冶 楠，張 珍，呂轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，杜建明，張生祥，李 蔚,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅省葡萄與葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心，甘肅 蘭州 730070）

香氣是衡量果實(shí)品質(zhì)非常重要的影響因素之一，其作為重要的次生代謝產(chǎn)物，賦予了果實(shí)獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[1]。有研究表明，按照前體物質(zhì)的不同，可將果實(shí)中香氣物質(zhì)的合成途徑分為脂肪酸代謝、氨基酸代謝和萜類(lèi)代謝3大途徑，脂肪酸代謝途徑又分為脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）代謝途徑和β-氧化途徑[2]。其中，葡萄果實(shí)中的芳香物質(zhì)主要是源自不飽和脂肪酸，經(jīng)LOX代謝途徑形成直鏈脂肪醇、醛、酮、酸和酯類(lèi)化合物[3-4]。

綠葉揮發(fā)物是不飽和脂肪酸亞麻酸及亞油酸通過(guò)LOX代謝途徑產(chǎn)生的C6/C9短鏈脂肪醛、醇和酯，主要以游離態(tài)形式存在，具有新鮮割草的獨(dú)特氣味[5]。綠葉揮發(fā)物作為葡萄和葡萄酒香氣品質(zhì)的重要組成部分，具有一定的品種依賴(lài)性[6]?！啐堉椤–abernet Gernischt）為我國(guó)篩選育成的釀造葡萄品種，具有綠葉草本香氣，適應(yīng)性強(qiáng)且著色良好[7-8]，但是在受到強(qiáng)光、高低溫及土壤水分過(guò)量等影響因素時(shí)，葡萄果實(shí)會(huì)著色不良，香氣成分嚴(yán)重受損[9-10]。解決這一問(wèn)題對(duì)提高果實(shí)品質(zhì)、保證釀酒質(zhì)量具有重要意義。前期研究發(fā)現(xiàn)葡萄栽培技術(shù)對(duì)生物活性化合物和揮發(fā)性成分的生成具有一定的影響[11]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）類(lèi)物質(zhì)是一種廣泛存在于植物體內(nèi)的新型植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，包括茉莉酸、MeJA、茉莉酸丙酯及其衍生物[12-13]。二氫茉莉酸甲酯（methyl dihydrojasmonate，MDJA）同屬M(fèi)eJA類(lèi)，由人工合成，與MeJA相比，有較好的化學(xué)穩(wěn)定性，生理效應(yīng)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)且易被植物吸收，同時(shí)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14-15]。有研究表明，MeJA作為一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性及次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成具有重要的調(diào)控作用，通過(guò)植物體內(nèi)類(lèi)黃酮、總酚、花色苷等次生代謝物含量的積累改善果實(shí)品質(zhì)，同時(shí)其對(duì)果實(shí)香氣調(diào)控等也有重要影響[16-18]。Li Jiaozhuo等[19]研究發(fā)現(xiàn)MeJA處理可通過(guò)調(diào)節(jié)糖苷酶改善番茄果實(shí)后熟品質(zhì)。此外，MeJA處理可能通過(guò)調(diào)節(jié)抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)和乙烯生物合成調(diào)節(jié)采后番茄果實(shí)品質(zhì)，特別是對(duì)香氣的有效改善[20]。目前，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑因具有價(jià)廉、低毒性、增效快、廣譜等優(yōu)點(diǎn)，已被普遍應(yīng)用于糧食、果蔬、林木等多個(gè)領(lǐng)域[21-22]，因此，研究其對(duì)葡萄品質(zhì)的提高具有重要的理論意義和應(yīng)用前景。

