氣質(zhì)聯(lián)用色譜法[12、分光光度法[13-15]、流動(dòng)注射法[16-18]、連續(xù)分析法[19-21]等。由于液相色譜法、氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用色譜法等儀器造價(jià)較高,很多實(shí)驗(yàn)室都較難普及。分光光度法前處理步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、溶劑消耗量大、需用到三氯甲烷等有毒有機(jī)溶劑,對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成較大危害。流動(dòng)注射法基于連續(xù)流動(dòng)分析技術(shù),直接將樣品和試劑在管路中混合,帶過作用比較明顯,對(duì)高濃度和低濃度樣品的檢測(cè)結(jié)果影響較大,試劑消耗較多。連續(xù)流動(dòng)分析法通過采用片段流技術(shù),引入氣泡將液體流均分成小的反應(yīng)單元,有效阻止了樣品在管道內(nèi)的擴(kuò)散,加速了反應(yīng)的完成,減少了平衡時(shí)間,具有靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好、快速高效、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。因此,本研究基于4-氨基安替比林法測(cè)定揮發(fā)酚的原理,研究影響其反應(yīng)的關(guān)鍵因素,并進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn),建立了水體中揮發(fā)酚的連續(xù)流動(dòng)分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

AA3連續(xù)流動(dòng)分析儀(德國SEAL公司);Milli-Q Integral 3型超純水系統(tǒng)(德國Merck Millipore公司);磷酸、氯化鉀、氫氧化鈉、曲拉通X-100、硼酸(國藥集團(tuán)上海試劑廠,優(yōu)級(jí)純);4-氨基安替吡啉、鐵氰化鉀(99%,美國sigma公司);實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q Integral 3型超純水系統(tǒng)制備的超純水;水中揮發(fā)酚成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)080241,批號(hào) 18063,國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心);水質(zhì)揮發(fā)酚國家環(huán)境質(zhì)控樣(GSB 07-3180-2014,批號(hào) 200350);中國系列標(biāo)準(zhǔn)海水(國家海洋標(biāo)準(zhǔn)計(jì)量中心)。

1.2 溶液配制

50%曲拉通X-100溶液: 移取50 mL曲拉通X-100到100 mL容量瓶中,然后用乙醇定容并混勻。

蒸餾試劑16%磷酸溶液: 移取磷酸(ρ=1.69 g/mL)160 mL溶于700 mL純水中,待溶液冷卻后移入1 000 mL容量瓶中,用純水定容并混勻。

儲(chǔ)備緩沖液: 稱取9.00 g硼酸,5.00 g氫氧化鈉和10.00 g氯化鉀,溶解于800 mL純水中,用純水定容到1 000 mL,混勻備用。

鐵氰化鉀溶液: 稱取0.35 g鐵氰化鉀溶解于50 mL儲(chǔ)備緩沖液中,移入100 mL容量瓶中,加入1 mL 50%曲拉通X-100溶液,用儲(chǔ)備緩沖液定容并混勻。

4-氨基安替吡啉溶液: 稱取0.1 g 4-氨基安替吡啉溶解于50 mL儲(chǔ)備緩沖液中,移入100 mL容量瓶中,加入1 mL 50%曲拉通X-100溶液,用儲(chǔ)備緩沖液定容并混勻。

吸收試劑: 移取1 mL 50%曲拉通X-100到100 mL容量瓶中,用儲(chǔ)備緩沖液定容并混勻。

鹽度樣品: 鹽度值為5、20、30的樣品直接采用中國系列標(biāo)準(zhǔn)海水,鹽度值為0.05、2、10采用稀釋獲得。

酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液:ρ=1 000 mg /L,市售水中酚成分分析溶液有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

酚標(biāo)準(zhǔn)使用溶液:ρ=1 mg /L,分取適量酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液,逐級(jí)稀釋獲得。

1.3 樣品來源

流溪河水(取自流溪河25個(gè)站點(diǎn)的水樣)、養(yǎng)殖魚塘水(取自廣州市306個(gè)不同養(yǎng)殖場(chǎng)的水樣)、自來水(取自實(shí)驗(yàn)室自來水)。

