張楊,張兵,李凱華,徐媛原,張微,肖曼,吳丹,張玲

(深圳市質量安全檢驗檢測研究院,廣東 深圳518055)

羅非魚(Oreochromsmossambcus)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Perciformes)、慈鯛科(Cichlidae)、羅非魚屬(Tilapia),原產自非洲,又名非洲鯽魚,有600多個品種。羅非魚是雜食性的魚類,對環(huán)境的適應能力強,其肌肉間無刺,而且肉質細膩,是世界性的水產養(yǎng)殖魚類,也是全球推廣的蛋白質來源品種[1-2]。在羅非魚的生長發(fā)育過程中,雄性羅非魚的生長速率更快。雌性羅非魚自然繁殖周期短,每隔12至25天可繁殖一次,大量的能量消耗影響其生長速度、養(yǎng)殖密度和成魚規(guī)格[3]。在養(yǎng)殖生產中,為了提高養(yǎng)殖產量和效益,常采用單雄性的養(yǎng)殖方法。通過羅非魚苗種性別調控來獲得全雄性苗種的方法主要有種間雜交、性激素誘導和三系配套技術。種間雜交法,受親本純度和環(huán)境因素影響大,雜交后代均勻度低;三系配套技術受限于超雄魚的育種而影響推廣;性激素誘導羅非魚育苗雄性化在養(yǎng)殖生產中被廣泛采用[3-4]。用甲基睪酮來提高雄性率的處理方法包括注射、伴餌投喂和養(yǎng)殖水加藥浸泡等,其中投喂和浸泡是生產上使用較多的方法[5]。除了用于育苗增產,也可通過甲基睪酮進行性逆轉來避免魚塘中羅非魚的過度繁殖[5]。

甲基睪酮(17α-Methyltestosterone)化學式為C20H30O2,是一種合成類固醇,也稱為甲睪酮、甲基睪丸酮等,屬于雄激素和蛋白同化激素,兼具雄性化與促進肌肉生長的作用,在水產育種和養(yǎng)殖過程中常被使用[6-8]。由于同化激素能改善飼料轉化效率,提高經濟效益,上世紀50年代開始被大量使用在食品動物養(yǎng)殖中,而殘留在動物體內的外源性激素會通過食物鏈進入人體,長期食用含有同化激素的動物組織會給人體帶來健康風險。甲基睪酮殘留對人體的影響是慢性可累積的,長期積累會影響人體內自然激素平衡,可能造成激素調節(jié)的相關身體機能發(fā)生紊亂[9-11],如女性出現(xiàn)多毛、閉經等癥狀。有研究表明,在養(yǎng)殖生產過程中羅非魚停用甲基睪酮后,其代謝周期符合指數(shù)遞減規(guī)律,但是在一定代謝周期內,其殘留仍能被檢測到[12]。歐盟在上世紀90年代針對出口到歐盟的動物源性產品發(fā)布相關指令,規(guī)定禁止使用雄激素、孕激素、促甲狀腺素和beta-激動劑等藥物飼養(yǎng)動物或養(yǎng)殖水產品。中國發(fā)布的NY 5071—2002《無公害食品 漁用藥物使用準則》中也早已規(guī)定不得在水產品養(yǎng)殖中使用甲基睪酮等激素。為了更好地規(guī)范水產養(yǎng)殖中的藥物使用,保障食品安全,現(xiàn)行的《中華人民共和國農業(yè)農村部公告 第250號》也明確規(guī)定食品動物中禁止使用甲基睪酮,并不得在所有可食性組織中檢出。

