張夫永,石文,陳飛

(1.江蘇吉諾思美精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)科技有限公司,江蘇 南京 210038;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬腦科醫(yī)院檢驗(yàn)科,江蘇 南京 210029)

抑郁癥是一種常見(jiàn)的高發(fā)病率慢性精神疾病,復(fù)發(fā)率非常高,為威脅人類健康的主要疾病之一,隨著近年來(lái)人們生活節(jié)奏的加快及經(jīng)濟(jì)下行壓力,發(fā)病率在臨床上上升趨勢(shì)明顯,同時(shí),大多數(shù)患者病程遷延、病情波動(dòng)易復(fù)發(fā)需要持續(xù)規(guī)則的藥物治療以控制癥狀和預(yù)防復(fù)發(fā),對(duì)患者的家庭及所在的社會(huì)來(lái)說(shuō),容易造成長(zhǎng)期負(fù)擔(dān)[1]。氟西汀(Fluoxetine, FXT)屬于5-羥色胺再攝取抑制劑,對(duì)5-羥色胺再攝取的顯著性抑制,提高了其在突觸間隙的濃度,從而產(chǎn)生了抗抑郁的效果,而對(duì)單胺酶則不會(huì)起到抑制的作用,實(shí)際臨床上比較常用且效果較好,但需要注意長(zhǎng)期用藥帶來(lái)的不良反應(yīng),并且不能輕易停藥[2]。鑒于臨床實(shí)際應(yīng)用,容易出現(xiàn)耐藥,FXT與其他藥物常聯(lián)合使用。FXT在體內(nèi)可代謝為具有抗抑郁活性的去甲氟西汀(Norfluoxetine,N-FXT),治療參考濃度范圍為FXT與N-FXT之和,所以活性代謝產(chǎn)物的檢測(cè)也非常重要[3]。文法拉辛(Venlafaxine,VEN)屬于5-羥色胺和去甲腎上腺素雙重再攝取抑制劑,能夠同時(shí)阻斷去甲腎上腺素和5-羥色胺再攝取,提高突觸間隙5-羥色胺水平,從而實(shí)現(xiàn)抗抑郁效果,其安全性及患者的耐受性更高,具有高效的抗抑郁效果。VEN在體內(nèi)通過(guò)細(xì)胞色素 P450(CYP) 2D6 代謝為具有活性的O-去甲基文拉法辛(O-Desmethylvenlafaxine,O-VEN)。O-VEN為其有效的活性代謝產(chǎn)物之一,也具有抗抑郁的作用[4]。臨床研究顯示[1],VEN緩釋劑聯(lián)合鹽酸FXT治療男性抑郁癥患者臨床效果更佳,且可以改善患者的認(rèn)知功能和睡眠質(zhì)量,不良反應(yīng)較小,安全可靠。

近幾年發(fā)展起來(lái)的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜大大提高了靈敏度與特異性,在歐美發(fā)達(dá)國(guó)家得到廣泛應(yīng)用,在中國(guó)臨床檢測(cè)的應(yīng)用也越來(lái)越受到醫(yī)院的關(guān)注[5-6]。質(zhì)譜技術(shù)不同于常規(guī)檢測(cè)方法,利用電磁學(xué)原理,直接檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)本身,具有特異性好、靈敏度高、多指標(biāo)同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)?；谫|(zhì)譜技術(shù),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)體內(nèi)血藥濃度水平的準(zhǔn)確評(píng)估。本研究旨在通過(guò)HPLC-MS/MS,建立一種可快速同時(shí)測(cè)定人血清中FXT、VEN及其活性代謝產(chǎn)物濃度的方法,為臨床治療藥物監(jiān)測(cè)提供檢測(cè)手段,并初步應(yīng)用于臨床。