目前許多學(xué)者研究較多的是茉莉酸和MeJA，而對(duì)于MeJA類(lèi)似物MDJA的研究還鮮有報(bào)道，同時(shí)關(guān)于采前不同濃度MeJA和MDJA處理釀酒葡萄后對(duì)其果實(shí)中綠葉揮發(fā)物以及其代謝途徑的影響報(bào)道研究較少。因此，本實(shí)驗(yàn)在‘蛇龍珠’釀酒葡萄轉(zhuǎn)色初期對(duì)其葉面及整果進(jìn)行不同濃度的外源MeJA類(lèi)物質(zhì)噴施處理，通過(guò)測(cè)定葡萄果實(shí)基本品質(zhì)指標(biāo)，篩選最適濃度；并結(jié)合頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace solid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）技術(shù)，分析MeJA類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)的揮發(fā)性香氣物質(zhì)及關(guān)鍵酶活性，從而探究采前MeJA類(lèi)物質(zhì)處理對(duì)‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)品質(zhì)及次生代謝產(chǎn)物的影響，明確其調(diào)控果實(shí)特征香氣化合物的生物合成機(jī)理，為合理使用外源MeJA類(lèi)物質(zhì)提高釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試葡萄來(lái)自于甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)基地（103°70’E、36°09’N），海拔1 531 m，年平均日照時(shí)數(shù)2 446 h，年平均氣溫為8.9 ℃，年平均無(wú)霜期為180 d，年平均降水量為349.9 mm。該區(qū)試驗(yàn)田為南北行向的“Y”型架，選取樹(shù)齡12 a，嫁接于5BB砧木上的‘蛇龍珠’釀酒葡萄。

MDJA（≥98%，優(yōu)級(jí)純）合肥巴斯夫生物科技；吐溫-80、氯化鈉、無(wú)水乙醇 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVPP）、D-葡萄糖酸內(nèi)酯 上海源葉生物科技有限公司；福林-肖卡試液 廈門(mén)海標(biāo)科技有限公司；LOX、脂氫過(guò)氧化物裂解酶（hydroperoxidelyase，HPL）和醇脫氫酶（alcohol dehydrogenasea，ADH）活力檢測(cè)試劑盒上海之禮生物科技有限公司；己醛、1-己醇、反-2-己烯醛、順-3-己烯醇、乙酸乙酯、2-辛醇（均為標(biāo)準(zhǔn)品）、MeJA（≥95%，優(yōu)級(jí)純）美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TRACE1310-ISQ型氣相色譜-質(zhì)譜儀 美國(guó)Thermo Scientific公司；DK-S12型電熱恒溫水浴鍋 上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；H2050R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KQ-100E型超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SpectraMax i3x型酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 田間處理

該實(shí)驗(yàn)于2020年8月24日采樣于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄園，選取5 行長(zhǎng)勢(shì)基本一致的‘蛇龍珠’釀酒葡萄植株，每行選擇9 株葡萄，選擇時(shí)盡可能避免邊緣差異帶來(lái)的影響。

用體積分?jǐn)?shù)為0.0 1%的乙醇溶液溶解MeJA 和MDJA，加入0.1%吐溫-80制備MeJA和MDJA溶液。在轉(zhuǎn)色前期對(duì)葡萄整株進(jìn)行MeJA和MDJA溶液噴施處理，噴施濃度均為0.1、1、5、10 mmol/L，每組5 株葡萄，噴至藥液欲滴為止，每株噴施量約為200 mL[23-24]。對(duì)照組僅施用0.01%乙醇溶液和0.1%吐溫-80的混合水溶液[25-26]。MeJA處理后分別記為0.1E、1E、5E、10E；MDJA處理后分別記為0.1D、1D、5D、10D；對(duì)照以CK表示。

1.3.2 樣本采集

根據(jù)葡萄果實(shí)物候?qū)W與生長(zhǎng)周期[27]，本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)色初期至采收期分為4 個(gè)階段，分別記為E-L 35（漿果開(kāi)始著色并膨大，12 °Brix）；E-L 36（漿果白利糖度值達(dá)到中等值，轉(zhuǎn)色結(jié)束，14 °Brix）；E-L 37（漿果還未完全成熟，成熟中期，18 °Brix）；E-L 38（漿果成熟度達(dá)到采收要求，22 °Brix）。

采集樣品時(shí)，不同時(shí)期在每穗果實(shí)的上、中、下、內(nèi)、外各部位以及每行葡萄的陰陽(yáng)兩面進(jìn)行隨機(jī)采樣，同時(shí)確保果實(shí)的完整性。取葡萄漿果1 000 粒，其中200 粒立即去除果梗及果肉，稱(chēng)取1 g果皮用錫箔紙包封后放在液氮中持續(xù)2 min，取出，放在-80 ℃超低溫冰箱中用于分析果實(shí)中關(guān)鍵酶的活性，其余葡萄漿果用于理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣物質(zhì)含量的測(cè)定。

1.3.3 葡萄漿果基本理化指標(biāo)的測(cè)定

參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定果實(shí)百粒質(zhì)量、總糖質(zhì)量濃度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、可滴定酸質(zhì)量濃度和pH值等基本指標(biāo)。

