楊 新, 劉志新, 劉 嬌, 楊 卓, 安 娜

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 內(nèi)窺鏡科,遼寧 沈陽(yáng) 110016

肝癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤[1-12]。2021年世界癌癥報(bào)告顯示,肝癌是全球癌癥相關(guān)的主要死因之一[13]。肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要病理類型,起病隱匿且易轉(zhuǎn)移,患者整體預(yù)后極差。甲狀旁腺激素樣激素(parathyroid hormone like hormone,PTHLH)是腫瘤產(chǎn)生的一種分泌因子,可導(dǎo)致副腫瘤性高鈣血癥[14-15],其參與多種細(xì)胞過(guò)程,包括細(xì)胞內(nèi)鈣的調(diào)節(jié)、增殖/肥大、分化等[16-17]。PTHLH在肺癌、乳腺癌、頭頸部癌、淋巴瘤、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中均表達(dá)上調(diào),參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段[18-24]。本研究旨在探討PTHLH與肝細(xì)胞癌免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性,以及其對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取及表達(dá)分析 從癌癥基因組圖譜Cancer Genome Atlas(TCGA,https://portal.gdc.cancer.gov)和基因型組織表達(dá)Genotype-Tissue Expression(GTEx,https://www.gtexportal.org)中下載數(shù)據(jù),使用UCSC Xena(https://xena.ucsc.edu)進(jìn)行分析。通過(guò)合并TCGA和GTEx訪問(wèn)的正常組織數(shù)據(jù)探索PTHLH在肝細(xì)胞癌與正常樣本之間的差異表達(dá)。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件和公開(kāi)的Rpackage“ggplot2”繪制方框圖來(lái)評(píng)估差異表達(dá)水平。蛋白表達(dá)的免疫組化染色來(lái)自于HPA數(shù)據(jù)庫(kù)?；颊呱媲€Kaplan-Meier曲線來(lái)自Kaplan-Meier Plotter(https://kmplot.com/analysis/)。

1.2 列線圖模型的建立及評(píng)價(jià) 根據(jù)患者的臨床特征和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分建立列線圖,獨(dú)立預(yù)測(cè)肝癌的預(yù)后。應(yīng)用校準(zhǔn)曲線分析評(píng)估預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果之間的一致性,應(yīng)用一致性指數(shù)(C指數(shù))評(píng)估列線圖的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。使用R軟件包RMS生成列線圖和校準(zhǔn)圖。

1.3 免疫浸潤(rùn)分析 肝細(xì)胞癌患者的免疫浸潤(rùn)情況提取自TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫(kù),使用R軟件處理。

1.4 相關(guān)基因分析 利用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)分析與PTHLH表達(dá)相關(guān)的基因,gene symbol處輸入PTHLH,腫瘤類型選擇肝細(xì)胞癌,點(diǎn)擊correlation檢索。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用Log2轉(zhuǎn)化對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化。采用R軟件(4.0版)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用兩組t檢驗(yàn)比較正常組織和癌癥組織。采用Kaplan-Meier曲線、對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)、Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行生存分析。采用Spearman或Pearson相關(guān)分析評(píng)估變量之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTHLH的表達(dá)水平及其與肝細(xì)胞癌臨床特征的關(guān)系 基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn),PTHLH在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織(P<0.05)(圖1a),進(jìn)一步在相同患者的肝細(xì)胞癌組織和正常組織中配對(duì)比較得到了驗(yàn)證(圖1b);在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中,PTHLH的免疫組化染色存在一樣的表達(dá)差異,提示PTHLH蛋白水平的表達(dá)也在肝細(xì)胞癌中升高(圖1c)。生存分析發(fā)現(xiàn),PTHLH高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存期具有差異(P<0.05)(圖2a),提示PTHLH基因高表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān);PTHLH高表達(dá)組和低表達(dá)組在性別、T分期、病理分期、甲胎蛋白水平方面均存在顯著差異(P<0.05),而在年齡、N分期方面無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖2b～g)。

圖1 PTHLH在正常和肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)差異(a.正常肝細(xì)胞組織和肝細(xì)胞癌組織中PTHLH表達(dá)的差異;b.相同患者的肝細(xì)胞癌和癌旁組織樣本中PTHLH表達(dá)的配對(duì)差異;c.PTHLH在肝細(xì)胞癌和正常組織中的免疫組化結(jié)果,200倍)

圖2 PTHLH的表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌臨床特征的關(guān)系(a.Kaplan-Meier曲線顯示PTHLH的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者總生存期的關(guān)系;b～g.PTHLH的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者性別、T分期、N分期、病理分期、年齡、甲胎蛋白水平的關(guān)系)

2.2 列線圖模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià) 基于Cox回歸分析的結(jié)果繪制列線圖進(jìn)行可視化呈現(xiàn),校準(zhǔn)曲線評(píng)估1、3、5年的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。結(jié)果表明,PTHLH對(duì)肝細(xì)胞癌的總存活期具有預(yù)后貢獻(xiàn),且顯示出良好的預(yù)測(cè)能力(圖3a)。1、3、5年總存活率的校準(zhǔn)曲線表明,列線圖模型在預(yù)測(cè)總生存期方面表現(xiàn)出很高的準(zhǔn)確性(圖3b)。

圖3 列線圖模型的構(gòu)建與評(píng)價(jià)(a.通過(guò)將PTHLH值和階段圖年齡、病理分期的單項(xiàng)得分相加得到總體得分,總分投影為預(yù)測(cè)的1、3、5年存活率;b.諾模圖用于評(píng)估1、3、5年存活率列線圖的校準(zhǔn)曲線)

