胡新夢,吳建麗,周芳,張強(qiáng),何江龍

(黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,河南 鄭州 450000)

山慈姑中藥材是干燥的蘭科植物獨(dú)蒜蘭Pleionebtdbocodioides(Franch)Rolef、杜鵑蘭Cremastraappendicutata(D.Don)Makino或云南獨(dú)蒜蘭PleioneyunnanensisRolfe的假鱗莖[1-2]。味甘微辛,歸肝經(jīng)脾[3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)經(jīng)過證實(shí),山慈菇能治療多種癌癥,常被用作基礎(chǔ)性的治療癌癥藥物,是一個治療癌癥的常用的藥物[4-5]。兩頭尖是干燥的毛茛科Ranunculaceae植物多被銀蓮花AnemoneraddeanaRegel的根莖,又名草烏喙[6]。兩頭尖中以三萜皂苷抗腫瘤、抗風(fēng)濕作用明顯,有很好的開發(fā)前景[7]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)還具有抗癌的作用功效,廣泛用于對惡性腫瘤的臨床治療[8]。藤梨根Actinidiaarguta(Sieb.&Zucc)Planch.exMiq.,是側(cè)膜胎座目,獼猴桃科獼猴桃的根[9]。《草藥土方》中記載有清熱散癤、祛風(fēng)健脾、利濕消腫、除痹化痰等功效;對風(fēng)濕痹痛消化道癌腫,癰瘍瘡癤等有良好效果,是我國特有的品種[10]。現(xiàn)代研究表明藤梨根對多種癌癥有明顯抗癌作用,抑制細(xì)胞增殖,激發(fā)細(xì)胞凋亡[11]。目前藤梨根在治療腫瘤方面的作用被醫(yī)學(xué)界重視關(guān)注,深入研究藤梨根有利于利用天然藥物資源開發(fā)新的藥物[12]。

中醫(yī)治療癌癥常將多種中藥材配伍熬制成湯藥給病人口服,為進(jìn)一步的抗腫瘤活性檢測提供理論依據(jù)和研究參考,現(xiàn)將三種藥材配伍后熬制進(jìn)行提取和簡單初步分離后用DPPH法對分離物質(zhì)進(jìn)行抗氧化活性檢測后對比[13-14],找出其抗氧化活性部位并進(jìn)行分析,并與單體抗氧化活性部位比較,為后續(xù)具體抗氧化活性物質(zhì)檢測和抗腫瘤活性研究做初步篩選并提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山慈菇、兩頭尖、藤梨根:均采自張仲景大藥房,洗凈,曬干,粉碎,過80目篩(篩孔孔徑0.178 mm),備用;DPPH、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、抗壞血酸:分析純;石油醚(沸點(diǎn):60～90 ℃);純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

FA1004型電子天平:上海良平儀表有限公司;XFB-200型搖擺式粉碎機(jī):吉首市中城制藥機(jī)械廠;2XZ-2真空干燥箱:北京中興偉業(yè)儀器有限公司;DF-101S旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:北京凱亞儀器有限公司;SB-1100恒溫水浴鍋;KQ-300V超聲波清洗儀;JH7230G型可見分光光度計(jì):上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 配伍中藥材及單一中藥材各成分的提取分離流程

稱取混合配伍藥材粉末47 g(含山慈菇藥材粉末12 g,藤梨根藥材粉末20 g,兩頭尖藥材粉末15 g),將稱量好的原料藥材粉末混合均勻后倒入250 mL圓底燒瓶,用150 mL的體積分?jǐn)?shù)95%EtOH進(jìn)行加熱回流,6 h后進(jìn)行過濾,提取兩次,合并濾液后將其置入旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器進(jìn)行加熱旋轉(zhuǎn),濃縮至浸膏狀[15]。之后將三種藥材混合提取液浸膏,溶于水中后,按由小至大的極性順序,依次用石油醚→氯仿→ACOEt→n-BuOH萃取3次后,得到五種層分(石油醚層、氯仿層、ACOEt層、n-BuOH層、水層)[16]。之后用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)儀濃縮,用真空干燥機(jī)制得干粉備用[17]。單一藥材藤梨根粉末47 g、兩頭尖粉末47 g以上述同一方法制成干粉備用。