1.3.4 葡萄皮總酚的提取及測(cè)定

果皮中總酚的提取采用福林-肖卡法測(cè)定[28]。稱(chēng)取1 g葡萄皮樣品加入10 mL鹽酸甲醇溶液（1 mol/L）中，避光提取24 h，離心，取上層清液待測(cè)。取經(jīng)稀釋10 倍后的樣液0.1 mL，與6 mL水、0.5 mL福林-肖卡標(biāo)準(zhǔn)液和1.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)17%的碳酸鈉溶液混勻后用水定容至10 mL，于20 ℃條件下水浴2 h，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于765 nm處比色，記錄吸光度?？偡雍恳悦靠烁蓸悠分袥](méi)食子酸質(zhì)量表示，單位為mg/g。

1.3.5 葡萄皮花色苷的提取及測(cè)定

采用pH值示差法。稱(chēng)取葡萄皮樣品1 g加入10 mL鹽酸甲醇溶液（1 mol/L）浸提振蕩2 h，取上清液，分別用pH 1.0的鹽酸-氯化鉀和pH 4.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液稀釋20 倍，在避光條件下反應(yīng)2 h后，使用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分別于520 nm和700 nm處比色，記錄吸光度差值，計(jì)算公式參照房玉林等[29]的方法。花色苷含量以每克樣品中錦葵色素-3-葡萄糖苷的含量計(jì)，單位為mg/g。

1.3.6 葡萄果實(shí)揮發(fā)性物質(zhì)的提取及測(cè)定

揮發(fā)性化合物的提取和測(cè)定[23]：將葡萄去梗去籽，稱(chēng)取5 g樣品，加入0.05 g PVPP、0.025 gD-葡萄糖酸內(nèi)酯、2 g NaCl、10 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇，81.06 mg/L）以及磁力攪拌轉(zhuǎn)子置于20 mL樣品瓶中。40 ℃條件下用恒溫水浴鍋磁力攪拌，萃取30 min，將活化的萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，40 ℃攪拌加熱條件下，繼續(xù)萃取30 min，然后將萃取頭插入氣相色譜的進(jìn)樣口，240 ℃解吸8 min。

氣相色譜-質(zhì)譜條件：采用不分流模式進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度240 ℃；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，然后以3 ℃/min的速度升至220 ℃，并在220 ℃保持15 min。記錄70 eV電子碰撞模式下m/z35～350范圍內(nèi)的質(zhì)譜檢索揮發(fā)性物質(zhì)。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制作：以空白基質(zhì)[30]（葡萄汁模擬液：7 g/L酒石酸、200 g/L葡萄糖）為溶劑，將各揮發(fā)性物質(zhì)成分標(biāo)準(zhǔn)品配成一定質(zhì)量濃度的單標(biāo)，取各單標(biāo)配成5 個(gè)質(zhì)量濃度梯度的混標(biāo)，分別將5 g空白基質(zhì)、10 μL混標(biāo)和2 g NaCl、磁力轉(zhuǎn)子加入到頂空瓶中。隨后在相同條件下進(jìn)行萃取和檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度梯度重復(fù)3 次。以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品峰面積為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

定性定量方法：將樣品檢測(cè)出的質(zhì)譜圖經(jīng)NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間對(duì)比定性，對(duì)有標(biāo)準(zhǔn)品的香氣化合物按照相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行定量，對(duì)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品的化合物使用2-辛醇（81.06 mg/L）進(jìn)行半定量法計(jì)算其化合物的質(zhì)量濃度。

1.3.7 脂肪酸途徑關(guān)鍵酶活力的測(cè)定

參考鞠延侖[31]和陳昆松[32]等的方法，略作修改。

提取緩沖液的制備：取1 mL Triton X-100和4 g PVPP與100 mL（0.1 mol/L，pH 6.8）磷酸緩沖液充分搖勻混合，置于4 ℃的冰箱中預(yù)冷。

粗酶液的提?。喝〔煌瑫r(shí)期處理的葡萄樣品，分別剝?nèi)? g葡萄皮置于研缽內(nèi)，在液氮下充分研磨后，加入1 mL相應(yīng)的提取緩沖液，4 ℃、10 000 r/min離心20 min，收集上清液，即為粗酶液。然后按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分別計(jì)算樣品中LOX、HPL及ADH活力。單位體積每克樣品每分鐘光密度值增加0.01為1 個(gè)酶活力單位（U/L）。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA和MDJA處理對(duì)葡萄果實(shí)理化指標(biāo)的影響

