張永國(guó), 劉 婕, 邵曉冬, 高艷紅, 鄒德莉

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;2.沈陽藥科大學(xué) 藥劑實(shí)驗(yàn)中心,遼寧 沈陽 110016

叉頭框轉(zhuǎn)錄因子(forkhead box,FOX)C1隸屬于叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族,在多種生理和病理過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。FOXC1基因突變常與神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛、腎等發(fā)育異常相關(guān)[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn),FOXC1在多種腫瘤中表達(dá)異常增高,且與患者不良預(yù)后相關(guān)[3-5]。FOXC1有望成為新的腫瘤分子標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。結(jié)腸癌是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[6-13]。近年來,結(jié)腸癌的早期內(nèi)鏡診治、免疫治療、靶向治療取得了可觀進(jìn)展,改善了結(jié)腸癌患者的預(yù)后,但是,我國(guó)仍有不少結(jié)腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬晚期[14]。本研究采用免疫組化染色的方法觀察了FOXC1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況,探討分析了FOXC1的表達(dá)水平與性別、年齡、組織學(xué)分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤部位等臨床參數(shù)之間的相關(guān)性,旨在闡明FOXC1在結(jié)腸癌中的表達(dá)特點(diǎn)及潛在的臨床價(jià)值。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 收集北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院自2009年1月至2010年6月收治的150例確診結(jié)腸癌患者的病理組織切片。通過EMR系統(tǒng)調(diào)閱病歷獲取相關(guān)的臨床病理學(xué)數(shù)據(jù)資料,電話隨訪獲取患者的生存狀態(tài)和生存時(shí)間。150例患者中,男性102例,女性48例;高、中、低分化腺癌分別為33例、80例、37例;TNM分期Ⅰ和Ⅱ期72例,Ⅲ和Ⅳ期為78例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78例。患者及其家屬均簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及材料 FOXC1單克隆抗體購自abcam公司;SP免疫組化試劑盒、防脫掛膠玻片、蘇木素染色液、DAB試劑盒、中性樹膠購自中杉金橋生物公司;光學(xué)顯微鏡為奧林巴斯(Olympus)公司。

1.3 免疫組化染色及評(píng)分 病理組織切片放置于烤片機(jī)60℃烤片30 min后,依次進(jìn)行二甲苯脫蠟、梯度乙醇(濃度梯度依次為100%、100%、95%、85%、75%)水化;病理組織切片滴加0.3%過氧化氫溶液后室溫下放置30 min滅活內(nèi)源性過氧化酶,隨后于檸檬酸鹽溶液中煮沸2 min行抗原修復(fù);滴加一抗FOXC1抗體(濃度1∶100)放置于4℃冰箱中過夜,復(fù)溫30 min后滴加二抗于室溫下孵育放置30 min,采用DAB試劑顯色,蘇木精復(fù)染,滴加少許中性樹膠蓋玻片封片,顯微鏡下觀察結(jié)果[15]。病理組織切片經(jīng)2名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行閱片評(píng)分:(1)染色強(qiáng)度。無陽性染色評(píng)為0分;淺黃色評(píng)為1分;深黃色評(píng)為3分;介于淺黃色和深黃色之間評(píng)為2分。(2)陽性細(xì)胞數(shù)比率。無陽性細(xì)胞著色評(píng)為0分;1%～25%、26%～50%、51%～75%、大于75%的細(xì)胞陽性著色分別評(píng)為1、2、3、4分。最終評(píng)分為染色強(qiáng)度和染色陽性細(xì)胞數(shù)比率兩者的評(píng)分相乘,陰性(-,0分)、弱陽性(+,1～6分)、強(qiáng)陽性(++,7～12分)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。采用方差分析(ANOVA)統(tǒng)計(jì)分析FOXC1在結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異;采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)和Mann-Whitney U檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性;采用Kaplan-Meier和COX回歸統(tǒng)計(jì)分析FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXC1在結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異 在結(jié)腸癌組織的細(xì)胞核和細(xì)胞漿中,FOXC1呈淺黃色或深黃色著色。見圖1。在納入的150例患者的結(jié)腸癌組織中,112例(74.7%)FOXC1染色呈陽性;而在相應(yīng)癌旁組織中,僅有34例(22.7%)FOXC1染色呈陽性。FOXC1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率高于相應(yīng)癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 FOXC1在結(jié)腸癌組織和相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異(200倍)

