陳 聰，鄒 偉,2, ，湯秀娟,3，陳曉松，吳成澤

（1.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川 宜賓 644005；2.釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644005；3.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川 樂山 614000）

酯酶是一類催化酯水解反應(yīng)和酯合成反應(yīng)的酶，主要包括脂肪酶、磷脂酶和酯合成酶。酯酶具有生物膜信號(hào)傳導(dǎo)、脂質(zhì)降解和酯類化合物合成的功能，包括催化短鏈脂肪酸與醇發(fā)生酯合成、酯交換反應(yīng)以及組合的酯發(fā)生酯水解反應(yīng)[1-2]。同時(shí)酯酶也具有催化特性和底物選擇性，可以在不同的發(fā)酵食品中合成風(fēng)味各異的酯化產(chǎn)物[3-5]。動(dòng)植物及微生物等分泌的酯酶被廣泛應(yīng)用于工業(yè)酯化物生產(chǎn)，其中微生物源酯酶在食品、化妝品、醫(yī)藥及造紙工業(yè)中應(yīng)用最廣[6-10]。在產(chǎn)酯酶微生物的研究中，主要以霉菌、酵母和部分細(xì)菌為對(duì)象[11-12]。在白酒釀造過程中，霉菌和酵母等微生物合成的酯酶具有一定的特異性，容易將不需要分解的化合物分解，這可能會(huì)影響產(chǎn)品的口感和品質(zhì)[13]。與霉菌和酵母相比，細(xì)菌的生長(zhǎng)周期較短，它們合成酯酶速率也比較快，在白酒釀造中，在獲得最大的酯酶產(chǎn)量時(shí)可以提高生產(chǎn)效率和節(jié)約成本[14-15]。

由于酶法合成小分子脂肪酸酯具有高效、無污染、專一性強(qiáng)以及低雜質(zhì)含量等優(yōu)點(diǎn)[16-17]，這將為酯酶工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用于白酒產(chǎn)業(yè)提供了有利條件。酯酶作為白酒酯類化合物生產(chǎn)的重要催化劑，酶種類和酶活力決定著白酒的品質(zhì)。研究表明，對(duì)酯酶的序列注釋和作用機(jī)理深入了解和對(duì)催化條件進(jìn)行不同程度優(yōu)化，可以有效提高釀酒過程中酯類物質(zhì)的含量，從而改善酒的品質(zhì)[18]。此外，產(chǎn)酯酶細(xì)菌可使黃水、酒糟、酒尾等副產(chǎn)品轉(zhuǎn)化為酯化液等附加值產(chǎn)物，應(yīng)用到白酒釀造過程中可增加酯化物含量，從而改善其口味和風(fēng)味[19-20]。目前，盡管關(guān)于酯酶研究不斷取得進(jìn)展，但酯酶需求和生產(chǎn)成本仍然很高。因此，篩選高產(chǎn)酯酶細(xì)菌對(duì)豐富白酒微生物資源具有重要意義，有望提高白酒的品質(zhì)和滿足更廣范圍的酯酶需求。

本研究從濃香型白酒大曲中篩選出一株高產(chǎn)酯酶的菌株S5-4，利用形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)對(duì)其進(jìn)行鑒定，通過基因組測(cè)序與功能基因組注釋對(duì)菌株S5-4的產(chǎn)酯酶信息和產(chǎn)酯化物代謝路徑進(jìn)行深入研究，為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：四川某濃香型酒廠成品大曲。

篩選培養(yǎng)基[21]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液20%、制霉菌素質(zhì)量濃度25 μg/mL，自然pH值。

3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液：將3%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以體積比4∶1的比例均勻混合。

種子液培養(yǎng)基[22]：牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L，自然pH值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、牛肉膏20 g/L、氯化鈉5 g/L，pH 7.0。

產(chǎn)酯培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、氯化鈉5 g/L、酵母膏5 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏10 g/L、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g/L、乙酸鈉3 g/L、淀粉1 g/L、無水乙醇50 mL/L、1%生物素20 g/L，pH 6.8。

固體培養(yǎng)基為對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基加入2%的瓊脂、乙醇和1%生物素，過0.22 μm有機(jī)相濾膜除菌，上述培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min。