由圖1A可知，隨著葡萄果實(shí)的成熟，不同濃度的MeJA和MDJA噴施處理后葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量整體呈上升趨勢(shì)。采收期（E-L 38）時(shí)，0.1E與5D處理組葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量顯著高于其他處理（P＜0.05），分別比CK組提高了10.24%和9.15%。值得注意的是，采收期時(shí)，10E處理組果實(shí)百粒質(zhì)量相比于0.1E及5D處理組明顯降低，分別下降了29.73%、26.03%，這可能是由于高濃度劑量噴施使果實(shí)產(chǎn)生“縮果”現(xiàn)象，有研究表明合理使用激素可提高釀酒葡萄果實(shí)產(chǎn)量[33]，激素帶來(lái)的“雙重效應(yīng)”會(huì)導(dǎo)致果實(shí)質(zhì)量下降，產(chǎn)量減少。

圖1 不同濃度MeJA和MDJA處理對(duì)葡萄果實(shí)基本理化品質(zhì)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of MeJA and MDJA on the basic physicochemical quality of grape fruits

不同處理下葡萄果實(shí)可滴定酸質(zhì)量濃度整體呈下降趨勢(shì)（圖1B）。其中，1D、5E和10E處理后其總酸含量較其他處理組高。在采收期（E-L 38）時(shí)，5D、10D與0.1E處理后果實(shí)可滴定酸質(zhì)量濃度與CK組相比分別降低了30.24%、22.93%和40.0%。這一結(jié)果說(shuō)明，較適濃度的MeJA類(lèi)物質(zhì)處理可以降低果實(shí)酸含量，改善果實(shí)品質(zhì)。

由圖1C可知，隨著葡萄果實(shí)的成熟，不同濃度的MeJA和MDJA噴施處理組果實(shí)總糖質(zhì)量濃度整體上升。果實(shí)在采收期（E-L 38）時(shí)，0.1E與5D處理后其總糖質(zhì)量濃度顯著高于其他處理組（P＜0.05），且分別比CK組提高了27.83%和24.01%，10E處理次之。

果實(shí)pH值整體呈現(xiàn)緩慢的上升趨勢(shì)（圖1D），且各處理間的差異顯著（P＜0.05）。采收期（E-L 38）時(shí)，5D、10D處理組與0.1E處理組pH值顯著高于其他處理組（P＜0.05），且分別比CK組高8.30%、5.56%和4.80%。

整體來(lái)看，不同處理組果實(shí)可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異顯著（P＜0.05），隨著葡萄果實(shí)成熟度的增加，其可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸升高（圖1E）。采收期（E-L 38）時(shí)，5D處理組與0.1E處理組果實(shí)的可溶性固形物顯著高于其他處理組（P＜0.05），相比于CK組分別提高了24.41%和28.24%。

酚類(lèi)化合物是葡萄果皮中重要的次生代謝產(chǎn)物，也是影響葡萄酒色澤、口感和香氣物質(zhì)釋放的重要因素，主要通過(guò)苯丙烷代謝和類(lèi)黃酮代謝途徑產(chǎn)生，能夠防止維生素流失和氧化損傷等[34-35]。由圖1F可看出，從E-L 35到E-L 38時(shí)期，不同濃度MeJA和MDJA處理后葡萄果實(shí)中總酚含量均顯著高于CK組（P＜0.05）。采收期（E-L 38）時(shí)，0.1E處理組果實(shí)總酚含量最多，比CK處理提高了77.63%，其次為5D處理組，比CK組高69.21%。盤(pán)柳依等[36]研究0.1 mmol/L MeJA對(duì)采后獼猴桃果實(shí)抗氧化能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用MeJA處理能促進(jìn)總酚含量的積累，同時(shí)可提高果實(shí)抗氧化能力，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