1.4 實(shí)驗(yàn)原理

1.4.1 連續(xù)流動(dòng)分析原理

試樣與相關(guān)試劑由蠕動(dòng)泵推動(dòng)進(jìn)入泵管后連續(xù)流動(dòng),在流動(dòng)過程中被特定形態(tài)的氣泡按一定間隔規(guī)律地隔開,然后進(jìn)入在線蒸餾器,被蒸餾出的揮發(fā)酚流入反應(yīng)模塊中與試劑按固定的順序和比例混合、反應(yīng)。反應(yīng)完成后進(jìn)入流動(dòng)檢測(cè)池進(jìn)行吸光度檢測(cè)。

1.4.2 化學(xué)原理

樣品在酸性條件下通過在線蒸餾釋放出酚。被蒸餾出的酚類化合物在pH值(10±0.2)弱堿性介質(zhì)中,被鐵氰化鉀氧化,與 4-氨基安替比林反應(yīng)生成橙紅色的安替比林化合物,在505 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.4.3 樣品分析步驟及儀器參數(shù)設(shè)定

樣品分析步驟: 首先打開冷卻循環(huán)水,再依次打開比色計(jì)、蒸餾器、蠕動(dòng)泵、進(jìn)樣器等的電源開關(guān)。在蒸餾浴達(dá)到相應(yīng)溫度后(揮發(fā)酚為145 ℃),蓋好泵壓盤并運(yùn)行。啟動(dòng)控制軟件控制軟件名稱,激活檢測(cè)通道窗口并運(yùn)行分析方法。其次,待通道窗口基線穩(wěn)定后,開始測(cè)定樣品。

儀器參數(shù)設(shè)定: 設(shè)置進(jìn)樣速率為30個(gè)/h,進(jìn)樣清洗比為3∶1,氣泡注入速率2個(gè)/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 4-氨基安替吡啉顯示劑的選擇

2.1.1 試劑純度的選擇

方法中4-氨基安替吡啉作為顯示劑,容易被空氣氧化變質(zhì)。藥品純度是影響基線穩(wěn)定的重要因素[22]。采用某國產(chǎn)品牌優(yōu)級(jí)純?cè)噭?、分析純?cè)噭┖湍尺M(jìn)口品牌試劑進(jìn)行測(cè)試,發(fā)現(xiàn)某國產(chǎn)品牌分析純?cè)噭┡渲频耐瑵舛热芤侯伾绕鋬?yōu)級(jí)純?cè)噭┖湍尺M(jìn)口品牌試劑配制的溶液深。使用某國產(chǎn)品牌分析純?cè)噭┳鳛轱@色劑時(shí),儀器基線很高,一直不穩(wěn)定。而使用某國產(chǎn)品牌優(yōu)級(jí)純?cè)噭┖湍尺M(jìn)口品牌溶液作為顯色劑時(shí),儀器基線平穩(wěn),基線值低,因此建議選用某進(jìn)口品牌的試劑或優(yōu)級(jí)純?cè)噭┳鳛轱@色劑。

2.1.2 濃度的選擇

在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下,配制濃度分別為0.5、0.7、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0和3.0 g/L的4 -氨基安替吡啉溶液,測(cè)定50.0 μg/L苯酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,結(jié)果如圖1所示。結(jié)果表明:隨著4-氨基安替吡啉溶液的濃度不斷增大,揮發(fā)酚的響應(yīng)峰高不斷升高,當(dāng)溶液濃度達(dá)到1.2 g/L時(shí),揮發(fā)酚的響應(yīng)峰高達(dá)到最高,當(dāng)濃度繼續(xù)增大,反應(yīng)效率反而降低,可能是高濃度的4-氨基安替吡啉對(duì)反應(yīng)造成了干擾[23]。因此,4-氨基安替吡啉溶液的最佳選擇濃度為1.2 g/L。

圖1 4-氨基安替比林濃度與揮發(fā)酚的響應(yīng)關(guān)系Fig.1 Response relationship between 4-aminoantipyrine concentration and volatile phenol