1.3.2 試劑配制

取0.039 4 g DPPH,用EtOH溶液進(jìn)行快速溶解,定容于100 mL大的干燥棕色玻璃容量瓶中,制成1 mmol/L的無水DPPH乙醇溶液,避光冷藏保存,一周以內(nèi)使用完全,使用時用EtOH稀釋10倍使用,現(xiàn)用現(xiàn)配[18]。

1.3.3 陽性對照

取維生素C 的標(biāo)準(zhǔn)品0.020 2 g加水快速溶解定容,制成0.2 mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液,過后分別稀釋成0.000,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010 mg/mL的維生素C標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液,分別選擇10 mL和相同體積0.1 mmol/L無水 DPPH乙醇溶液振蕩混合搖勻后,于水浴30 ℃下等候30 min后,并在517 nm用無水乙醇為空白,測定吸光度值三次,求得吸光度平均值,計(jì)算維生素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液各濃度DPPH+清除率,以作為陽性對照[19-20]。

CLDPPH+=(Ab-As)/Ab×100%

第五，鞏固黨的群眾路線教育實(shí)踐活動的成效，廣泛開展精神文明創(chuàng)建和文化建設(shè)，落實(shí)中央八項(xiàng)規(guī)定，改進(jìn)作風(fēng)，力戒心浮氣躁，倡導(dǎo)腳踏實(shí)地、真抓實(shí)干；落實(shí)黨風(fēng)廉政建設(shè)責(zé)任制，嚴(yán)格干部管理；加學(xué)習(xí)黨組織建設(shè)，完善民主決策機(jī)制，充分發(fā)揚(yáng)黨內(nèi)民主，營造團(tuán)結(jié)干事的濃厚氛圍。

式中:CLDPPH+:DPPH+清除率;

Ab:空白樣品吸光度值;

As:樣品吸光度值。

1.3.4 樣品測定

分別稱取混合配伍藥材石油醚層、CHCl3層、ACOEt層、n-BuOH層、水層提取物各0.020 0 g,分別定容于100 mL容量瓶中,制成0.2 mg/mL的混合配伍藥材各層樣品溶液為母液,分別稀釋成0.000,0.002,0.004,0.006,0.008,0.010 mg/mL的溶液,各取10 mL和等體積0.1 mmol/L DPPH+無水乙醇溶液振蕩混合搖勻,于30 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min后,觀察色彩和顏色的反應(yīng)變化,同時以無水乙醇為空白,在517 nm處,測定吸光度值三次,求得吸光度平均值。建立顯示DPPH+清除率與混合配伍藥材各層溶液濃度之間的柱形圖。單一藥材提取物以同樣的方法進(jìn)行樣品的測定及觀察分析對比。

1.3.5 數(shù)據(jù)匯總分析

將各個相同藥材不同提取層分?jǐn)?shù)據(jù)匯總在一起進(jìn)行分析,篩選出單個藥材中抗氧化活性較強(qiáng)部位;將不同藥材同一層分?jǐn)?shù)據(jù)匯總在一起進(jìn)行分析,篩選出同一部位哪種藥材抗氧化活性較強(qiáng);并將單一藥材抗氧化活性同混合配伍藥材抗氧化活性數(shù)據(jù)對比,探究混合配伍是否能提高原藥材抗氧化活性。并給出篩選的抗氧化活性較強(qiáng)部位,供抗氧化具體活性成分研究和抗腫瘤活性測定研究。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種藥材各層成分不同濃度DPPH+清除率匯總

表1 三種藥材各成分不同質(zhì)量濃度DPPH+清除率匯總表

2.2 三種藥材石油醚層提取物的抗氧化活性對比分析

如圖1三種藥材石油醚提取物抗氧化活性分析圖所示,隨著石油醚提取物溶液濃度的不斷持續(xù)增加,藤梨根的石油醚層的提取物清除DPPH+自由基的能力也持續(xù)不斷地上升,但效果不明顯;兩頭尖的石油醚層的提取物清除DPPH+自由基的能力則持續(xù)不斷地呈逐漸下降的趨勢;而混合配伍藥材的石油醚提取物抗氧化活性逐漸增強(qiáng)且效果明顯。因此在三種藥材的石油醚提取物中抗氧化能力最強(qiáng)的是混合配伍藥材。