葡萄花色苷作為類(lèi)黃酮家族最大的一個(gè)分支，影響著葡萄酒的色澤、口感及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，且直接決定紅葡萄酒的顏色[37-38]，同時(shí)花色苷的合成過(guò)程受內(nèi)部因素（結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和MYB單倍體）和外部因素（植物激素和環(huán)境）的調(diào)控[39]。從圖1G可看出，E-L 35到E-L 38時(shí)期外源MeJA類(lèi)物質(zhì)處理后葡萄果實(shí)中總花色苷含量整體上均顯著高于CK組（P＜0.05）。在E-L 38時(shí)期，0.1E和5D處理組果實(shí)總酚含量較多，分別比CK組高85.29%和71.57%，對(duì)葡萄果實(shí)色澤的影響較明顯。有趣的是，隨著葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)，不同濃度外源MeJA類(lèi)物質(zhì)處理后，在果實(shí)糖含量積累的同時(shí)，漿果花色苷含量也相應(yīng)有所增加，這一結(jié)果說(shuō)明糖作為花色苷合成的重要物質(zhì)，與花色苷的積累密切相關(guān)[40]。

綜上，隨著葡萄果實(shí)的成熟，不同處理下葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量、總糖質(zhì)量濃度、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、總酚及總花色苷含量整體呈上升趨勢(shì)，而果實(shí)可滴定酸質(zhì)量濃度逐漸下降，這與前人研究結(jié)果[34,41]一致，其中，0.1E及5D處理組效果較顯著。

2.2 MeJA類(lèi)物質(zhì)處理對(duì)葡萄果實(shí)揮發(fā)性化合物的影響

2.2.1 MeJA和MDJA處理葡萄果實(shí)采收期揮發(fā)性香氣物質(zhì)主成分分析（principal component analysis，PCA）

從MeJA和MDJA處理葡萄果實(shí)采收期（E-L 38）揮發(fā)性化合物的PCA（圖2）結(jié)果看，PC1貢獻(xiàn)率為67.10%，PC2貢獻(xiàn)率為19.70%。第1、2主成分很好地將各處理組進(jìn)行了區(qū)分，同時(shí)各處理組對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)在組內(nèi)呈現(xiàn)較好的聚集性，說(shuō)明組內(nèi)的重復(fù)性較好。在各處理組中，0.1E與5D處理組集中分布在坐標(biāo)的第4象限，說(shuō)明這兩個(gè)處理組之間的相似性非常高。有趣的是，低濃度的MDJA處理組和高濃度的MeJA處理組在95%的置信度下有較好的相似性。其中，0.1E及5D處理組周?chē)喝?、正己醇、?2-己烯醛、反-2-己烯醇及順-3-己烯醇等香氣化合物分布較多。這一結(jié)果說(shuō)明0.1 mmol/L MeJA與5 mmol/L MDJA處理對(duì)‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)C6類(lèi)香氣化合物的提高和改善具有相似且積極的作用，因此，該結(jié)果也為本實(shí)驗(yàn)更進(jìn)一步研究的較適濃度確定提供了依據(jù)。

圖2 采收期葡萄果實(shí)揮發(fā)性香氣化合物PCAFig.2 Principal component analysis of volatile aroma compounds in grape fruits at harvest

2.2.2 MeJA和MDJA處理對(duì)葡萄果實(shí)采收期揮發(fā)性香氣物質(zhì)偏最小二乘判別分析

對(duì)外源MeJA類(lèi)物質(zhì)處理葡萄果實(shí)后所有揮發(fā)性化合物進(jìn)行偏最小二乘判別分析，得到變量投影重要性（variable importance in projection，VIP）得分圖（圖3）。各處理后揮發(fā)性香氣物質(zhì)的重要程度由顏色漸變顯示，其中紅色表示高相關(guān)性，藍(lán)色表示低相關(guān)性，VIP分?jǐn)?shù)是變量重要性的度量，一般認(rèn)為，同時(shí)滿(mǎn)足P＜0.05、VIP＞1.0的變量為差異代謝物。

圖3 葡萄果實(shí)揮發(fā)性香氣化合物偏最小二乘判別分析Fig.3 Partial least squares-discriminant analysis of volatile aroma compounds in grape fruits