中國羅非魚的養(yǎng)殖產量約占全球總產量的一半[9]。羅非魚是中國優(yōu)勢出口水產品,也是居民日常消費的重要水產品,其質量安全受到高度關注。外源性激素殘留水平高可能對消費者造成潛在危害,對羅非魚中甲基睪酮殘留量的檢測非常必要[13]。目前,國內甲基睪酮檢測的標準方法有GB 31656.14—2022[14]、GB/T 21981—2008[15]、農業(yè)部1031號公告—1—2008[16]、SN/T 3235—2012[17]、SN/T 2443—2010[18]、SC/T 3029—2006[19]等。羅非魚中甲基睪酮的測定一般采用液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質譜法。在日常檢測中發(fā)現(xiàn),甲基睪酮殘留量的檢測受基質影響較大、檢測結果重復性差,且前處理提取和凈化過程均耗時較長、試劑消耗大。本研究在標準方法的基礎上,優(yōu)化了前處理過程、質譜和色譜儀器條件、對比了不同成分QuEChERS分散吸附劑的凈化提取效果,經陽性質控樣品驗證,建立了快速靈敏的檢測方法,大幅縮短了檢測時長,適用于大批量實際樣品的檢測,以期節(jié)省人力物力成本,更為簡便、高效地定量檢測甲基睪酮殘留量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲基睪酮(17-alpha-Methyltestosterone,純度(97.41±0.41)%,CAS No. 58-18-4,德國Dr. Ehernstorfer公司);甲基睪酮-D3(Methyltestosterone-D3,純度(99.0±0.2)%,CAS No. 96425-03-5,WITEGA 公司)。

試驗用水為符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水;甲醇、乙腈(色譜純,德國MERCK公司);乙酸銨(色譜級,≥99.0%,Aladdin上海公司);甲酸[色譜純97%,阿法埃莎(中國)化學有限公司];有機濾膜(0.22 μm,PTFE,上海安譜公司);色譜柱(BEH C181.7 μm,ACQUITY UPLC,Waters 公司);QuEChERS凈化提取劑組分(PSA、石墨化炭、C18、MgSO4,Agilent Technologies公司)。

實驗用羅非魚來源于深圳市水產品零售市場。陽性質控樣品分別購自壇墨質檢標準物質中心、河南標準物質研發(fā)中心。

1.2 儀器與設備

Agilent 1290 超高效液相色譜儀、配有電噴霧(ESI)離子源的AB Sciex Triple Quad TM 5500 質譜儀(美國AB Sciex公司);OA-SYS 24位自動水浴氮吹儀(Organomation公司);BSA2202S-CW型電子天平(Sartorius科學儀器(北京)有限公司);Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質器(美國OMNI公司);MTV-100型多管旋渦混合儀(杭州奧盛儀器有限公司);3-30ks冷凍高速離心機(Sigma公司)。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 制樣

試樣制備過程參照GB/T 21981—2008《動物源食品中激素多殘留檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法》進行優(yōu)化,將羅非魚去頭、骨、內臟,取肌肉等可食部分,切成不大于1 cm×1 cm×1 cm的小塊,絞碎混勻再充分勻漿,制成試樣備用。

1.3.2 提取

準確稱取羅非魚勻漿試樣2.50 g(精確至0.01 g)于30 mL研磨管中,準確加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內標工作溶液50 μL,渦旋混合60 s,加入5 g 規(guī)格為2.8 mm的陶瓷研磨珠和10 mL 1%甲酸-乙腈溶液(甲酸/乙腈,1∶99,V/V),用Bead Ruptor Elite多功能生物樣品均質器以3 m/s的均質速度,均質震蕩30 s,以6 000 r/min轉速離心5 min,轉移全部的上清提取液于另一潔凈的帶蓋聚丙烯離心管中,待凈化。

1.3.3 凈化

將QuEChERS凈化劑以下簡稱Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4)加入上述提取液中,旋緊螺旋蓋,用多管旋渦混合儀以2 000 r/min,渦旋混合1 min,以9 000 r/min轉速離心5 min。吸取4 mL上清有機相溶液,于45 ℃水浴氮吹至近干。準確加入1.0 mL 10%乙腈-水溶液(乙腈/水,10∶90,V/V)溶解殘渣,渦旋振蕩溶解殘留物,0.22 μm濾膜過濾至1 mL玻璃進樣瓶,待測。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

