周亞梅,劉佳,王欣巧,馬世蓉

(重慶化工職業(yè)學(xué)院,重慶 401228)

脂肪酶(Lipase)亦稱三?；视退饷?因其具有較高的催化活性和選擇性被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥[1]、食品[2-3]、能源化工[4]、廢水處理[5]等工業(yè)領(lǐng)域。但游離脂肪穩(wěn)定性差,對(duì)所處的反應(yīng)環(huán)境尤為敏感,反應(yīng)后分離回收困難,重復(fù)利用性不高。為解決這一問(wèn)題,酶的固定化技術(shù)破繭而出,旨在增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。近年來(lái),以新型聚合物材料為載體,采用物理或化學(xué)的方法固定脂肪酶已成為酶固定工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。與游離酶相比,固定后的脂肪酶催化活性和立體選擇性提高,在催化酯水解、酯合成、酯交換、高聚物合成及立體異構(gòu)體拆分等有機(jī)合成反應(yīng)中優(yōu)勢(shì)明顯。

酯交換反應(yīng)是典型的可逆反應(yīng),利用脂肪酶催化酯交換反應(yīng),使用烯醇酯作為酰基供體,在合成長(zhǎng)鏈酯的過(guò)程中離去基團(tuán)互變異構(gòu)成乙醛,產(chǎn)物變化抑制逆向反應(yīng)。而且由于乙醛的易揮發(fā)性可以從反應(yīng)體系中進(jìn)行分離,從而使得反應(yīng)步驟不可逆,有利于反應(yīng)向生成產(chǎn)物的方向移動(dòng),反應(yīng)速率和收率明顯提高。但研究發(fā)現(xiàn),反應(yīng)過(guò)程中副產(chǎn)物乙醛的存在會(huì)對(duì)脂肪酶的活性造成一定的影響。乙醛易與脂肪酶表面上帶正電的賴氨酸殘基反應(yīng)生成Schiff堿,阻礙酶與底物的結(jié)合,從而使得酶活性鈍化甚至失活[6-10]。Han等人[11]將熒光假單胞菌脂肪酶(PFL)固定在經(jīng)戊二醛活化后的聚脲多孔材料上,得到固定脂肪酶。將此固定酶作為催化劑,用于(R,S)-1-苯乙醇外消旋化合物和乙酸乙烯酯的酯交換反應(yīng)對(duì)1-苯乙醇進(jìn)行手性拆分(圖1)。研究表明,隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),與不加乙醛的反應(yīng)體系相比,體系中乙醛存在的情況下,立體選擇性E值出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì),相對(duì)而言酶的催化活性降低程度較小。

圖1 (R,S)-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯的酯交換反應(yīng)

湘潭大學(xué)熊龍斌[12]就乙醛影響脂肪酶催化反應(yīng)的作用機(jī)制進(jìn)行了研究,提出了乙醛對(duì)脂肪酶活性具有抑制作用,主要以化學(xué)結(jié)合的方式作用于酯交換反應(yīng)。樊斌[13]通過(guò)酯交換反應(yīng),分析了乙醛對(duì)酶催化性能的影響,發(fā)現(xiàn)乙醛對(duì)酶促酯交換反應(yīng)的影響表現(xiàn)出低促高抑的Hormesis現(xiàn)象。在此基礎(chǔ)上,考察了副產(chǎn)物乙醛的存在對(duì)脂肪酶催化性能的影響,并給出了乙醛存在下固定酶的重復(fù)利用性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲苯二異氰酸酯(TDI),工業(yè)級(jí),北京科聚化學(xué)新材料有限公司;二乙烯三胺(DETA),分析純,山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司;(R,S)-1-苯乙醇,熒光假單胞菌脂肪酶(PFL),Sigma-Aldrich;正己烷和異丙醇,色譜純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;正辛烷,分析純,天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;乙腈和正庚烷(分析純),天津市富宇精細(xì)化工有限公司;異辛烷和乙酸乙烯酯(分析純),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙醛(>99.5%)和戊二醛(GA)均購(gòu)買于阿拉丁公司。