通過(guò)分析，篩選出各處理中葡萄果實(shí)受影響最大的揮發(fā)性香氣化合物，分別為2-己烯醛、反-2-己烯醛、正己醛和正己醇，其均為C6化合物。有研究表明，“中性”葡萄果實(shí)中次級(jí)代謝產(chǎn)物即揮發(fā)性香氣化合物含量最多的是C6醛和C6醇，酯含量較低，這也是‘蛇龍珠’釀酒葡萄的主要特征之一[42]，這一研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相符。次生代謝物積累的誘導(dǎo)是一種重要的應(yīng)激反應(yīng)，依賴(lài)于生物或非生物誘導(dǎo)子作為協(xié)調(diào)多種生物合成基因表達(dá)的調(diào)節(jié)信號(hào)。茉莉酸鹽作為植物特異性的誘導(dǎo)子信號(hào)分子，對(duì)植物生理和發(fā)育過(guò)程的激活具有重要作用[43]。因此，本研究中，經(jīng)外源MeJA類(lèi)物質(zhì)處理后，葡萄果實(shí)中的含量最高、受影響最大的揮發(fā)性化合物為C6類(lèi)化合物。

2.2.3 MeJA和MDJA處理后葡萄果實(shí)C6化合物熱圖分析

圖4展示了簡(jiǎn)要的代謝途徑，熱圖的每個(gè)圓形中的數(shù)據(jù)已均質(zhì)化，同時(shí)彩色框表示這些化合物的相對(duì)含量（紅色代表含量水平較高；藍(lán)色代表含量水平較低）。由圖4可以看出，正己醛和反-2-己烯醛為兩種主要的C6醛，其在葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)色初期（E-L 35）及轉(zhuǎn)色結(jié)束期（E-L 36）含量大幅度增加，隨后在成熟中后期（E-L 37、E-L 38）逐漸減少。順-3-己烯醛作為反-2-己烯醛的同分異構(gòu)體，其含量隨果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育積累并不是很多。同時(shí)可以明顯看出，與CK組相比，0.1E及5D處理組中反-2-己烯醛、正己醛及順-3-己烯醛含量較豐富。主要的C6醇（正己醇、反-2-己烯醇）是ADH的直接產(chǎn)物，其在果實(shí)成熟中后期積累較多，且在葡萄果實(shí)采收期時(shí)（E-L 38），0.1E、5D及10D處理組中正己醇和反-2-己烯醇含量較其他處理組豐富。研究表明，在‘赤霞珠’葡萄中，醛類(lèi)物質(zhì)是漿果發(fā)育中期的特征，醇類(lèi)物質(zhì)是發(fā)育晚期的特征[44]，這與本研究結(jié)果一致。

圖4 不同處理對(duì)葡萄果實(shí)綠葉揮發(fā)物含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on the contents of green leaf volatile components in grape fruits

綜上所述，0.1E及5D處理在果實(shí)成熟中后期促進(jìn)了C6醛類(lèi)化合物的積累，在果實(shí)采收期時(shí)增加了C6醇類(lèi)物質(zhì)的含量。

2.3 最適濃度MeJA和MDJA處理對(duì)‘蛇龍珠’葡萄果皮LOX、HPL、ADH活力的影響

2.3.1 LOX活力的變化

由圖5可看出，不同處理下的‘蛇龍珠’葡萄果皮中LOX活性均有一個(gè)峰值，在果實(shí)轉(zhuǎn)色結(jié)束時(shí)（E-L 36）達(dá)到最大值后逐漸下降，10E處理組除外，其LOX活性峰值在成熟中期（E-L 37）出現(xiàn)。同時(shí)經(jīng)較低濃度的MeJA和MDJA處理后，果皮中LOX活性在不同生長(zhǎng)階段與CK組相比均得到提高，在LOX活力達(dá)到最高值時(shí)（E-L 36），0.1E及5D處理的LOX活性分別比CK組提高了15.26%和14.94%。鞠延侖等[31]在對(duì)‘赤霞珠’釀酒葡萄進(jìn)行采前外源MeJA噴施處理后發(fā)現(xiàn)，LOX活性得到增加，同時(shí)其在葡萄果實(shí)生長(zhǎng)的過(guò)程中活性先增大后減小，這可能與LOX的生理作用有關(guān)，LOX是負(fù)責(zé)LOX路徑第一步反應(yīng)的第一組，在發(fā)育過(guò)程中LOX活性與外界的環(huán)境緊密相關(guān)。

圖5 最適濃度MeJA和MDJA處理對(duì)葡萄果皮LOX活性的影響Fig.5 Effects of optimum concentrations of MeJA and MDJA on the activity of LOX in grape peel