色譜柱:BEH C18(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:5.0 μL;流速:0.30 mL/min;流動相A為0.1%甲酸水溶液;流動相B為甲醇。流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient Elution Conditions

1.4.2 質譜條件

電離方式:電噴霧離子源(ESI),正離子模式;掃描檢測方式:多反應監(jiān)測(Multiple reaction monitoring, MRM);電噴霧電壓:5 500 V;離子源溫度:550 ℃;氣簾氣壓力:35.0 psi;碰撞氣壓力:9 psi;霧化器壓力:55.0 psi;輔助加熱器壓力:55.0 psi。定性離子對、定量離子對、去簇電壓及碰撞能量參數(shù)見表2。

表2 MRM掃描模式的參數(shù)Tab.2 Parameters of MRM

1.5 標準曲線

分別取10、20、50、100、200、500 μL濃度0.1 μg/mL的甲基睪酮外標工作溶液于玻璃離心管中,分別加入0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內標工作溶液50 μL,氮氣吹干,加入步驟1.3處理所得的基質空白溶液1mL,混合1min,配制成濃度為1～50 ng/mL系列基質匹配標準工作液,經超高效液相色譜串聯(lián)質譜儀測定,以甲基睪酮特征離子色譜峰的峰面積與內標物甲基睪酮-D3特征色譜峰的峰面積比值為縱坐標、相應的濃度為橫坐標,繪制標準工作曲線。

1.6 方法驗證

按照SN/T 5326.2—2020《進出口食品化妝品專業(yè)分析方法驗證指南 第2部分 化學方法》中5.2方法性能參數(shù)的驗證章節(jié)中的方法,評估方法靈敏度[20]。驗證程序采用概率統(tǒng)計法,當被檢測目標物質甲基睪酮在羅非魚樣品基質中被可靠檢出的概率達到95%以上時的濃度水平做為檢測方法對于該樣品基質的檢出限。方法定量限滿足大于3倍檢出限或其信噪比大于等于10。

取已知陰性羅非魚肉樣品2.50 g,分別添加25、50、250 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮外標工作液和50 μL濃度為0.1 μg/mL甲基睪酮-D3內標工作溶液,制得含量分別為1.00、2.00和10.00 μg/kg的3個濃度水平的加標樣品,每個濃度進行6個平行樣品的加標回收實驗,按1.3的方法進行處理并定量分析,根據(jù)檢測結果計算加標回收率及相對標準偏差。

將魚粉中甲基睪酮的質控樣品的接受參考值作為約定真值,按照本實驗方法處理過程進行定量測定,分別檢測10個平行樣品,對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,檢測結果用于方法的驗證。

2 結果與分析

2.1 方法優(yōu)化

2.1.1 檢測方法的選擇

液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質譜法和氣相色譜串聯(lián)質譜法是類固醇激素檢測的常用分析方法[21-22]。但氣質法的前處理過程常需要進行衍生化,過程復雜且耗時。超高效液相色譜串聯(lián)質譜法的選擇性、特異性和靈敏度比液相色譜法更高,并減少了溶劑消耗、縮短了分析時間,被越來越多地使用于檢測復雜基質中的痕量物質[22]。國家標準方法中激素殘留的檢測也多采用液質法。

2.1.2 提取劑的選擇

液質法檢測激素殘留常用的試劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。GB 31656.14—2022[14]采用乙酸乙酯提取;GB/T 21981—2008[15]采用酶解后甲醇提取;農業(yè)部1031號公告—1—2008[16]采用叔丁基甲醚提取;SN/T 3235—2012[17]和SN/T 2443—2010[18]采用乙腈提取。本研究在空白羅非魚試樣中添加內標和外標工作液制成10.0 μg/kg的甲基睪酮添加樣品,用于方法的優(yōu)化。對甲醇、乙酸乙酯、乙腈、1%甲酸-乙腈溶液和5%甲酸-乙腈溶液5種提取溶劑進行對比試驗,結果表明這5種溶劑提取甲基睪酮的平均回收率相近,提取效率均較高(圖1),試驗結果與聶建榮等[23]甲基睪酮殘留提取的研究結果一致。