三丁酸甘油酯、聚乙烯醇、制霉菌素、丁酸、己酸（分析純）上海麥克林生化科技有限公司；牛肉膏、蛋白胨 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉（分析純）成都市科隆化學(xué)品有限公司；乙酸正丁酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯（色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm有機(jī)相濾膜尤尼柯（上海）科學(xué)儀器有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HZ150L型恒溫培養(yǎng)搖床 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司；VEGA3 SBU電子掃描顯微鏡 捷克TASCAN公司；MJ-250恒溫培養(yǎng)箱、TG-16醫(yī)用離心機(jī)四川蜀科儀器有限公司；SW-CJ2D超凈工作臺(tái) 上海蘇凈實(shí)業(yè)有限公司；HYQX-III厭氧培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；TSQ8000氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀 美國(guó)Thermo Fisher公司；ABI-2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酯酶菌株篩選

1.3.1.1 富集液培養(yǎng)

從大曲樣品中取樣，混合并研細(xì)，稱取5 g研磨樣品于盛有45 mL生理鹽水的三角瓶中，28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)2 h，靜置30 min。

1.3.1.2 產(chǎn)酯酶菌株的初篩

將制備好的富集液在無菌條件下稀釋為10-1～10-7（稀釋梯度）菌懸液，取200 μL涂布于篩選培養(yǎng)基平板，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行。在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，觀察菌落周圍是否有透明圈（以D/d比值（細(xì)菌透明圈直徑與菌落直徑之比）表示）并做好記錄。選取透明圈較大的菌落在篩選培養(yǎng)基上分離純化，并做好斜面保存。

1.3.1.3 種子液的制備

接種斜面保藏的純種菌株于裝有10 mL種子液培養(yǎng)基的試管中，180 r/min、28 ℃的搖床活化12 h，再轉(zhuǎn)接于裝有100 mL種子液培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，180 r/min、28 ℃二次活化12 h，得到目的菌株種子液，備用。

1.3.1.4 產(chǎn)酯酶菌株的復(fù)篩及粗酶液的制備

挑取單菌株接種于25 mL種子液培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，同上條件連續(xù)活化3 次，吸取0.8 mL活化液加入1 mL 40%甘油的甘油管中，于-80 ℃冰箱中保存，同時(shí)做好斜面保藏。轉(zhuǎn)接5 mL上述活化種子液于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)2 d后，吸取4 mL發(fā)酵液經(jīng)5 000 r/min離心10 min，將上清液（即為粗酶液）保存在4 ℃條件中，備用。

1.3.1.5 酯酶活力的測(cè)定

測(cè)定方法[23]：量取4 mL 3%聚乙烯醇-三丁酸甘油酯乳化液與5 mL磷酸緩沖溶液（0.025 mol/L、pH 7.5）于錐形瓶中混勻，置于40 ℃水浴鍋中預(yù)熱大約5 min，加入1 mL提前制備好的粗酶液反應(yīng)15 min后取出錐形瓶，繼續(xù)加入15 mL 95%乙醇溶液，滴加2～3 滴酚酞指示劑（5 g/L），使用NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05 mol/L）滴定（溶液由黃色變?yōu)闊o色，再變?yōu)榉奂t色，以溶液變?yōu)榉奂t色且30 s內(nèi)不褪色為滴定終點(diǎn)），同時(shí)空白組加入等量滅菌后的無菌水，按照實(shí)驗(yàn)組的步驟，對(duì)空白組進(jìn)行滴定，分別記錄消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積。酯酶活力計(jì)算公式如下：

式中：V1為實(shí)驗(yàn)組消耗的NaOH溶液體積/mL；V2為空白組消耗的NaOH溶液體積/mL；n為稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間/min。

酯酶活力定義：40 ℃、15 min水解4 mL 3%三丁酸甘油酯乳化液所需的酶量為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.2 菌株形態(tài)學(xué)觀察與生理生化鑒定

1.3.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察

將篩選出產(chǎn)酯酶活力最高的菌株接種至固體培養(yǎng)基中，35 ℃恒溫培養(yǎng)1 d。觀察菌落大小、顏色、表面形態(tài)、邊緣形狀、質(zhì)地等，并記錄觀察結(jié)果。革蘭氏染色后，使用光學(xué)顯微鏡觀察菌株形態(tài)。

取培養(yǎng)對(duì)數(shù)期的種子液，5 000 r/min離心5 min，收集足量離心菌體。加入2.5%的戊二醛溶液（與菌體的體積比為40∶1），4 ℃條件下固定4～12 h；再次離心，用0.1 mol/L的磷酸緩沖液混勻，5 min后，使用同上轉(zhuǎn)速清洗2～3 次，收集菌體；用體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇溶液逐級(jí)脫水，每次15 min，5 000 r/min離心5 min；用體積比1∶1的乙醇-叔丁醇置換2 次，每次離心20 min，最后加入等體積的叔丁醇混勻，放入-80 ℃冰箱冷凍12 h以上，并檢查是否完全干燥[24]。將生長(zhǎng)指數(shù)階段菌株樣品混勻呈粉末狀，取樣噴金，進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.2.2 菌株生理生化特征測(cè)定