2.2 FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性 與TNM分期Ⅰ和Ⅱ期比較,Ⅲ和Ⅳ期的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05);與高分化比較,低分化、中分化的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05);與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05)。FOXC1表達(dá)水平與TNM分期、組織學(xué)分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)。見表1。

表1 FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者臨床參數(shù)之間的相關(guān)性/例(百分率/%)

2.3 FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性 電話隨訪患者的生存狀態(tài)和生存時(shí)間,隨訪5年后,98例患者死于結(jié)腸癌及腫瘤相關(guān)并發(fā)癥,5年總體存活率為34.7%(52/150),中位生存期為34個(gè)月。分層分析后發(fā)現(xiàn),FOXC1(-)、FOXC1(+)、FOXC1(++)患者的5年存活率分別為52.9%、35.4%、25.0%,中位生存期分別為60、34、20個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線顯示,FOXC1表達(dá)水平越高的結(jié)腸癌患者,病死率越高,總體存活率越低,生存期越短(P<0.05)。見圖2。COX回歸分析顯示,FOXC1在結(jié)腸癌患者中的表達(dá)水平與存活率密切相關(guān)(危險(xiǎn)比2.84,95%可信區(qū)間1.61～4.59,P<0.05)。見表2。

表2 FOXC1表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性

圖2 FOXC1表達(dá)與結(jié)腸癌患者生存預(yù)后之間的相關(guān)性Kaplan-Meier曲線

3 討論

結(jié)腸癌是發(fā)病率和病死率均較高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤[16-17]。隨著臨床內(nèi)鏡技術(shù)、靶向藥物、免疫藥物的不斷發(fā)展研發(fā),結(jié)腸癌的治療效果取得了很大的進(jìn)步,較大程度地改善了結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后。但由于國(guó)民健康意識(shí)普及不強(qiáng)、城鄉(xiāng)醫(yī)療水平差距較大等因素,我國(guó)仍有不少結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已屬中晚期[14,17]。有研究報(bào)道,一些基因分子的變化修飾可以更準(zhǔn)確地反映腫瘤特性,預(yù)測(cè)患者的生存預(yù)后,指導(dǎo)腫瘤的靶向和免疫治療[18]。

FOX是生物界一種高度保守的、極其重要的轉(zhuǎn)錄因子,不但擁有高度保守的DNA結(jié)合區(qū)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū),還擁有磷酸化區(qū)域、核定位信號(hào)區(qū)域等結(jié)構(gòu)。FOXC1是FOX家族的重要成員之一,編碼基因位于人類染色體6p25.3,結(jié)構(gòu)包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、氨基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、羧基端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域及轉(zhuǎn)錄抑制結(jié)構(gòu)域[19]。有研究報(bào)道,FOXC1在胰腺癌、原發(fā)性肝癌、乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)異常,其可影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移[1,20]。本研究中,FOXC1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)陽性率高于相應(yīng)癌旁組織(74.7%比22.7%),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這表明,FOXC1在結(jié)腸癌中異常高表達(dá),提示FOXC1可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。

FOXC1通過調(diào)節(jié)一系列靶基因的表達(dá)參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。有學(xué)者發(fā)現(xiàn),FOXC1主要通過促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶家族表達(dá)等多種分子機(jī)制促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[21-23]。FOXC1在原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌中通過上調(diào)snail的表達(dá)、下調(diào)E-cadherin的表達(dá)來促進(jìn)肝癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的侵襲能力及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[5,19,24]。本研究結(jié)果顯示:與TNM分期Ⅰ和Ⅱ期比較,Ⅲ和Ⅳ期的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05);與高分化比較,低分化、中分化的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05);與未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比較,發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的FOXC1表達(dá)水平更高(P<0.05)。這提示,FOXC1在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,其可影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述,FOXC1在結(jié)腸癌中高表達(dá)且與患者的生存預(yù)后密切相關(guān),其可作為預(yù)測(cè)結(jié)腸癌生存預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。