2.2 鹽度干擾加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

在測(cè)定實(shí)際樣品時(shí),水樣的鹽度為0.07‰～3.71‰。為驗(yàn)證鹽度對(duì)方法的影響程度,本研究對(duì)6種不同鹽度梯度的樣品按照 5.0 μg/L、10.0 μg/L、50.0 μg/L這3種加標(biāo)濃度加標(biāo)。結(jié)果表明,加標(biāo)5.0 μg/L樣品回收率為93.4%～98.4%,加標(biāo)10.0 μg/L樣品回收率為94.5%～98.2%,加標(biāo)50.0 μg/L樣品回收率為90.6%～98.4%。不同鹽度下,樣品對(duì)3種不同質(zhì)量濃度加標(biāo)量的回收率均滿足SC/T 9102.1—2007《漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)范 第1部分: 總則》[24]中回收率為70%～120%和GB17378.2—2007《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范 第2部分:數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制》[25]中回收率為60%～110%的容許值要求,加標(biāo)回收率結(jié)果如表1所示。

表1 不同鹽度下樣品回收率的測(cè)定Tab.1 Determination of sample recovery under different salinity

2.3 水樣保存劑的選擇

水樣一般存在余氯等氧化劑,使用合適的保存劑能很好抑制水樣及水樣各組分可能發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。本研究參考《水質(zhì)樣品的保存和管理技術(shù)規(guī)定》(HJ493—2009)[26],選擇不同濃度的抗壞血酸溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(表2)。結(jié)果表明:使用1.0 g/L的抗血酸溶液,加標(biāo)樣品揮發(fā)酚的回收率在80%左右,而使用2.5和5.0 g/L的抗壞血酸溶液預(yù)處理的加標(biāo)水樣揮發(fā)酚回收率都在90%以上。但在實(shí)驗(yàn)過程中,使用5.0 g/L抗壞血酸溶液預(yù)處理的水樣在儀器運(yùn)行時(shí),基線不穩(wěn),需儀器平衡20 min以上才能平穩(wěn),因此本研究中采用2.5 g/L的抗壞血酸溶液作為保存劑去除余氯等氧化劑,這與馮奮棟等[27]的研究結(jié)果一致。加入磷酸酸化使樣品pH≤2(若加硫酸具有氧化性,加鹽酸具有還原性),將水溫降低可抑制微生物對(duì)其分解和減慢氧化作用。

表2 不同抗壞血酸溶液濃度保存下樣品回收率的測(cè)定Tab.2 Determination of sample recovery under different concentrations of ascorbic acid solution

2.4 線性范圍、檢出限及測(cè)定下限

配制揮發(fā)酚的工作曲線濃度分別為0.000、0.002、0.005、0.010、0.050和0.100 mg/L,使用連續(xù)流動(dòng)分析儀進(jìn)行測(cè)定,以峰高(x)為縱坐標(biāo)、濃度(y)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求出相關(guān)系數(shù)和線性范圍(圖2)。曲線方程為y=0.000 003x-0.018 1,相關(guān)系數(shù)為0.999 9。揮發(fā)酚在 0～0.100 mg/L范圍內(nèi)具有很好的線性。

圖2 揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of volatile phenols

方法檢出限MDL計(jì)算公式[29]:

MDL=t(n-1,α=0.99)×S

式(1)

式中:t(n-1,α=0.99)是當(dāng)自由度為n-1,置信度為99%時(shí),單邊t檢驗(yàn)情況下的t值,查表可得;S為重復(fù)測(cè)n次得到的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

本試驗(yàn)對(duì)5.00 μg/L揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行7次測(cè)定,S值為0.31 μg/L,查表得出t(n-1,α=0.99)=3.14,計(jì)算得到方法的檢出限為0.97 μg/L,測(cè)定下限為3.9 μg/L。此檢出限比(HJ503—2009)水質(zhì)揮發(fā)酚測(cè)定4-氨基安替比林分光光度法中萃取分光光度法的檢出限0.000 3 mg/L高,但比直接分光光度法的檢出限0.01 mg/L低。其能夠滿足GB 3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》、GB 5749—2006《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》和GB 11607—1989《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》方法限值的要求。