圖1 三種藥材石油醚提取物抗氧化活性分析圖

2.3 三種藥材氯仿層提取物抗氧化活性對比分析

如圖2所示,DPPH+自由基的消除能力隨著藤梨根CHCl3層的提取物溶液濃度的增加逐漸增強(qiáng),但效果不明顯;兩頭尖的氯仿提取物濃度較低時未表現(xiàn)出清除DPPH+自由基的抗氧化能力,當(dāng)濃度高時抗氧化能力明顯增強(qiáng);而混合的配伍藥材的CHCl3層的提取物對DPPH+自由基的消除能力相對于另外兩種較穩(wěn)定,但它的抗氧化能力不強(qiáng)。

圖2 三種藥材氯仿提取物抗氧化活性分析圖

2.4 三種藥材乙酸乙酯層的提取物抗氧化活性對比分析

如圖3所示,DPPH+自由基的去除能力伴隨著藤梨根的ACOEt層提取物溶液濃度的增加不斷地逐漸增強(qiáng),且增強(qiáng)的效果很明顯;DPPH+自由基的消除能力隨著兩頭尖的ACOEt層提取物濃度的增加也在逐漸持續(xù)不斷地增強(qiáng),呈快速上升趨勢,但同藤梨根和混合配伍藥材相比抗氧化能力較弱;混合配伍藥材的乙酸乙酯層提取物對DPPH+自由基的清除能力同樣呈上升趨勢,增強(qiáng)效果明顯高于單一藥材的乙酸乙酯提取物,其抗氧化能力高于藤梨根和兩頭尖。因此在三種藥材的乙酸乙酯提取物中抗氧化能力最強(qiáng)的是混合配伍藥材。

圖3 三種藥材乙酸乙酯提取物抗氧化活性分析圖

2.5 三種藥材n-BuOH層提取物抗氧化活性對比分析

如圖4所示,隨著正丁醇提取物濃度的進(jìn)一步不斷增加,藤梨根的n-BuOH提取物對DPPH+自由基的分解和去除能力逐漸提高,且其效果明顯;兩頭尖的n-BuOH提取物對DPPH+自由基的分解和清除能力也逐漸增強(qiáng),但與藤梨根和混合配伍的藥材相比,它的抗氧化能力較弱;混合的配伍中藥材的n-BuOH層的提取物質(zhì)對DPPH+自由基的去除能力呈現(xiàn)出明顯的持續(xù)上升趨勢,它的抗氧化能力高于藤梨根和兩頭尖。所以在三種藥材的n-BuOH提取物中抗氧化性能最好的是混合配伍藥材。

圖4 三種藥材正丁醇提取物抗氧化活性分析圖

2.6 三種藥材水層提取物抗氧化活性分析

如圖5所示,隨著三種藥材中水提取物濃度的進(jìn)一步增加,藤梨根的水提取物對DPPH+自由基的去除能力逐步增強(qiáng),但是效果不明顯;兩頭尖的水提取物對DPPH+自由基的清除能力一直為0,可以確定兩頭尖的水提取物不具有抗氧化的能力;混合的配伍藥材的水提物質(zhì)對DPPH+自由基的消除能力呈現(xiàn)出持續(xù)不斷上升趨勢但是效果不明顯,其抗氧化能力低于藤梨根。因此在三種藥材的水提取物中抗氧化能力最強(qiáng)的是藤梨根藥材。

圖5 三種藥材水提取物抗氧化活性分析圖

2.7 藤梨根藥材各部位提取物抗氧化活性分析

如圖6所示,隨著藤梨根各部位提取物濃度的提高,石油醚、CHCl3、ACOEt、n-BuOH、水五種層分的提取物均對DPPH+自由基的去除能力有所增強(qiáng),說明五種層分中均含有可以對抗氧化的物質(zhì),均具有提高抗氧化作用,通過圖6抗氧化作用濃度增長趨勢可以明顯地看出藤梨根的ACOEt提取物和n-BuOH提取物的抗氧化活性能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了其他層分的提取物,由此進(jìn)行分析,可以得出結(jié)論:藤梨根藥材的抗氧化活性部位為ACOEt部位和正丁醇部位。