參照第8版《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，對(duì)篩選的菌株進(jìn)行生理生化實(shí)驗(yàn)，確定菌株種屬。

1.3.2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

目的菌株在篩選培養(yǎng)基中分離純化得到單菌落，培養(yǎng)3 d后送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行菌種鑒定。菌株基因組DNA提取：菌株在篩選培養(yǎng)基上劃線至培養(yǎng)出單菌，培養(yǎng)3 d后，按照細(xì)菌基因組快速提取試劑盒操作說明書提取菌株S5-4 DNA。采用細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）對(duì)目的菌株的16S rDNA基因序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系：基因組DNA 1 μL、10×Buffer 5.01 μL、Taq聚合酶1 μL、dNTP 1.0 μL、引物1.5 μL、去離子水39 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終延伸7 min，循環(huán)35 次。取目的菌種純化后的PCR產(chǎn)物，使用ABI3730-XL測(cè)序儀進(jìn)行DNA測(cè)序，將拼接結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)搜索，選擇13 株同源性較高菌株的16S rDNA基因序列，用MEGAX軟件，依據(jù)MEGA中的模型查找選擇和距離評(píng)估后選擇最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[25]。

1.3.3 格氏乳球菌全基因組測(cè)序和注釋

1.3.3.1 基因組測(cè)序和組裝

目的菌株全基因組測(cè)序方法采用鳥槍法，該方法在Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)完成。所測(cè)得的數(shù)據(jù)使用Solexa管道計(jì)算Q值用于檢測(cè)數(shù)據(jù)的質(zhì)量，再FastQC對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估（堿基質(zhì)量和堿基含量）。為了去除帶接頭和低質(zhì)量的reads，采用AdapterRemoval[26]管道去除3’端的接頭污染，用SOAPec[27]管道基于K-mer頻率對(duì)所有reads進(jìn)行質(zhì)量校正，校正所采用的K-mer設(shè)置為17。基因組序列組裝采用A5-MiSeq[28]和SPAdes[29]管道對(duì)去除接頭序列的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行從頭拼裝，構(gòu)建contig和scaffold。對(duì)得到的拼裝結(jié)果進(jìn)行評(píng)估和比較，使用Pilon[30]軟件進(jìn)行堿基校正。

1.3.3.2 格氏乳球菌S5-4全基因組注釋和酯酶分析

使用CGView的循環(huán)基因組可視化工具進(jìn)行功能注釋[31]，以獲取該菌的全基因組信息，包括編碼蛋白質(zhì)的基因、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA（transfer tRNA，tRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）、開放閱讀框（open reading frame，ORF）等，并分析其GC含量。組裝后的基因組序列使用RAST和Cell-PLoc[32]工具注釋，得到基因組編碼蛋白信息和酶的亞細(xì)胞定位，將RAST注釋結(jié)果中的全基因組氨基酸序列文件通過KAAS注釋，根據(jù)注釋出的KO（KEGG Orthology）號(hào)在京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）中構(gòu)建目的菌株的代謝路徑[33]。在RAST的注解文件中，獲得酯酶的氨基酸序列；利用Gpos-mPLoc[32]軟件對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位，并結(jié)合ClustalOmega[34]和Espript3.0[35]的多片段比對(duì)，對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。在KOBAS-i中，用該菌株全因組測(cè)序文件對(duì)Exp-data Enrichment功能對(duì)重要代謝途徑進(jìn)行KEGG功能富集注釋[36]。找到目的菌株的中心碳代謝、氨基酸代謝和脂肪酸代謝，分析主要路徑中的生產(chǎn)酯類物質(zhì)的基因、酶和反應(yīng)。采用Blastp本地比對(duì)軟件，在TCDB數(shù)據(jù)庫中對(duì)格氏乳球菌轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行注釋[37]，從中選擇與乙酸、乳酸、乙醇等代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

1.3.4 菌株S5-4產(chǎn)酯化物代謝通路重建的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

菌株S5-4制備成種子液后，以5%接種量加入100 mL產(chǎn)酯培養(yǎng)基的厭氧瓶中。35 ℃厭氧發(fā)酵15 d后，用一次性的注射器吸取適量發(fā)酵液于0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾；取1 mL濾液裝于進(jìn)樣瓶中，加入10 μL乙酸正丁酯混勻，利用GC-MS法和內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定性定量檢測(cè)發(fā)酵液中乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯和己酸乙酯的情況。每個(gè)樣品3 組平行檢測(cè)。