2.3 PTHLH表達(dá)水平及肝細(xì)胞癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系 繪制肝癌中PTHLH表達(dá)水平與24種免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)豐度的棒棒糖圖,可見(jiàn)PTHLH的表達(dá)與其中的17種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān),與DC、Tgd、T17細(xì)胞呈負(fù)相關(guān),與NK CD56bright細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、TFH、Tem、Th2、T helper、iDC、Th1、T、NK、NK CD56dim、肥大細(xì)胞、aDC、B細(xì)胞呈正相關(guān)。進(jìn)一步檢測(cè)5種主要的免疫細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)PTHLH的表達(dá)水平與B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞,中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞豐度呈正相關(guān)。PTHLH與免疫細(xì)胞CD4+Th2細(xì)胞浸潤(rùn)的差異影響患者預(yù)后(P=0.024 1)。見(jiàn)圖4。

圖4 肝細(xì)胞癌中PTHLH表達(dá)與不同免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度的關(guān)系(a.PTHLH在肝細(xì)胞癌中表達(dá)水平與24種免疫細(xì)胞亞型浸潤(rùn)關(guān)系的棒棒糖圖;b.肝細(xì)胞癌中PTHLH表達(dá)和CD4+Th2細(xì)胞評(píng)分組合的總生存期分析;c.肝細(xì)胞癌中6種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平與PTHLH表達(dá)的相關(guān)性)

2.4 與PTHLH表達(dá)相關(guān)的基因 通過(guò)Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出前65個(gè)實(shí)驗(yàn)確定的與PTHLH相互作用的基因之間的網(wǎng)絡(luò)圖(圖5a)。在肝細(xì)胞癌基因相關(guān)系數(shù)中,DDX11最高,Pearson相關(guān)系數(shù)為0.88(P<0.001)(圖5b)。

圖5 肝細(xì)胞癌中PTHLH的相關(guān)基因(a.Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的肝細(xì)胞癌中前65個(gè)與PTHLH mRNA最相關(guān)的基因之間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖;b.肝細(xì)胞癌中PTHLH的表達(dá)與所篩選基因之間的相關(guān)分析熱圖)

3 討論

對(duì)PTHLH基因結(jié)構(gòu)的研究發(fā)現(xiàn),PTHLH通過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾等基因過(guò)程生成N端、中間區(qū)域或C端的成熟肽,通過(guò)自分泌/旁分泌方式與甲狀旁腺激素受體-1結(jié)合,以激活下游效應(yīng)物,如細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、蛋白激酶A、蛋白激酶C、AKT、細(xì)胞周期蛋白D1、RUNX和cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)錄因子[22-23,25-27]。PTHLH表達(dá)的上游驅(qū)動(dòng)因素包括通過(guò)SMAD轉(zhuǎn)錄因子發(fā)出信號(hào)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員[28-29]、通過(guò)成紅細(xì)胞轉(zhuǎn)化特異性轉(zhuǎn)錄因子發(fā)出的RAS家族成員[30-33],以及有絲分裂刺激,如表皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1[32-34]。TP63是胰腺導(dǎo)管腺癌鱗狀亞型中PTHLH表達(dá)的主要驅(qū)動(dòng)因素[35]。但關(guān)于PTHLH在肝細(xì)胞癌中的分子作用研究較少。為了確定PTHLH在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、臨床結(jié)局中的潛在作用及作用機(jī)制,本研究對(duì)TCGA肝細(xì)胞癌中的PTHLH進(jìn)行了分析。

本研究結(jié)果顯示:PTHLH在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平高于正常組織(P<0.05),PTHLH高表達(dá)組和低表達(dá)組的總生存期具有差異(P<0.05);PTHLH高表達(dá)組和低表達(dá)組在性別、T分期、病理分期、甲胎蛋白水平方面均存在顯著差異(P<0.05),而在年齡、N分期方面無(wú)明顯差異(P>0.05);列線圖及其校準(zhǔn)曲線顯示PTHLH對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后具有良好的預(yù)測(cè)能力。這些結(jié)果證實(shí),PTHLH作為評(píng)估肝細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果還顯示:PTHLH的表達(dá)與多種免疫細(xì)胞浸潤(rùn)豐度相關(guān),免疫細(xì)胞CD4+Th2細(xì)胞浸潤(rùn)的程度影響患者預(yù)后(P<0.05)。上述結(jié)果證實(shí)了PTHLH基因與肝細(xì)胞癌免疫微環(huán)境中的基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的相關(guān)性,PTHLH基因的表達(dá)影響了肝細(xì)胞癌的腫瘤微環(huán)境,其可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。本研究中,DDX11與PTHLH相關(guān)性最高,Pearson相關(guān)系數(shù)為0.88(P<0.001)。DDX11是一種DNA解旋酶,參與各種基因組維持途徑和姐妹染色單體凝聚力的建立,在多種腫瘤中發(fā)揮促癌作用[36]。有學(xué)者揭示了DDX11在肝細(xì)胞癌發(fā)病和進(jìn)展中的潛在作用[37-38],其通過(guò)激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[37]。

綜上所述,PTHLH在肝細(xì)胞癌組織中高表達(dá),其可作為肝細(xì)胞癌免疫和預(yù)后的生物標(biāo)志物,并可能成為潛在的肝細(xì)胞癌免疫治療的新靶點(diǎn)。