1 儀器與材料

1.1 試劑耗材

O-VEN,純度:98%,批號(hào):GC11570,FXT,純度98%,批號(hào):GC33715,VEN-d6,純度:98%,批號(hào)GC40205,FXT-d5,純度99%,批號(hào)GC50191,均購(gòu)自美國(guó)GLPBIO公司;O-VEN-d6,純度:98%,批號(hào):23Z299-T1,N-FXT-d5,純度:99%,批號(hào):23Z297-T1,購(gòu)自上海甄準(zhǔn)生物有限公司;鹽酸N-FXT,純度98.11%,批號(hào):G1267141,購(gòu)自英國(guó)LGC公司;VEN,純度99.62%,批號(hào):145231,購(gòu)自美國(guó)TargetMol Chemicals 公司。甲醇、甲酸,色譜純,德國(guó)默克公司;空白血清由南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京腦科醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科提供。

1.2 儀器設(shè)備

Thermo TSQ Endura 超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo公司);TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)(中國(guó)良友儀器公司);賽多利斯Quintix125D-1CN電子天平(德國(guó)Sartorius公司);可調(diào)式混勻儀VORTEX-1(山東博科集團(tuán))。

1.3 色譜條件

色譜柱:Phenomenex Kinetex Biphenyl (2.1 mm×50 mm,2.6 μm),流動(dòng)相為含0.1%甲酸和1 mmol/L甲酸銨的水(A)和甲醇(B),梯度洗脫,0～1.0 min,體積分析30%B,1.0～2.0 min,體積分析30%～95%B,2.0～3.5 min,體積分析95%B,3.5～4.0 min,體積分析95%～30%B,4.0～4.5 min,體積分析30%B,流速:0.4 mL/min,柱溫:45 ℃,進(jìn)樣量:5 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧電離,正離子MRM掃描模式,噴霧電壓:3 500 V;鞘氣流速:50;輔助氣流速:10;吹掃氣流速:1;毛細(xì)管溫度:300 ℃。各物質(zhì)的定量檢測(cè)離子對(duì)分別為m/z 310.2→m/z 44.5(FXT)、m/z 315.2→ m/z 44.5(FXT-D5)、m/z 296.2→ m/z 30.6 (N-FXT)、m/z 301.2→ m/z 30.6 (N-FXT-D5)、m/z 278.2→ m/z 58.4 (VEN)、m/z 284.3→ m/z 64.4 (VEN-D6)、m/z 264.2→m/z 58.4(O-VEN)、m/z 270.2→m/z 64.4(O-VEN-D6)。

1.5 對(duì)照品工作液制備

分別取VEN、O-VEN、FXT、N-FXT,對(duì)照品適量,精密稱定,以甲醇為溶劑,配制成 1 mg/mL儲(chǔ)備液,各儲(chǔ)備液按一定比例混合后,用50%甲醇水稀釋,得對(duì)照品工作液,質(zhì)量濃度如下,VEN分別為360,720,1 440,2 880,7 200,14 400,36 000 ng/mL,O-VEN分別為360,720,1 440,2 880,7 200,14 400,36 000 ng/mL,FXT分別為200,400,800,1 600,4 000,8 000,20 000 ng/mL,N-FXT分別為640,1 280,2 560,5 120,12 800,25 600,64 000 ng/mL。

1.6 內(nèi)標(biāo)工作液制備

分別精密稱取內(nèi)標(biāo)對(duì)照品,以甲醇為溶劑,配制成 1 mg/mL儲(chǔ)備液,按一定比例混合后,用甲醇稀釋,加入0.5%甲酸,得內(nèi)標(biāo)工作液,各物質(zhì)的內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為500 ng/mL。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液制備

取對(duì)照品工作液5 μL至7個(gè)1.5 mL EP管中,各加入95 μL空白血清,渦旋10 s,得標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液各100 μL。分析物在標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液中的質(zhì)量濃度如下,VEN分別為18,36,72,144,360,720,1 800 ng/mL,O-VEN分別為18,36,72,144,360,720,1 800 ng/mL,FXT分別為10,20,40,80,200,400,1 000 ng/mL,N-FXT分別為32,64,128,256,640,1 280,3 200 ng/mL。

1.8 血清樣品處理

取血清樣品50 μL至1.5 mL EP 管中,加入內(nèi)標(biāo)工作液150 μL,渦旋30 s,離心5 min,轉(zhuǎn)速12 000 r/min,吸取上清液,以純水稀釋一倍,作為待測(cè)液,準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