2.3.2 HPL活力的變化

如圖6所示，HPL的活性從果實(shí)轉(zhuǎn)色期（E-L 35）后緩慢下降，經(jīng)0.1E和5D處理噴施后，葡萄中的HPL活力均高于CK組，在E-L 35轉(zhuǎn)色期，CK組活力為38.49 U/L，0.1E處理后其活力提升為43.81 U/L，5D處理后活力提高為40.90 U/L，而10E處理組下的HPL活力整體低于0.1E及5D處理組。

圖6 最適濃度MeJA和MDJA處理對(duì)葡萄果皮HPL活性的影響Fig.6 Effects of optimum concentrations of MeJA and MDJA on the activity of HPL in grape peel

2.3.3 ADH活力的變化

如圖7所示，ADH活性隨著葡萄果實(shí)生長(zhǎng)，整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。其中，采收期（E-L 38）ADH活力達(dá)到最大值，此時(shí)0.1E及5D處理組相比于CK組分別提高了49.10 U/L和46.37 U/L；而10E處理后，E-L 35到E-L 38時(shí)期其ADH活性整體明顯低于CK組。

圖7 最適濃度MeJA和MDJA對(duì)葡萄果皮ADH活性的影響Fig.7 Effects of optimum concentrations of MeJA and MDJA on the activity of ADH in grape peel

綜上所述，隨著葡萄果實(shí)的生長(zhǎng)，0.1E及5D處理能夠促進(jìn)LOX、HPL及ADH活性，而10E處理對(duì)其則產(chǎn)生明顯的抑制作用。這一結(jié)果的產(chǎn)生可能與MeJA類(lèi)物質(zhì)的濃度有關(guān)，其還有待于進(jìn)一步探究。

2.4 ‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)C6類(lèi)化合物與LOX、HPL、ADH活力相關(guān)性分析

C6醛是葡萄果實(shí)的主要香氣化合物，產(chǎn)生于脂肪酸代謝途徑，經(jīng)LOX和HPL作用生成，C6醇是由ADH還原其各自的醛產(chǎn)生，這些化合物為葡萄果實(shí)提供綠葉氣味[6]。由圖8可以看出，脂肪酸代謝途徑關(guān)鍵酶LOX、HPL及ADH活力與其代謝途徑的次級(jí)產(chǎn)物（C6醛、C6醇）之間具有顯著的相關(guān)性。整體來(lái)看，各個(gè)處理組中的LOX及HPL與C6醛類(lèi)物質(zhì)之間呈顯著正相關(guān)，與C6醇類(lèi)物質(zhì)之間呈負(fù)相關(guān)性；而ADH則相反。這與鞠延侖等[31]在對(duì)‘赤霞珠’釀酒葡萄進(jìn)行采前外源MeJA噴施處理后發(fā)現(xiàn)LOX經(jīng)MeJA處理后活性增加，葡萄果實(shí)主要揮發(fā)性化合物1-己醇及正己醛等C6化合物含量提高的結(jié)論一致。同時(shí)可以明顯看出，與CK組相比，0.1E與5D處理組中脂肪酸代謝途徑各個(gè)關(guān)鍵酶與代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性更強(qiáng)，這說(shuō)明較適濃度的MeJA與MDJA處理對(duì)脂肪酸代謝具有積極影響，同時(shí)很好地證明了脂肪酸途徑中“綠葉揮發(fā)物”（C6類(lèi)物質(zhì)）的積累受MeJA類(lèi)物質(zhì)的影響。

圖8 MeJA和MDJA處理后葡萄果實(shí)次生代謝產(chǎn)物與關(guān)鍵酶活力相關(guān)性分析Fig.8 Correlation analysis between secondary metabolites and key enzyme activities in grape fruits after MeJA or MDJA treatments

3 結(jié)論

0.1 mmol/L MeJA和5 mmol/L MDJA處理可促進(jìn)‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)百粒質(zhì)量、總糖含量、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、pH值、總酚及總花色苷含量的增加，降低果實(shí)可滴定酸含量，從而提高和改善果實(shí)品質(zhì)。并且該濃度處理后，葡萄果實(shí)C6類(lèi)化合物含量得到了明顯的提高，更加突出了果實(shí)的品種香氣。同時(shí)，脂肪酸代謝途徑中各個(gè)關(guān)鍵酶活性與代謝產(chǎn)物之間極顯著相關(guān)性也說(shuō)明了較適濃度的MeJA類(lèi)物質(zhì)處理對(duì)‘蛇龍珠’葡萄果實(shí)中綠葉揮發(fā)物的積累具有積極作用。