圖1 不同提取劑對目標物的回收率影響Fig.1 The effect of different extractants on the recovery rate of the target substance

不同溶劑對不同激素的提取效率不同,甲醇對多種雌激素的提取回收好,乙酸乙酯對部分雄激素和孕激素的提取效率高[24-26],乙腈對部分雄激素、孕激素和雌激素的提取回收率都較高[24]。在多類激素同時提取時,也有使用這3種提取劑的組合來達到更高的綜合提取效率[25]。試驗結果表明,在使用乙酸乙酯作為提取劑時,甲基睪酮的平均回收率略低于其他提取劑,提取過程中較多的油脂被一同提取出來,氮吹后管內有大量黃色的油脂殘存。甲醇提取的平均回收率偏高,為107.5%,相對標準偏差2.5%。上機檢測發(fā)現(xiàn)甲醇和乙酸乙酯在提取過程中出現(xiàn)了較多的基質干擾成分,相鄰的雜峰較多,基質干擾峰面積大(圖2)。使用乙腈或不同濃度酸化乙腈提取時的基質干擾小,回收率相近,1%酸化乙腈的內標和外標的離子相應值高于乙腈和5%酸化乙腈提取的甲基睪酮內外標離子響應值,所以選擇1%酸化乙腈作為本方法的提取試劑。

圖2 不同提取劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.2 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different extractants

2.1.3 凈化方式的選擇

在激素殘留的檢測中,常通過比較不同的提取凈化方式來優(yōu)化前處理方法,減小基質干擾的影響[27-28]。激素殘留常用有機溶劑渦旋或超聲的方式提取,液液萃取、分散固相萃取或固相萃取的方法來凈化除雜[22]。固相萃取法需要的有機溶劑量也較少,可以在過柱的過程中清理去除大部分雜質,從而減少基質干擾。但使用固相萃取柱凈化的步驟,通常需要進行活化、淋洗、洗脫等操作[29-30]。GB 31656.14—2022和GB/T 21981—2008都是經過大量溶劑提取后,進一步經旋轉蒸發(fā)濃縮再溶解,而后過柱凈化,整個前處理過程耗時長,且旋轉蒸發(fā)儀能同時處理樣品的數(shù)量少,不能滿足多批量樣品的檢測需求。

利用溶劑渦旋提取和QuEChERS法的研究可以高效率的完成激素殘留處理。QuEChERS法采用在鹽溶液的存在下以水溶性溶劑萃取,促進液相分離,再以分散性吸附劑與提取物混合來促進清除基質干擾。本研究對比了Q1(100 mg PSA、50 mg C18、50 mg石墨化炭,600 mg MgSO4),Q2(100 mg PSA、600 mg MgSO4),Q3(150 mg PSA、900 mg MgSO4),Q4(100 mg C18),Q5(100 mg 石墨化炭)這5種吸附劑組合對甲基睪酮的回收提取效果(圖3)。多組分的分散性吸附劑Q1與不同含量PSA的Q2和Q3凈化回收率相近,高于C18和石墨化炭的凈化回收率。Q2與Q3的色譜圖上的基質干擾峰相同,并沒有隨著PSA含量的增加而減小基質干擾。C18和石墨化炭色譜圖的離子響應值都低于其他吸附劑,約為6.0×104(圖4)。實驗結果表明,單一的分散性吸附劑的凈化效果不充分,多種分散吸附劑組合可以達到更好的凈化效果。所以選擇Q1組分的QuEChERS吸附劑用于凈化除雜。

圖3 不同吸附劑對目標物的回收率影響Fig.3 The effect of different adsorbents on the recovery rate of the target substance