高效液相色譜儀(HPLC,美國(guó)Agilent 1260公司;OD-H手性柱,4.6 mm×250 mm,大賽璐藥物手性技術(shù)上海有限公司)。

1.2 脂肪酶(PFL)的固定

在250 mL圓底燒瓶中加入90 g乙腈作為反應(yīng)介質(zhì),在300 r/min的攪拌速率下以20 mL/h的速率滴加TDI (7.2 g),同時(shí)以10 mL/h的速率滴加DETA (2.8 g),恒溫水浴(30 ℃)中繼續(xù)反應(yīng)至24 h。對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行離心分離,置于60 ℃的真空干燥箱中烘干至恒重,得到白色粉末狀聚脲(PPU)。將1 g PPU超聲分散至30 mL GA溶液中,設(shè)置恒溫水浴振蕩器溫度為30 ℃,振頻為140 osc/min。反應(yīng)5 h后用超純水多次離心洗滌。將洗滌后的固體放入60 ℃的真空干燥箱干燥12 h,得到活化后的聚脲多孔材料(GA-PPU)。

稱取50 mg GA-PPU放入5 mL的血清瓶中,加入3 mL PFL溶液(pH值8.0),超聲分散均勻后在30 ℃的恒溫水浴振蕩器中以140 osc/min的振頻反應(yīng)5 h,完成后用緩沖溶液離心洗滌得到固定PFL脂肪酶,冷凍干燥后備用。

1.3 乙醛對(duì)固定PFL催化性能影響

以有機(jī)相為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L苯乙醇和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,并向其中加入0.2 mg固定酶和一定濃度的乙醛,同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)(相同條件下不加乙醛)。在既設(shè)定好條件的恒溫水浴振蕩器中反應(yīng)24 h。反應(yīng)過(guò)程中每隔一段時(shí)間取出0.2 mL反應(yīng)液,用正己烷稀釋至10 mL,由HPLC檢測(cè)濾液中底物1-PEOH和產(chǎn)物乙酸苯乙酯中R型和S型光學(xué)異構(gòu)體的含量。底物和產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值(ees、eep)、轉(zhuǎn)化率(C)、對(duì)映體選擇率(E)分別由Chen等人給出的公式[14]計(jì)算。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中改變加入的乙醛濃度、反應(yīng)溶劑、反應(yīng)溫度,研究副產(chǎn)物乙醛的存在對(duì)脂肪酶催化性能的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醛濃度對(duì)脂肪酶催化性能的影響

以正己烷為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L苯乙醇和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,并向其中加入0.2 mg固定PFL脂肪酶和一定濃度的乙醛。在0.006 mol/L至0.056 mol/L改變乙醛濃度,反應(yīng)溫度40 ℃下反應(yīng)24 h。同時(shí)做空白體系對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加乙醛),結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙醛濃度對(duì)eep和轉(zhuǎn)化率C的影響

從表1結(jié)果可以看出,與不加乙醛的反應(yīng)體系相比,乙醛的加入導(dǎo)致了酶的催化活性和立體選擇性下降。隨著乙醛濃度的增大,體系底物轉(zhuǎn)化率和酶的立體選擇性先增大后減小。當(dāng)加入的乙醛濃度增大為0.025 mol/L時(shí),底物轉(zhuǎn)化率由45.6%增至47.3%,對(duì)映體選擇率由129.3增至145.8。繼續(xù)增加乙醛濃度,體系轉(zhuǎn)化率C和E均有所下降。這表明低濃度乙醛可促進(jìn)酶的催化能力,高濃度乙醛則抑制酶的催化能力。這是因?yàn)橹久阜肿踊钚灾行纳戏酱嬖讦?螺旋結(jié)構(gòu),通常被稱之為“蓋子”。由于反應(yīng)過(guò)程中熱運(yùn)動(dòng)使得“蓋子”存在輕微的開(kāi)合運(yùn)動(dòng),而乙醛分子相對(duì)于酶分子較小,所以乙醛完全可以滲入酶分子內(nèi)部使得酶分子構(gòu)象更加舒展,柔性增加從而提高酶的活性。但乙醛濃度過(guò)高,滲入乙醛太多,酶的構(gòu)象變化太大反而會(huì)使得酶的活性降低[11,15]。此外,極性分子乙醛易與脂肪酶上某些帶電的基團(tuán)反應(yīng),如帶正電的賴氨酸殘基反應(yīng)生成Schiff堿,阻礙酶的活性中心與底物結(jié)合,從而導(dǎo)致脂肪酶活性下降[16,18]。因此選擇濃度為0.025 mol/L的乙醛進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 乙醛濃度對(duì)反應(yīng)體系E值的影響

