徐 萍，黃 婷，劉士琦，胡美姣，高兆銀，劉家糧，張正科,*

（1.海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228；2.海南省食品營養(yǎng)與功能食品重點實驗室，海南 ?？?570228；3.中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所，海南 ?？?571101）

芒果（Mangifera indicaL.）為漆樹科常綠喬木芒果樹的果實，是世界五大熱帶水果之一[1]。芒果果實以其獨特的香氣、甘甜多汁的口感和豐富的營養(yǎng)而深受人們喜愛。然而，采后芒果果實在常溫貯藏運輸過程中可快速成熟衰老、易腐爛，造成品質劣變，極大影響產品的市場銷售[2]。冷藏是常用的果蔬采后保鮮方法，但芒果對低溫敏感，冷藏期間易發(fā)生冷害（chilling injury，CI），且冷藏芒果果實轉移到常溫環(huán)境貯藏時，CI癥狀（果皮褐變、黑斑及凹陷等）迅速加重。此外，芒果發(fā)生CI時，后熟能力部分或完全喪失，常表現(xiàn)為色澤不能轉黃、果肉硬化、香味不佳、可溶性糖積累量不足等，這極大限制了芒果冷鏈物流發(fā)展[3]。低溫誘導的果實成熟異常與乙烯合成及信號轉導、細胞壁物質和淀粉降解受阻等因素有關，故對受冷果實成熟相關生理代謝進行調控則有助于解決芒果CI問題。已有研究發(fā)現(xiàn)，熱水浸泡、間歇升溫、低溫預貯、外源乙烯等處理可有效促進芒果果實在冷藏過程中或冷藏后貨架期中的成熟，使果實CI減輕，果實品質得到改善[4-6]。

褪黑素（melatonin，MT）是一種廣泛存在于生物體內的天然吲哚胺類化合物。對植物而言，MT的生物合成前體為色氨酸，合成場所為葉綠體和線粒體，盡管含量微少，但在多個組織和器官中分布，是具有重要生物活性的抗氧化分子和信號分子，其不僅能夠調節(jié)植物的種子萌發(fā)、組織分化、氣孔開閉、生根、光合效率、生物節(jié)律和成熟衰老，還能激發(fā)植物對多種生物及非生物脅迫的抗性[7-9]。

近年來的研究證據(jù)表明，MT處理可緩解多種采后果實CI[10]。例如在芒果果實中，MT處理可通過激活抗氧化系統(tǒng)、促進多胺代謝和γ-氨基丁酸代謝、增加脯氨酸積累、維持能量供應和抑制膜脂過氧化及降解等機制減輕芒果果實在冷藏期間的CI[11-14]。然而，目前尚不清楚MT處理對芒果果實由冷藏轉入常溫貨架后的CI及后熟的影響。為此，本研究以‘貴妃’芒果果實為研究對象，通過分析細胞壁代謝、乙烯生物合成及信號轉導途徑、冷響應轉錄因子基因表達，明確MT處理對冷藏后芒果果實成熟軟化及對溫度變化適應性的調節(jié)作用，研究結果可為MT提高芒果抗冷性并改善果實品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘貴妃’芒果果實于2022年4月5日上午在海南三亞郊一商業(yè)果園采收，采摘時選取果肩飽滿且已經(jīng)達到商業(yè)成熟度的綠熟期果實（單果質量（218.6±16.7）g，n＝10），于采摘當日運至海南大學食品科學與工程學院采后生物保鮮實驗室。

MT、磷酸吡哆醛 上海源葉生物科技有限公司；β-巰基乙醇 美國Bio-Basic公司；植物多糖多酚總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成預混試劑盒、SuperReal熒光定量預混試劑盒 北京天根生化科技有限公司；GreenTaqMix 南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