圖6 藤梨根各部位提取物抗氧化活性分析圖

2.8 兩頭尖藥材各部位提取物抗氧化活性對比分析

如圖7所示,隨著兩頭尖各層次提取物濃度的持續(xù)不斷增加,石油醚、CHCl3、ACOEt、正丁醇、水五種不同層次成分的提取物對DPPH+自由基的去除分解能力均有所增強(qiáng)提高,說明四種層分中均含有抗氧化的物質(zhì),均具有抗氧化能力;但是兩頭尖的水層提取物隨著濃度的提高沒有表現(xiàn)出抗氧化的能力,其對DPPH+自由基的清除率一直為0%,因此可以確定兩頭尖藥材的水提取物不具有抗氧化的能力。通過圖7抗氧化增長趨勢可以明顯看出兩頭尖的ACOEt提取物和氯仿提取物對DPPH+自由基的抗氧化能力遠(yuǎn)高于其他層分的提取物,由此分析,可以得出結(jié)論:兩頭尖藥材的抗氧化活性部位為ACOEt部位和氯仿部位。

圖7 兩頭尖各部位提取物抗氧化活性分析圖

2.9 混合配伍藥材各部位提取物抗氧化活性分析

如圖8所示,隨著混合配伍藥材各部位提取物濃度的提高,石油醚、CHCl3、ACOEt、正丁醇、水五種不同層次成分的提取物對DPPH+自由基的消除能力均有所增強(qiáng),說明五種層分中均含有抗氧化的物質(zhì),均具有抗氧化能力,通過圖8抗氧化增長趨勢可以明顯看出混合配伍藥材的乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物的抗氧化能力遠(yuǎn)高于其他層分的提取物,由此分析,可以得出結(jié)論:混合配伍藥材的抗氧化活性部位為乙酸乙酯部位和正丁醇部位。

圖8 混合配伍藥材各部位提取物抗氧化活性分析圖

3 結(jié)論

山慈菇、兩頭尖、藤梨根三種中藥材古籍記載均具有消癰散結(jié)、清熱解毒等功效,近年臨床研究發(fā)現(xiàn)有抗癌的功效,但對這三種藥材研究相對較少,相關(guān)記載較為久遠(yuǎn),通過對藤梨根、兩頭尖活性部位的篩選鑒定,為以后充分開發(fā)該藥用植物提供理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)通過萃取和分離提取得藤梨根、兩頭尖及配伍混合藥材各個部位,對提取物用DPPH法進(jìn)行了抗氧化活性的初步篩選,篩選甄別結(jié)果表明:中藥材藤梨根的抗氧化活性部位主要分布在n-BuOH部位和ACOEt部位;中藥材兩頭尖的活性成分部位主要為ACOEt部位和氯仿部位;混合配伍藥材中的活性成分部位主要為ACOEt部位和n-BuOH部位,同陽性對照維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對比,混合藥材的乙酸乙酯層和正丁醇層分別在0.008 mg/mL和0.006 mg/mL質(zhì)量濃度下的抗氧化活性超過了陽性對照品。其中混合配伍藥材的乙酸乙酯層提取物、正丁醇層提取物;藤梨根藥材的乙酸乙酯層提取物、正丁醇層提取物這四部分提取物都出現(xiàn)了由紫色變?yōu)辄S色的過程,這說明這四種層分具有較強(qiáng)的抗氧化能力,這些部位中具體是何種活性物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。同時也有力地證明了中藥配伍可以提高藥物的活性。

本試驗(yàn)為后續(xù)研究這三種中草藥提取物及配伍提取物抗腫瘤活性與檢測縮小了篩選范圍同時也提供了前期必要的準(zhǔn)備和科學(xué)的參考依據(jù)。為發(fā)現(xiàn)、開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的抗癌新藥打下良好基礎(chǔ)。