GC條件：DB-WAX UI譜柱（30 mm×0.25 mm，0.25 μm），程序升溫40 ℃保持1 min，以20 ℃/min升高至150 ℃，再以10 ℃升高至250 ℃，保持2 min。分流比30∶1，載氣為氦氣（He），流速1 mL/min，氫氣（H2）40 mL/min，氧氣（O2）300 mL/min，檢測(cè)器為火焰離子檢測(cè)器。

MS條件：電子電離源，傳輸線溫度250 ℃，電子能量為70 eV，光電倍增管電壓為350 V，質(zhì)量掃描范圍為30～350 u。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

圖片合成和代謝途徑由Adobe Illustrator CS6完成。柱狀圖使用Origin 2021制作。GC-MS原始譜圖采用Thermo Scientific Xcalibur進(jìn)行峰提取和匹配。

2 結(jié)果與分析

2.1 大曲中產(chǎn)酯酶細(xì)菌的初篩

采用傳統(tǒng)的稀釋涂布法，富集液被涂布于三丁酸甘油酯篩選平板上，酯酶與三丁酸甘油酯反應(yīng)形成的透明圈大小代表菌株的酯酶活力高低。初篩共計(jì)篩選出50 株產(chǎn)酯酶的菌株。結(jié)果如圖1所示，產(chǎn)酯酶菌株的D/d值在1.05～2.27，其中最高的11 株產(chǎn)酯酶菌株的D/d為1.35～2.27，菌株S5-4的D/d值最高，為2.27±0.02。

圖1 產(chǎn)酯酶細(xì)菌D/d值Fig.1 D/d ratio of esterase-producing strains

2.2 產(chǎn)酯酶細(xì)菌的復(fù)篩

對(duì)初篩結(jié)果中D/d值較大的菌株按照1.3.1.5節(jié)中的方法進(jìn)行酯酶活力的測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表1所示，菌株產(chǎn)酯酶活力在10.75～15.74 U/mL，且與初篩時(shí)的D/d值較為對(duì)應(yīng)。菌株S5-4的酯酶活力最高，為（15.74±0.03）U/mL。后續(xù)實(shí)驗(yàn)確定以菌株S5-4為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定。

表1 產(chǎn)酯酶細(xì)菌D/d及其活力Table 1 D/d ratio and esterase activity of 11 selected isolates

2.3 產(chǎn)酯酶細(xì)菌的鑒定

2.3.1 菌株S5-4的形態(tài)觀察

在三丁酸甘油酯平板上培養(yǎng)1 d后，菌株S5-4的菌落呈乳白色，表面光滑，菌落規(guī)則，邊緣整齊，中間低凸起，菌落周圍與邊緣顏色一致，半透明，質(zhì)地濕潤(rùn)黏稠（圖2a）。經(jīng)過革蘭氏染色，于100（物鏡）×10（目鏡）倍光學(xué)顯微鏡下觀察，菌株S5-4呈革蘭氏陽性（紫色），圓球狀，無芽孢（圖2b）。用掃描電子顯微鏡放大1 000 倍觀察菌株S5-4，菌體形態(tài)顯示為球狀或球桿狀，排列方式為散落、成對(duì)或成短鏈，兩端鈍圓，部分兩端稍尖，無夾膜和芽孢（圖2c）。

圖2 菌株S5-4形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of strain S5-4

2.3.2 菌株S5-4的生理生化鑒定

對(duì)菌株S5-4進(jìn)行伯杰氏手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)的生理生化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示，發(fā)現(xiàn)菌株S5-4的甲基紅試驗(yàn)、D-葡萄糖試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)均為陽性；吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)均為陰性。依據(jù)菌株形態(tài)觀察、顯微鏡觀察和生理生化鑒定，確認(rèn)菌株S5-4為L(zhǎng)actococcus屬。

表2 菌株S5-4的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical identification results of strain S5-4

2.3.3 菌株S5-4的分子生物學(xué)鑒定

為研究菌株S5-4系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA X計(jì)算機(jī)軟件的ML法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果如圖3所示，菌株S5-4與格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）的系統(tǒng)發(fā)育分支最相近；結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化實(shí)驗(yàn)和掃描電子顯微鏡觀察的菌株形態(tài)，最終確定菌株S5-4為格氏乳球菌，將其命名為L(zhǎng).garvieaeS5-4。本實(shí)驗(yàn)中篩選出的L.garvieaeS5-4已保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)：GDMCC No:63054。