FT327手持硬度計 意大利Effegi公司；CR-400色差儀 日本美能達柯尼卡公司；Master-M手持折光儀日本東京Atago公司；FP110手持葉綠素熒光儀 易科泰生態(tài)技術有限公司；FE30電導率儀 瑞士梅特勒-托利多公司；Synergy LX酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；UVmini1240紫外-可見光分光光度計 上海一恒科學儀器有限公司；CFX ConnectTMOptics Module熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國Bio-Rad公司；ChampGel 5000全自動凝膠成像儀浙江柏奧生物科技有限公司；6890N型氣相色譜儀（配氫離子火焰檢測器）美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 果實采后處理

將實驗用果用0.05%次氯酸鈉溶液消毒5 min，用自來水沖洗、晾干后，將其隨機分成兩組，每組312 個果實。在室溫和暗環(huán)境條件下，將兩組果實分別置于蒸餾水（對照組）和0.5 mmol/L（通過預實驗篩選得到）的MT溶液中浸泡1 h。所有果實自然晾干后放置于打孔塑料保鮮盒（尺寸：320 mm×220 mm×100 mm；6 個/盒）中。將處理后果實置于（4±1）℃、相對濕度（85±5）%冷庫中貯藏28 d，隨后轉移至室溫（25 ℃）貯藏4 d，在貨架期內每天測定果實CI指數(shù)、果肉色度、硬度、可溶性固形物質量分數(shù)（soluble solid content，SSC）、呼吸速率及乙烯釋放量。同時，每天取果肉組織冷凍于液氮中，在-80 ℃冰箱中凍存，待測。每處理在每測定點設3 次重復，每次重復30 個果用于CI指數(shù)測定，2 個用于呼吸速率和乙烯釋放量測定，6 個用于其他指標測定。

1.3.2 果實CI指數(shù)和果皮色相（h值）測定

CI指數(shù)：根據(jù)果實果皮CI癥狀（褐變、黑斑、凹陷及皺縮）的嚴重程度分為5 級（0～4）[5]，其中0級為無CI，1級為輕微CI；2級為中度CI；3級為嚴重CI；4級為極嚴重CI。CI指數(shù)按下式計算：

色度：使用CR-400色差儀測定芒果果皮（綠面）的色度值，記錄L*、a*和b*值，根據(jù)公式h＝arctan（b*/a*）將獲得的值轉換為h值，單位以度（°）表示。

1.3.3 果實硬度和SSC測定

硬度：使用FT-327 手持式硬度計（探頭直徑6 mm）測定果實正反兩面中心處的硬度，單位以牛頓（N）表示。

SSC：使用Master-M手持式折光儀經(jīng)蒸餾水調零后測定果實的SSC。SSC以%表示。

1.3.4 果實呼吸速率和乙烯釋放量測定

呼吸速率：將6 個芒果果實兩兩放進2.25 L帶有橡膠塞的塑料容器中，密封20 min后將探針插入容器，記錄CO2濃度，根據(jù)容器容積、果實質量和CO2濃度差計算呼吸速率[15]，單位表示為nmol/（kg·s）。

乙烯釋放量：參考Hu Meijiao等[15]的方法，在室溫條件下，將6 個芒果果實兩兩裝在帶有橡膠隔墊的2.25 L塑料容器中密封60 min，然后抽取1 mL頂部氣體樣品注入配備5%苯基-甲基聚硅氧烷色譜柱（30 m×250 μm，0.25 μm）和氫離子火焰檢測器的氣相色譜儀中。進樣溫度、柱溫和檢測器溫度分別設置為60、120 ℃和250 ℃。N2、H2和空氣流速分別為0.023、0.67 mL/s和6.67 mL/s。記錄乙烯濃度，根據(jù)容器容積、果實質量計算乙烯釋放量，單位表示為nmol/（kg·s）。

1.3.5 果實水溶性果膠（water-soluble pectin，W S P）和共價結合型果膠（環(huán)己烷二胺四乙酸（1,2-cyclohexylenedinitrilotetr aacetic acid，CDTA）-soluble pectin，CSP）測定