圖4 不同吸附劑的甲基睪酮定量離子色譜圖Fig.4 Quantitative ion chromatograms of methyltestosterone using different adsorbents

2.1.4 其他因素

魚肉中激素的測定多受基質干擾影響[31-32]。SN/T 3235—2012和SN/T 2443—2010標準方法中的甲基睪酮定量方法采用外標法。為了不受實驗條件穩(wěn)定性變化影響,本方法使用內標法定量。同時,方法也對氮吹溫度35、40和45 ℃進行對比,測得加標回收率相近,精密度相似,結果表明甲基睪酮在這3種溫度下較穩(wěn)定,皆可用于氮吹,45 ℃時氮吹所用的時間最少。

2.2 標準工作曲線

按照1.5的方法繪制基質標準工作曲線,得到線性回歸方程及相關系數(shù)(圖5),表明在1～50 ng/mL的線性范圍內,待測物甲基睪酮的線性關系良好。

圖5 甲基睪酮標準工作曲線Fig.5 Standard working curve of methyltestosterone

2.3 方法檢出限與定量限

按照1.6進行方法學驗證。采用標準添加法進行檢測,得到0.30 μg/kg作為參考濃度,以1倍該濃度為參考檢出限(LODR)的6個標準添加樣品經統(tǒng)計檢測結果并計算標準偏差SD為0.05,以LODR-3SD、LODR、LODR+3SD三個濃度水平分別檢測20個標準添加樣品,剛好有19個樣品能被有效檢出的濃度作為方法的檢出限。經驗證,確定甲基睪酮殘留檢測方法的檢出限為0.30 μg/kg,定量限大于3倍檢出限為1.0 μg/kg。方法檢出限驗證數(shù)據(jù)見表3。

表3 方法檢出限驗證數(shù)據(jù)Tab.3 Validation data for the detection limit in method n=20

2.4 回收率和精密度

向空白羅非魚樣品中添加3個濃度水平甲基睪酮的加標回收實驗(n=6),按照前面的處理的方法和條件進行測定,計算每個濃度水平的平均回收率及其相對標準偏差,實驗結果見表4。本方法的平均回收率為98.3%～103.0%,相對標準偏差為4.2%～8.8%。

表4 加標回收和精密度實驗結果Tab.4 Standard recovery rate and precision test results n=6

2.5 陽性樣品驗證

將魚粉中甲基睪酮質控樣品用于本方法的驗證。按照魚粉質控樣品分析證書中的說明,在空氣濕度≤40%,室溫約25 ℃的環(huán)境下準確稱量質控干粉0.5 g(精確至0.000 1 g),加入蒸餾水2.0 mL使其恢復為2.5 g的魚肉濕樣進行檢測。2種陽性質控分析魚粉均稱取10個平行樣品用于測定,檢測結果見表5。試驗表明,本方法的檢測結果符合魚粉中甲基睪酮質控樣品分析證書中給出的標準值擴展不確定度范圍,檢測結果可靠,本方法可用于魚肉中甲基睪酮殘留量的測定。

表5 陽性樣品實驗結果Tab. 5 Positive sample test results n=10

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定羅非魚中甲基睪酮殘留量的方法。對樣品制備、質譜條件、提取溶劑、凈化方式等參數(shù)進行優(yōu)化,采用基質加標的方法建立標準工作曲線,內標法定量數(shù)據(jù)分析。經測定,甲基睪酮濃度在1～50 ng/mL的范圍內線性關系良好,相關系數(shù)為0.999 5。方法檢出限為0.30 μg/kg,定量限為1.0 μg/kg。方法的前處理步驟操作簡單,大大縮短了前處理所需時長,提高了檢測效率,且方法檢出限低、準確度和精密度高,能滿足羅非魚中甲基睪酮殘留量檢測要求,為相關部門開展針對羅非魚中甲基睪酮殘留量的監(jiān)測提供參考方法。