2.5 精密度和準(zhǔn)確度

在養(yǎng)殖魚塘水、自來水樣品中,加入揮發(fā)酚標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)水平分別為10.0、50.0和100.0 μg/L,每水平做6個(gè)平行樣品。測(cè)定結(jié)果顯示,水樣加標(biāo)回收率都在96.2%以上,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.1%以下,具體回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表3 加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.3 Recoveries and RSD of volatile phenols n=6

2.6 方法比較

用HJ 503—2009 (4-氨基安替比林分光光度法)和連續(xù)流動(dòng)注射分析法對(duì)樣品進(jìn)行分析,樣品分別取魚塘水、流溪河、自來水不同介質(zhì)進(jìn)行加標(biāo),添加濃度為50.0 μg/L,同時(shí)添加環(huán)境質(zhì)控樣品[GSB 07-3180-2014,批號(hào) 200350,標(biāo)準(zhǔn)值(40.2±2.7)μg/L]進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明兩種方法的數(shù)據(jù)結(jié)果相近,同時(shí)也證明連續(xù)流動(dòng)注射分析儀測(cè)定水中揮發(fā)酚是可行的(表4)。從兩種方法的工作效率對(duì)比,連續(xù)流動(dòng)注射分析法分析每個(gè)樣品僅需2 min,而采用4-氨基安替比林分光光度法則需要45 min,這與陳滿香等[28]研究的一致。4-氨基安替比林分光光度法在前處理過程中需要用到氯仿萃取,所用的試劑對(duì)人體健康和生態(tài)環(huán)境造成較大危害,而連續(xù)流動(dòng)注射分析法不需要,該法顯著優(yōu)于4-氨基安替比林分光光度法。

表4 2種方法測(cè)定揮發(fā)酚含量的對(duì)比試驗(yàn)Tab.4 A comparative test of two methods for the determination of volatile phenol content

2.7 實(shí)際樣品應(yīng)用

將采集到的306個(gè)廣州市魚塘水、25個(gè)溪流河水和1個(gè)自來水進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果均為未檢出。為驗(yàn)證方法的可靠性,同時(shí)采用水質(zhì)揮發(fā)酚國家環(huán)境質(zhì)控樣(GSB 07-3180-2014,批號(hào) 200350)進(jìn)行測(cè)定,測(cè)得其濃度為 41.0 μg/L,符合標(biāo)準(zhǔn)值(40.2±2.7)μg/L,說明結(jié)果可靠。

2.8 本方法優(yōu)勢(shì)

連續(xù)流動(dòng)分析法測(cè)定水中揮發(fā)酚的整個(gè)檢測(cè)過程都集中在密閉的管道系統(tǒng)中,所有試液都通過高精度蠕動(dòng)泵泵進(jìn)系統(tǒng)。實(shí)現(xiàn)了樣品前處理、顯色反應(yīng)、檢測(cè)過程及數(shù)據(jù)處理等過程的自動(dòng)化,避免了繁瑣的蒸餾、萃取操作,有效地解放了人力,顯著提高了檢測(cè)效率,并且大幅減少了三氯甲烷等有毒有害化學(xué)試劑對(duì)檢驗(yàn)人員和環(huán)境的危害,同時(shí)解決了因人工操作等人為不確定因素導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果重現(xiàn)性、平行性差的問題。該方法能夠滿足大批量水樣的檢測(cè)需求。

3 結(jié)論

通過本研究確定了連續(xù)流動(dòng)分析法快速測(cè)定水中揮發(fā)酚的最佳條件。在此條件下測(cè)定水中揮發(fā)酚,揮發(fā)酚的質(zhì)量濃度在0～0.100 mg/L內(nèi)具有良好的線性,該方法檢出限為0.97 μg/L,方法的精密度優(yōu)良,回收率在96.2%以上。結(jié)果表明該方法具有快速簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、自動(dòng)化在線分析、適用于大批量樣品檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。