醇不溶性固形物（alcohol insoluble solids，AIS）制備：AIS的提取和分離參考Figueroa等[16]方法并稍作修改。稱取10 g冷凍果肉組織于40 mL體積分數(shù)80%乙醇溶液中充分渦旋勻漿，煮沸30 min，冷卻后抽濾，收集濾渣，向殘渣中加入40 mL 90%二甲基亞砜溶液，于4 ℃培養(yǎng)箱內放置12 h，用去離子水清洗，抽濾后收集殘渣，將殘渣依次用80%乙醇溶液、氯仿-乙醇（2∶1，V/V）、丙酮沖洗至顏色發(fā)白，抽濾，將殘渣置于40 ℃真空干燥箱中烘干，收集得到AIS。

取1 g AIS分散在50 mL去離子水中，置于25 ℃搖床振蕩6 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，殘渣重復提取2 次，合并上清液即得WSP；向沉淀中加入50 mL 50 mmol/L乙酸鈉緩沖液（pH 6.5，含50 mmol/L CDTA），25 ℃振蕩6 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，殘渣重復提取2 次，合并上清液即得CSP。用半乳糖醛酸為標準品制作標準曲線，通過羥基聯(lián)苯測定法[17]進行定量，結果以每千克AIS中的半乳糖醛酸質量表示，單位表示為g/kg。

1.3.6 果實細胞壁代謝相關酶活力測定

取5 g果肉組織加入30 mL含10 g/L聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）的8.8% NaCl溶液后勻漿，在4 ℃提取1 h后，溶液以12 000×g離心20 min。獲得上清液作為粗酶液并用于測量多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）和果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）活力[18]。

PG活力參照Yoshida等[19]的方法，取0.2 mL乙酸鈉緩沖液（40 mmol/L、pH 4.6）與0.2 mL聚半乳糖醛酸溶液（10 g/L）混勻，隨后加入100 μL粗酶液，將滅活的酶提取物作為對照組，于40 ℃孵育30 min，然后加入0.5 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）終止反應，沸水浴10 min，記錄反應溶液在540 nm波長處的吸光度，酶活力定義為每千克果肉每秒產生的半乳糖醛酸的物質的量，單位為μmol/（kg·s）。

PME活力測定參照Vicente等[20]的方法，反應體系包含0.6 mL柑橘果膠溶液（5 g/L）、0.15 mL 0.05%溴百里酚藍、0.1 mL蒸餾水和0.1 mL粗酶液（pH 7.5），混合均勻后置于37 ℃條件下孵育30 min，記錄620 nm波長處吸光度的變化。定義1 個PME活力（1 U）表示為每秒每千克樣品在620 nm波長處吸光度變化1，PME活力單位為U/kg。

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）活力測定參考Lin Yifen等[21]的方法，取5 g果肉組織加入30 mL含1 mol/L NaCl、β-巰基乙醇（體積分數(shù)2%）和5% PVP的乙酸鈉緩沖液中勻漿，溶液以12 000×g離心20 min，獲得上清液即為粗酶液，反應混合物由200 μL粗酶液和1 mLρ-NO2-β-D-吡喃半乳糖苷（溶于50 mmol/L乙酸鈉溶液，pH 4.7）組成，在37 ℃條件下孵育30 min，隨后加入2 mL 10 mmol/L Na2CO3溶液終止反應，在400 nm波長處測定吸光度，β-Gal活力表示為每秒每千克鮮質量樣品催化生成p-硝基苯酚的物質的量，即為μmol/（kg·s）。

纖維素酶即內切-1,4-β-葡聚糖酶（endo-1,4-β-Dglucanase，EGase），活力測定參照Ali等[22]的方法，取5 g果肉加入20 mL含有1 mol/L NaCl、13 mmol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、10 mmol/Lβ-巰基乙醇以及1% PVP的檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L、pH 4.6）中進行均質處理，以12 000×g離心30 min，上清液即為粗酶液。將1.5 mL羧甲基纖維素鈉溶液（10 g/L）與300 μL粗酶液混合，在40 ℃孵育1 h，將煮沸5 min的粗酶液作為對照，隨后加入DNS并煮沸5 min終止反應，測定540 nm波長處的吸光度。以葡萄糖標準品制作的標準曲線進行還原糖含量計算。EGase活力表示為每秒每千克果蔬樣品催化羧甲基纖維素鈉水解生成還原糖的質量，即μg/（kg·s）。