2.2 乙醛存在下反應(yīng)溶劑對(duì)脂肪酶催化性能的影響

有機(jī)溶劑作為酶催化酯交換反應(yīng)的介質(zhì),在某種程度上影響酶的催化活性及立體選擇性,因此選擇一種合適的有機(jī)溶劑對(duì)于酯交換反應(yīng)尤為重要。固定反應(yīng)體系中加入的乙醛濃度為0.025 mol/L,其余反應(yīng)條件保持不變,改變反應(yīng)溶劑為異辛烷、正辛烷、正己烷、正庚烷。同時(shí)做空白體系對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加乙醛),結(jié)果如圖3所示。

圖3 乙醛存在下反應(yīng)溶劑對(duì)eep和轉(zhuǎn)化率C的影響

從表2給出的結(jié)果可以看出,在任何溶劑中,相同反應(yīng)條件下與不加乙醛的反應(yīng)體系相比,加入乙醛后的反應(yīng)體系中底物轉(zhuǎn)化率和立體選擇性均有所下降,表明乙醛的存在抑制了酶的催化活性和立體選擇性。相較而言,以異辛烷為溶劑,加入乙醛后體系中底物轉(zhuǎn)化率由47.0%下降至38.2%,E值由106.9降至66.3。以正辛烷和正庚烷為溶劑,乙醛存在下體系中底物轉(zhuǎn)化率下降幅度遠(yuǎn)小于異辛烷。以正己烷為溶劑,相較于空白對(duì)照組,底物轉(zhuǎn)化率只下降了0.3%。相同條件下底物轉(zhuǎn)化率C和立體選擇率E均高于其余體系。這表明有機(jī)溶劑的分子碳鏈越長(zhǎng)即疏水性越高(異辛烷>正辛烷>正庚烷>正己烷),乙醛對(duì)脂肪酶的抑制作用就越強(qiáng)。究其原因脂肪酶發(fā)揮其活性必須要維持其表面的必需水,而乙醛又屬于極性小分子,在疏水性強(qiáng)的溶劑中易影響底物或產(chǎn)物在有機(jī)相中的分配,更易剝奪脂肪酶表面的必需水,從而影響脂肪酶的催化活性和立體選擇性。另外,乙醛的存在還有可能改變構(gòu)成酶蛋白活性結(jié)構(gòu)的氫鍵,影響其活性構(gòu)型的疏水作用,進(jìn)而影響酶的催化[12]。因此,在乙醛存在的前提下,以正己烷作為反應(yīng)介質(zhì)可以使脂肪酶的催化活性受到的抑制最小。

表2 乙醛存在下反應(yīng)溶劑對(duì)反應(yīng)體系E值的影響

2.3 乙醛存在下反應(yīng)溫度對(duì)脂肪酶催化性能的影響

每一個(gè)生物催化反應(yīng)都有其一定的最適溫度的存在,溫度對(duì)酶催化反應(yīng)主要是影響其熱能和空間結(jié)構(gòu),酶的催化效率在這兩者之間保持一個(gè)平衡。固定反應(yīng)體系中加入的乙醛濃度為0.025 mol/L,以正己烷為溶劑,其余反應(yīng)條件保持不變,在10～50 ℃之間改變反應(yīng)溫度。同時(shí)做空白體系對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加乙醛),結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醛存在下反應(yīng)溫度對(duì)eep和轉(zhuǎn)化率C的影響