1.9 特異性和選擇性

分別取空白血清2份、添加最低濃度的對(duì)照品工作液的空白血清(即定量限濃度樣本)1份,按照血清樣品處理方法處理后檢測(cè),其中1份空白血清處理中不引入內(nèi)標(biāo)校正(即雙空白血清)。

1.10 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液7個(gè)濃度點(diǎn),按照血清樣品處理方法處理后檢測(cè)。以分析物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),分析物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行線性回歸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.11 精密度與回收率

取空白血清稀釋對(duì)照品工作液,分別配制低、中、高濃度加標(biāo)血清樣品各5份,使得VEN及O-VEN的血藥質(zhì)量濃度分別為45,180,1 350 ng/mL,FXT的血藥質(zhì)量濃度分別為2.5,100,750 ng/mL,N-FXT的血藥質(zhì)量濃度分別為80,320,2 400 ng/mL,按血清樣品處理方法處理,進(jìn)樣分析,連續(xù)測(cè)定3批,數(shù)據(jù)分析軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出各樣本質(zhì)量濃度,并進(jìn)一步計(jì)算批內(nèi)批間精密度和回收率?；厥章实挠?jì)算公式,見(jiàn)下列公式(1)。

(1)

式中:P為回收率;C1:加標(biāo)血清樣品質(zhì)量濃度均值;C2:空白樣本質(zhì)量濃度均值;C0:加入理論濃度。

1.12 穩(wěn)定性

制備低、高質(zhì)量濃度的血清質(zhì)控樣品,在預(yù)處理后以及在所處評(píng)價(jià)的條件存儲(chǔ)后,立即分析。分別考察在常溫避光放置24 h、-18 ℃凍存1個(gè)月、反復(fù)凍融4次,等條件下的穩(wěn)定性。

1.13 相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)

制備含目標(biāo)分析物的純?nèi)芤?、空白血清樣本以及二者等比例混合?分別處理后進(jìn)樣分析。通過(guò)三種基質(zhì)樣本中目標(biāo)分析物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比的偏差來(lái)衡量相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)。計(jì)算公式如下:

(2)

式中:x——加入目標(biāo)分析物的純?nèi)芤号c空白血清樣本體積比1∶1混合后測(cè)定待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比;

x1——空白血清樣本測(cè)定待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比均值;

x2——加入目標(biāo)分析物的純?nèi)芤褐写郎y(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比。

1.14 臨床樣本檢測(cè)

采集2023年6月份,南京腦科醫(yī)院,服用VEN的臨床抑郁癥患者樣本21例(男8例,女13例),服用FXT的臨床抑郁癥8例(男3例,女5例),檢測(cè)分析濃度分布情況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 特異性和選擇性

本方法中,VEN、O-VEN、FXT、N-FXT及其各自內(nèi)標(biāo),保留時(shí)間一致,VEN、O-VEN、FXT、N-FXT保留時(shí)間分別為,2.57,1.77,2.68,2.68 min,雙空白血清中不存在各分析物質(zhì)峰及內(nèi)標(biāo)峰,單空白血清(即處理中引入內(nèi)標(biāo)校正空白血清)中,內(nèi)標(biāo)對(duì)分析物質(zhì)的干擾峰響應(yīng),在定量限的20%以下,色譜圖,見(jiàn)圖1,可以認(rèn)為,分析物質(zhì)不受內(nèi)標(biāo)及內(nèi)源性物質(zhì)干擾,方法特異性和選擇性較好。

a-空白血清;b-空白血清+內(nèi)標(biāo);c-空白血清+內(nèi)標(biāo)+定量限濃度各藥物對(duì)照品。圖1 血清中VEN、O-VEN、FXT、N-FXT及其內(nèi)標(biāo)的HPLC-MS/MS色譜圖