1.3.7 果實乙烯合成途徑相關酶活力測定

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid synthase，ACS）活力參考Zaharah等[23]的方法進行測定。反應結束后從頂部抽出1 mL氣體，注入氣相色譜儀中測定乙烯釋放量。ACS活力表示為每秒每千克果蔬組織（鮮質量）中1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid，ACC）的生成量，即為nmol/（kg·s）。

1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸氧化酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase，ACO）活性測定參照Zaharah等[24]的方法。取5 g 果肉組織用以粗酶液的提取，在相同的參數(shù)條件下測定乙烯釋放量。ACO活力表示為每秒每千克果蔬樣品（鮮質量）的乙烯釋放量，即為nmol/（kg·s）。

1.3.8 乙烯生物合成及信號轉導與冷響應轉錄因子基因表達分析

使用RNAprep Pure多糖多酚總RNA提取試劑盒提取芒果果皮總RNA，使用cDNA第一鏈合成預混試劑盒進行反轉錄，生成cDNA，具體操作根據(jù)試劑盒說明書步驟進行。產物用RNA free H2O稀釋20 倍作為實時PCR（realtime PCR）模板并置于-20 ℃保存，使用瓊脂糖凝膠電泳檢驗cDNA質量。real-time PCR反應體系如表1所示。

表1 real-time PCR反應體系Table 1 Composition of real-time PCR reaction system

MiACS（XM_044645674.1）、MiACO（XM_044609568.1）、MiETR1（乙烯受體1，ethylene receptor 1，XM_044647038.1）、MiERS1（乙烯響應傳感器1，ethylene responsive sensor 1，XM_044637754.1）、MiCTR1（組成型三重響應1，constitutive triple response 1，XM_044636533.1）、MiERF1（乙烯響應因子1，ethylene responsive factor 1，XM_044613564.1）、MiEIN2（乙烯不敏感因子2，ethylene insensitive 2，XM_044638375.1）、MiCBF1（C-重復基序結合因子1，C-repeat-binding factor 1，XM_044612296.1）和MiICE1（CBF表達誘導因子1，inducer of CBF expression 1，XM_044610366.1）序列信息從NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）搜索獲得，使用oligo 7軟件設計real-time PCR引物（表2），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以MiActin1（JF737036.1）基因作為內參基因，采用瓊脂糖凝膠電泳驗證引物特異性。

表2 real-time PCR引物序列Table 2 Primer sequences used for real-time PCR

使用SuperReal熒光定量預混試劑盒，根據(jù)說明書步驟進行real-time PCR操作，并通過Bio-Rad CFX96實時熒光定量PCR儀進行real-time PCR分析。反應程序：預變性95 ℃持續(xù)15 min，隨后95 ℃持續(xù)10 s；退火溫度（60 ℃）持續(xù)30 s，進行40 次循環(huán)。根據(jù)2-ΔΔCt方法[25]計算各個基因的相對表達量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。采用獨立樣本t檢驗法分析處理組與對照組在相同時間點的顯著差異（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 MT處理對芒果果實CI指數(shù)和果皮色度的影響

如圖1A所示，冷藏（28 d）結束時，對照組和MT處理組果實的CI癥狀均較輕，在常溫貨架期間，對照組果實CI癥狀不斷加重，且不能正常轉色，而MT處理組果實CI發(fā)展較慢，且果實可由綠轉黃。CI測定結果顯示，MT處理組果實CI指數(shù)在常溫貨架期間平均低于對照32.9%（圖1B）。h值大小可反映從物體反射或透過物體傳播的顏色，紅色為0°、黃色為60°、綠色為120°。如圖1C所示，MT處理組果實h值下降速度顯著快于對照果實，表明MT處理可加速芒果色澤由綠轉黃，這與表型觀察結果（圖1A）相吻合。

圖1 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后外觀（A）、CI指數(shù)（B）和h值（C）的影響Fig.1 Effect of MT treatment on appearance (A),CI index (B) and h value (C) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.2 MT處理對芒果果實硬度和SSC的影響