如表3結(jié)果所示,相同反應(yīng)溫度下,乙醛的存在降低了脂肪酶的催化活性和立體選擇性。10 ℃下底物轉(zhuǎn)化率由空白組的40.5%降低至5%,E值降低至7.9,產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值eep降低至76.7%。將溫度升高至20 ℃,底物轉(zhuǎn)化率由40.8%降低至18.4%,E值降低至85.7。繼續(xù)升高反應(yīng)溫度,可以看出底物轉(zhuǎn)化率下降幅度仍然有所減小。反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí),底物轉(zhuǎn)化率為47.3%,相較于空白組只降低了0.3%,E值為145.8。與其余體系相比,酶的催化活性和選擇性下降程度較低,這表明固定PFL脂肪酶在此溫度下催化活性和立體選擇性受到的抑制最小[18]?？梢钥闯鲈诳疾斓臏囟确秶鷥?nèi)酶的活性和立體選擇性明顯受到乙醛抑制。低溫階段,乙醛的抑制作用較明顯,隨著溫度的升高,抑制作用不斷減弱。這可能是因?yàn)橛捎跍囟鹊纳叱^(guò)了乙醛的沸點(diǎn),加速了乙醛的揮發(fā),從而緩解了乙醛引起的脂肪酶分子撓度下降,使得脂肪酶的構(gòu)象未遭到全部破壞[12]。

表3 乙醛存在下反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)體系E值的影響

2.4 乙醛存在下固定酶的重復(fù)利用性

為了考察乙醛對(duì)固定PFL酶的影響深度,固定乙醛的濃度為0.025 mol/L,以正己烷為溶劑,在25 mL比色管中加入2 mL濃度為0.25 mol/L的苯乙醇溶液和2 mL濃度為0.5 mol/L的乙酸乙烯酯溶液,以0.2 mg固定酶作為催化劑在反應(yīng)溫度40 ℃下催化酯交換反應(yīng)24 h。將反應(yīng)后的脂肪酶回收并用正己烷進(jìn)行洗滌,室溫干燥后繼續(xù)用于催化反應(yīng)。每次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中重新加入濃度為0.025 mol/L的乙醛,同時(shí)進(jìn)行空白體系對(duì)照實(shí)驗(yàn)(不加乙醛),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 乙醛存在下固定PFL的重復(fù)使用性

從表4中可以看出,與空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)相比,加入乙醛后脂肪酶的催化活性明顯下降,且隨著重復(fù)使用次數(shù)越多,抑制效果越明顯,底物轉(zhuǎn)化率和E值下降越快。該結(jié)果表明乙醛作用于脂肪酶活性的方式主要是化學(xué)結(jié)合,一旦乙醛與酶結(jié)合后便會(huì)持久的作用于每一次酯交換反應(yīng),致使酶的主鏈結(jié)構(gòu)、微環(huán)境發(fā)生改變,破壞酶分子活性中心結(jié)構(gòu),酶的催化性和對(duì)映體選擇性降低,這與熊[12]等人研究一致。

3 結(jié)論

酯交換反應(yīng)是工業(yè)中一類重要的化學(xué)反應(yīng),利用脂肪酶催化苯乙醇和乙酸乙烯酯酯交換反應(yīng),反應(yīng)過(guò)程中副產(chǎn)物乙烯醇互變異構(gòu)成乙醛,該物質(zhì)對(duì)脂肪酶的活性和選擇性具有抑制作用。以聚脲多孔材料為載體固定熒光假單胞菌脂肪酶,將此固定酶作為催化劑,用于1-苯乙醇外消旋化合物和乙酸乙烯酯的酯交換反應(yīng),探討了副產(chǎn)物乙醛的存在對(duì)脂肪酶性能的影響。結(jié)果表明,加入乙醛后脂肪酶的催化活性和選擇性受到明顯抑制。乙醛在不同有機(jī)溶劑體系中對(duì)脂肪酶酯交換反應(yīng)的催化活性有較大差異,對(duì)疏水性越高的有機(jī)溶劑體系的酶活抑制作用越強(qiáng);低溫階段乙醛對(duì)脂肪酶的抑制作用大于高溫階段。重復(fù)使用5次后,與第一次相比,相同的反應(yīng)時(shí)間下,體系轉(zhuǎn)化率下降至19.4%,對(duì)映體選擇率下降至26,表明體系中乙醛的存在使得脂肪酶的失活速率更明顯,這也證實(shí)了我們的猜想在脂肪酶催化酯交換反應(yīng)中,副產(chǎn)物乙醛會(huì)影響酶催化活性和對(duì)映體選擇性。