2.2 特異性和選擇性

線性方程分別為Y=0.003 262X-0.002 105,r2=0.999 3(VEN);Y=0.001 77X-0.003 348,r2=0.999 8(O-VEN);Y=0.002 751X-0.009 02,r2=0.999 7(FXT);Y=0.003 071X-0.002 516,r2=0.998 6(N-FXT);擬合曲線如下圖2所示,各藥物FXT、N-FXT、VEN、O-VEN分別在10～1 000,32～3 200,18～1 800,18～1 800 ng/mL內(nèi)線性良好,定量限下限分別為10,32,18,18 ng/mL。

圖2 血清中VEN、O-VEN、FXT、N-FXT的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 精密度與回收率

本方法中,各分析物批內(nèi)批間精密度RSD均在15%以內(nèi),回收率85%～115%之間,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度、回收率和基質(zhì)效應(yīng)結(jié)果

2.4 穩(wěn)定性

血清樣本在常溫避光放置24 h、-18 ℃凍存1個(gè)月、反復(fù)凍融4次后,進(jìn)行處理,測(cè)得值準(zhǔn)確度也均在85%～115%之間,結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)

本方法中相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)均在20%以內(nèi),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 臨床樣本檢測(cè)

采集2023年6月份,南京腦科醫(yī)院,服用VEN的臨床抑郁癥患者樣本21例(男8例,女13例),VEN加O-VEN,結(jié)果平均(263.89±176.67) ng/mL[VEN平均(106.92±101.86)ng/mL;O-VEN結(jié)果平均(156.97±100.64) ng/mL;服用FXT的臨床抑郁癥8例(男3例,女5例),FXT加N-FXT結(jié)果平均(139.12±121.3) ng/mL[FXT平均(79.33±87.28)ng/mL;N-FXT結(jié)果平均(59.79±40.09) ng/mL。所有臨床樣本,VEN加O-VEN以及FXT加N-FXT總檢測(cè)結(jié)果的濃度分布情況見(jiàn)圖3。

圖3 患者樣本檢測(cè)濃度的分布范圍

3 結(jié)論

1)本研究建立了VEN、FXT及其主要活性代謝物O-VEN、N-FXT的血清中血藥濃度HPLC-MS/MS平臺(tái)檢測(cè)方法,可一針同時(shí)測(cè)定其準(zhǔn)確血藥濃度。

2)本研究方法已經(jīng)用于臨床服用VEN、FXT的患者的血藥濃度檢測(cè),連續(xù)檢測(cè)了2023年6月份,整一個(gè)月的樣本,目前的檢測(cè)結(jié)果均在本方法的線性范圍內(nèi),故而可以滿足臨床的檢測(cè)需求,但存在較大比例服藥患者血藥濃度超出有效治療范圍,尤其是FXT,有62.5%的服藥患者血藥濃度低于有效治療范圍下限,這意味著可能治療效果不佳或無(wú)效,而VEN有20%的服藥患者血藥濃度高于有效治療范圍上限,但低于藥物警戒濃度,這樣的檢測(cè)結(jié)果可能與人群的飲食生活習(xí)慣、個(gè)體代謝差異、患者用藥依從性差異以及藥物相互作用等有關(guān)[9],同時(shí),樣本量仍處于低水平,也會(huì)影響結(jié)果判定,未來(lái)希望擴(kuò)大樣本量,深入研究以上各因素對(duì)藥物濃度的影響。

3)有研究表明,針對(duì)抑郁癥患者,VEN與FXT聯(lián)合用藥,可發(fā)揮協(xié)同抗抑郁作用,尤其針對(duì)患者的認(rèn)知功能及睡眠質(zhì)量,有更好的臨床改善,副作用發(fā)生幾率較低[1,5,7];另一方面,它們的活性代謝產(chǎn)物亦有類似的抗抑郁活性,《神經(jīng)精神藥理學(xué)治療藥物監(jiān)測(cè)共識(shí)指南: 2017版》給出的治療參考濃度范圍為VEN、FXT與其各自的活性代謝產(chǎn)物濃度之和[1,3,6,8],故而本研究建立的快速同時(shí)測(cè)定人血清中FXT、VEN及其活性代謝產(chǎn)物濃度的方法,可為臨床精準(zhǔn)個(gè)性化治療監(jiān)測(cè)提供有利的支撐,有很好的臨床價(jià)值。