由圖2A可知，室溫貯藏4 d后，對照組果實硬度從初始值（86.02±3.37）N迅速下降至（7.12±0.75）N；MT 處理加速了芒果果實硬度下降，其中對照果實在貯藏1～3 d的平均硬度比處理組果實高36.3%。由圖2B可知，對照和MT處理果實SSC在貯藏過程中從（10.63±0.37）%和（11.06±0.14）%分別升高至（15.46±0.41）%和（16.39±0.37）%；MT處理果實的SSC在第1、2、3天均顯著高于對照果實。

圖2 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后硬度（A）和SSC（B）的影響Fig.2 Effect of MT treatment on firmness (A) and SSC (B) in ‘Guifei’mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.3 MT處理對芒果果實呼吸速率和乙烯釋放量的影響

由圖3A可知，芒果果實轉入常溫后，呼吸速率在前期持續(xù)上升，對照果實在貯藏第2天時達到峰值（49.95±2.20）nmol/（kg·s），隨后逐漸下降。MT處理提高了芒果果實的呼吸速率，在貯藏第2天時達到（69.57±1.89）nmol/（kg·s），較對照果實高39.2%。結果表明，MT處理果實轉入常溫后呼吸速率提高，加快了果實正常后熟軟化。由圖3B可知，在整個貯藏期間，對照果實的乙烯釋放量在貯藏的前2 d持續(xù)上升，峰值為（12.02±0.58）nmol/（kg·s），隨后下降。MT處理增加了乙烯的釋放量，使其峰值較對照果實高39.2%。

圖3 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后呼吸速率（A）和乙烯釋放量（B）的影響Fig.3 Effect of MT treatment on respiration rate (A) and ethylene production (B) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.4 MT處理對芒果果實WSP和CSP含量的影響

由圖4可知，對照果實在常溫貯藏0 d時WSP和CSP含量分別為（8.61±1.83）g/kg和（9.62±1.31）g/kg，第4天時，二者值分別達到（72.88±4.91）g/kg和（41.30±3.29）g/kg。與對照相比，MT處理明顯提高了WSP和CSP含量，在貯藏第1～4天，MT處理果實的WSP含量平均值較對照高87.1%；貯藏2～4 d，MT處理果實的CSP含量平均值較對照高55.5%。

圖4 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后WSP（A）和CSP（B）含量的影響Fig.4 Effect of MT treatment on WSP (A) and CSP (B) contents in‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.5 MT處理對芒果果實細胞壁代謝相關酶活性的影響

由圖5 A 可知，對照組果實P G 活力初始值為（5.34±0.19）μmol/（kg·s），常溫放置2 d后，PG活力增加到（13.09±0.80）μmol/（kg·s），隨后逐漸下降。MT處理顯著提高了貯藏期間果實PG活性，其處理果實的PG活性在貯藏1～3 d顯著高于對照組。如圖5B所示，對照和處理組果實PME活性在整個貯藏過程中呈下降趨勢，對照組果實在第4天較第0天下降了66.4%。MT處理加速了PME活性下降，其處理果實的PME活性在貯藏第1天和第2天顯著低于對照果實。如圖5C所示，對照果實β-Gal活性在貯藏過程中呈線性升高趨勢。MT處理促進了果實β-Gal活性升高，其在2、3 d和4 d時顯著高于對照。如圖5D所示，對照組與MT處理組果實EGase活性總體呈上升趨勢，且MT處理果實的活性高于對照組，其在貯藏第2天和第4天分別高于對照42.7%和20.8%。

圖5 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后PG（A）、PME（B）、β-Gal（C）和EGase（D）活性的影響Fig.5 Effect of MT treatment on PG (A),PME (B),β-Gal (C) and EGase (D) activities of ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.6 MT處理對芒果果實乙烯合成相關酶活性及其基因表達的影響

冷藏芒果果實轉入常溫后，ACS和ACO活性呈峰型變化趨勢，第2天達到峰值且MT處理組ACS和ACO活性變化較對照組更為明顯，其峰值分別較對照果實高30.1%和20.8%（圖6A、B）。MiACO和MiACS相對表達量與ACO和ACS變化趨勢相似，MT處理提高了果實MiACO和MiACS相對表達量，在貯藏1～3 d中達到顯著水平（圖6C、D）。

圖6 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后ACS（A）和ACO（B）活性、MiACS（C）和MiACO（D）表達的影響Fig.6 Effect of MT treatment on activities of ACS (A) and ACO (B)and relative expression of MiACS (C) and MiACO (D) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.7 MT處理對芒果果實乙烯信號轉導途徑相關基因表達的影響

如圖7A所示，對照果實MiETR1表達量在常溫貨架期第1天時略有下降，隨后升高并保持穩(wěn)定。MT處理促進了MiETR1表達水平提高，在第2天時出現(xiàn)高峰，較對照高40%，隨后下降。如圖7B所示，對照果實MiERS1表達量在常溫貯藏期間的變化相對平穩(wěn)。MT處理組果實MiERS1表達量在貯藏第2、3、4天分別較對照提高50%、30%和50%。如圖7C所示，對照果實MiCTR1表達量在貯藏前3 d中逐漸上升，隨后下降。MT處理顯著抑制了MiCTR1的表達，其表達量在貯藏1～4 d的平均值較對照組低35.1%。如圖7D所示，對照果實MiERF1表達量逐漸升高，第2天達到最大，較第0天增加了1.1 倍，隨后逐漸下降。MT處理組果實MiERF1表達水平在貯藏1～3 d顯著高于對照。如圖7E所示，對照果實MiEIN2表達量在貯藏中變化較小。MT處理誘導了MiEIN2表達量升高，在貯藏第1、2、3天時的表達量顯著高于對照果實79.4%、52.9%和42.1%。

圖7 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后MiETR1（A）、MiERS1（B）、MiCTR1（C）、MiERF1（D）和MiEIN2（E）表達的影響Fig.7 Effect of MT treatment on relative expression levels of MiETR1 (A),MiERS1 (B),MiCTR1 (C),MiERF1 (D) and MiEIN2 (E) in ‘Guifei’mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

2.8 MT處理對芒果果實冷響應轉錄因子表達水平的影響

如圖8A所示，對照果實轉常溫后MiICE1表達量迅速升高，第2天出現(xiàn)高峰，峰值較第0天增長8.3 倍，隨后迅速下降。MT處理果實的MiICE1表達量在貯藏第1、2、3天顯著高于對照組，分別是對照組的1.5、1.5 倍和1.6 倍。

圖8 MT處理對冷藏‘貴妃’芒果果實轉入常溫貨架后MiICE1（A）和MiCBF1（B）表達的影響Fig.8 Effect of MT treatment on relative expression levels of MiICE1 (A) and MiCBF1 (B) in ‘Guifei’ mango fruits during shelf life at room temperature after refrigeration

如圖8B所示，對照果實的MiCBF1相對表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。MT處理顯著促進了MiCBF1相對表達量升高，在貨架期0～3 d顯著高于對照果實，其中在第1、2天分別較對照高71.6%和97.4%。

3 討論

CI是導致冷藏期間或冷藏后芒果果實品質劣變的主要因素[5]。Zhao Zhilei等[26]研究發(fā)現(xiàn)，綠熟期、轉色期、黃熟期3 組芒果果實在2 ℃冷藏10 d后轉入室溫貯藏期間，后兩組的果實CI癥狀顯著輕于第一組果實，表明成熟度較高的芒果果實因其代謝旺盛而具有較高的抗冷能力。本研究中，在4 ℃條件下冷藏28 d后，對照芒果果實出現(xiàn)輕微褐變、黑斑等CI癥狀，隨后轉移至室溫貯藏4 d期間，CI癥狀不斷加重。MT處理降低了果實CI指數(shù)，并加速了h值下降，表明MT處理可以抑制芒果果實CI發(fā)生，同時加速了芒果果實色澤由綠轉黃。

硬度和SSC是反映采后果實成熟狀態(tài)及貯藏品質的重要指標[27]。此外，可溶性固形物也是植物細胞滲透壓的重要調節(jié)物質，較高水平的SSC可維持細胞內的溶解度并降低冰點，故能改善植物抗冷能力[5]。芒果、香蕉和番木瓜等熱帶果實在CI發(fā)生過程中常伴有軟化滯緩及可溶性固形物積累受阻等后熟障礙。在本研究中，MT處理加速了冷藏后貨架期間芒果果實硬度下降并提高了SSC，表明MT可通過促進軟化和可溶性固形物積累來緩解芒果果實CI。本結果與低溫預貯處理和間歇變溫處理加速芒果果實成熟并減輕果實CI的結果[5-6]相一致。

呼吸在果實采后新陳代謝中起主導作用，對調控果實采后生理及品質變化具有重要意義[28]。呼吸作用加強可促進果實體內有機物質轉化，如細胞壁物質降解、淀粉水解、類胡蘿卜素積累和香氣物質合成等，導致果實成熟和軟化[29]。本研究中，MT處理顯著提高了受冷果實轉入常溫后的呼吸速率，因此能夠促進果實成熟相關生理代謝及抗冷相關物質積累，從而減輕CI癥狀。值得注意的是，先前研究結果顯示MT處理（0.5 mmol/L）1 h可抑制‘貴妃’芒果果實在25 ℃常溫貯藏期間的呼吸作用并推遲果實成熟[30]。不同的結果表明芒果果實在不同的環(huán)境中對MT的生理響應機制存在差異。

纖維素、半纖維素和果膠等多糖物質是細胞壁的主要組成成分，其在果實成熟過程中逐步降解，使細胞壁結構松弛，導致果實軟化[31]。果膠是植物細胞壁中最主要的多糖之一，根據(jù)溶解性將其分為WSP和水不溶性果膠（螯合性果膠和堿溶性果膠）[32]。WSP以游離形式存在于細胞質和細胞間隙中，不附著在細胞壁上[32]。CSP作為螯合性果膠，主要位于中膠層，通過鈣橋離子鍵或氫鍵結合在細胞壁上[32]。在本研究中，受冷芒果果實在轉入25 ℃貯藏期間WSP和CSP含量呈升高趨勢，表明芒果果膠不斷解聚，使細胞壁溶解；MT處理促進了WSP和CSP含量升高，因此處理果實的軟化較快。果實軟化與PG、PME、β-Gal和EGase等細胞壁水解酶的催化作用密切相關[33]。在這些酶的作用下，果膠分子結構發(fā)生改變，主要表現(xiàn)為果膠側鏈發(fā)生解離，果膠多聚物逐漸降解，從而導致果膠-纖維素-半纖維素網(wǎng)絡結構不斷被破壞[22]。其中，PG是參與果膠降解和增溶的關鍵酶，可催化果膠分子中多聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷鍵裂解，使細胞壁組分發(fā)生不同程度的降解，從而導致果實軟化[34]。PME的主要作用位點是聚半乳糖醛酸殘基中的C-6酯化基團，使果膠去甲基酯化，進而使PG水解去甲基化的聚半乳糖醛酸殘基，增加WSP含量，導致細胞壁結構解體，使果實軟化[35]。β-Gal作為一種糖苷酶，可裂解鼠李糖半乳糖酸I型果膠側鏈上的β-D-半乳糖殘基，與PG、PME協(xié)同作用促進細胞壁果膠基質解聚，導致果實軟化[36]。EGase是纖維素水解過程中的關鍵酶，能將細胞壁的骨架物質羧甲基纖維素水解成低聚糖或單糖[37]。低溫脅迫會使細胞壁代謝酶活性異常，造成細胞壁纖維素和果膠物質降解受阻，出現(xiàn)后熟障礙，導致果實發(fā)生CI[38]。在本研究中，相較于對照，MT處理能夠促進PG、β-Gal和EGase活性提高，且加速PME活性下降，表明MT在一定程度上維持了芒果果實細胞壁正常代謝，從而促進了果實軟化并減輕了CI癥狀。這與間歇低溫脅迫和熱處理對桃[38]、柿[39]和芒果[4]等果實CI影響的結果相似。

乙烯作為重要的植物激素，在調節(jié)果實成熟衰老和逆境脅迫響應中發(fā)揮關鍵作用[40]。乙烯的生物合成途徑涉及兩步關鍵酶促反應，第一步：通過ACS催化將S-腺苷-L-蛋氨酸轉化為ACC和5′-甲硫腺苷。第二步：在有氧條件下，ACO將ACC轉化為乙烯[41]。低溫脅迫可使芒果[42]、梨[43]、桃[44]、番茄[45]和香蕉[46]等果實體內乙烯生物合成受阻，導致果實發(fā)生CI，而外源乙烯處理能有效緩解這些果實的CI癥狀。在本研究中，與對照果實相比，MT處理促進了ACS和ACO活性及其編碼基因（MiACS和MiACO）的表達水平上調，因此增加了乙烯釋放量并有效恢復了果實成熟能力，導致果實CI減輕。

在植物中，乙烯通過乙烯信號轉導途徑調控下游基因轉錄，進而使植物細胞的生理代謝發(fā)生改變[47]。ETR1、ERS1、CTR1、ERF1和EIN2是乙烯信號途徑的重要組件。其中，CTR1是一種激酶蛋白，對乙烯反應起負調節(jié)作用，乙烯受體ETR1和ERS1主要在CTR1的上游發(fā)揮作用，而EIN2作為CTR1的下游元件，被激活后進入細胞核，調控下游的轉錄因子ERF1的表達，從而激活乙烯信號轉導途徑并最終實現(xiàn)乙烯生理效應[48]。Wang Ke等[49]研究發(fā)現(xiàn)，乙烯響應因子ERF介導了乙烯對冷藏桃果實細胞壁水解酶基因的調控，故對桃果實抗冷性起正調控作用。在本研究中，MT處理通過上調MiETR1、MiERS1、MiERF1和MiEIN2的表達并下調MiCTR1的表達而引發(fā)乙烯信號向下游傳遞，因此能夠激活下游成熟相關基因的表達，最終促進了成熟并延緩果實CI發(fā)生。類似的結論也在MT處理的番茄果實[50]中得到印證。

CBF信號途徑在調控植物耐冷性中發(fā)揮著重要作用[51]。CBF是APETALLA2（AP2）型轉錄激活因子，能夠結合到冷響應基因的啟動子區(qū)域，激活其轉錄[51]。ICE1是CBF信號途徑上游的關鍵組分。目前，CBF信號途徑在外源處理誘導果實抗冷性中的作用已被廣泛報道。例如，低溫預貯處理可提高芒果MiCBF1表達水平，從而提高果實抗冷能力[5]。Hu Shuqing等[52]報道，24-表油菜素內酯處理可誘導冷藏桃果實體內PpCBF5上調表達，其進一步介導PpPLD和PpLipase的轉錄抑制，從而延緩膜磷脂降解和脂質過氧化過程，減輕桃果實CI發(fā)生。另有報道，外源乙烯處理通過提高SlICE1和SlCBF1表達增強了番茄果實對低溫脅迫的耐受性，表明ICE/CBF與乙烯二者信號途徑之間可能存在交互作用[45]。在本研究中，對照果實MiCBF1和MiICE1基因相對表達量在貯藏前期有所增加，表明果實積極響應低溫脅迫后的環(huán)境變化。與對照果實相比，外源MT處理促進了MiCBF1和MiICE1表達水平提高，表明二者基因參與了MT誘導的芒果果實抗CI作用，同時推測其可能夠受上游乙烯信號途徑調控，相關推論需今后進一步研究證實。

綜上所述，外源MT處理能夠有效減輕芒果果實由低溫轉入常溫后的CI，并通過促進呼吸作用、乙烯合成及信號轉導、細胞壁代謝而加速果實成熟和軟化。此外，MT處理上調了芒果果實冷響應基因的表達，故可提高果實對貯藏溫度變化的適應性。研究結果為MT用于芒果冷藏保鮮提供了理論依據(jù)。