圖3 菌株S5-4基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain S5-4

2.4 格氏乳球菌S5-4基因組測(cè)序與功能注釋

通過Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)目的菌株進(jìn)行了全基因組測(cè)序，利用FastQC對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，結(jié)果表明每個(gè)reads的單堿基質(zhì)量都在36以下，4 種堿基的分布線平行且接近，高質(zhì)量reads占總reads 98.05%，含有1 235 034 660 bp。對(duì)所有高質(zhì)量reads進(jìn)行基因組組裝，得到45 個(gè)Contig，共2 191 113 bp序列信息，用于衡量基因組拼接效果的N50大小是148 761 bp。目的菌株基因組通過RAST和CGView基因組注釋顯示GC平均相對(duì)含量37.99%，包括1 486 個(gè)基因，其中包含4 個(gè)rRNA、69 個(gè)tRNA和34 個(gè)非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）基因（圖4、表3）。同時(shí)，通過RAST注釋基因組中酯酶的信息，并對(duì)酯酶進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)其中酯酶主要包括磷酸酯酶（胞內(nèi)酶5 個(gè)和細(xì)胞膜酶2 個(gè)）、酰基輔酶A脫酰酶（胞內(nèi)酶）、丙酸三酯酶（胞外酶）、羧酸酯酶（胞外酶）和木聚糖酯酶（胞內(nèi)酶）。通過酯酶蛋白序列比較，發(fā)現(xiàn)格氏乳球菌丙酸三酯酶序列明顯不同于酵母和霉菌（圖5），與霉菌酯酶的系統(tǒng)發(fā)育樹分支相距較遠(yuǎn)，但它在親緣分布關(guān)系上與酵母酯酶更為接近（圖6）。

表3 L.garvieae S5-4基因組注釋信息表Table 3 Genome annotation of L.garvieae S5-4

圖4 L.garvieae S5-4基因組信息圖Fig.4 Genome map of L.garvieae S5-4

圖5 格氏乳球菌和酵母菌、霉菌的酯酶序列比對(duì)Fig.5 Alignment of esterase gene sequences from L.garvieae,yeast and mold species

圖6 格氏乳球菌與霉菌、酵母菌的酯酶蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree based on esterase protein sequences from L.garvieae,molds,and yeasts

使用KAAS注釋基因組信息構(gòu)建L.garvieaeS5-4的代謝路徑，主要包括碳水化合物代謝（140）、氨基酸代謝（48）、核苷酸代謝（47）和輔酶和維生素代謝（38），這些不同途徑的聚類被展示在圖7中。通過KEGG重建該菌利用半乳糖和淀粉作為碳源合成乙酸乙酯和乳酸乙酯的途徑（圖8）。L.garvieaeS5-4能夠利用異淀粉酶（胞外酶）、α-淀粉酶（胞內(nèi)酶）和糊精轉(zhuǎn)糖基化酶（胞內(nèi)酶）水解淀粉生產(chǎn)葡萄糖。葡萄糖通過糖酵解代謝途徑，在糖酵解過程中被分解成丙酮酸。丙酮酸可以通過不同的途徑轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸以及乙醇，其中乳酸是在乳酸脫氫酶（EC：1.1.1.27）的作用下合成，乙酸則需要經(jīng)過丙酮酸氧化酶（EC：1.1.3.3）和乙酸激酶（EC：2.7.2.1）合成，而乙醇則需要經(jīng)過磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶（EC：2.3.1.8）、乙醛脫氫酶（EC：1.2.1.10）和乙醇脫氫酶（EC：1.1.2.8）合成。乳酸、乙酸和乙醇分別通過乳酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TC：1.A.14.2.2）、乙酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TC：3.B.1.1.1）和乙醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（TC：3.A.1.103.5）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外，在羧酸酯酶（胞外酶）的作用下生成乳酸乙酯和乙酸乙酯。格氏乳球菌乳酸乙酯和乙酸乙酯的代謝合成路徑的解析對(duì)于進(jìn)一步開發(fā)該菌在白酒中的應(yīng)用提供了依據(jù)。

圖7 L.garvieae S5-4各類功能KEGG富集圖Fig.7 KEGG enrichment map for various functional categories of L.garvieae S5-4

圖8 格氏乳球菌的代謝路徑Fig.8 Metabolic pathways of L.garvieae

2.5 菌株S5-4厭氧發(fā)酵產(chǎn)酯

將L.garvieaeS5-4制備成種子液，厭氧發(fā)酵15 d后，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果表明，乙酸乙酯產(chǎn)量為（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯產(chǎn)量為（0.298 3±0.230 0）g/L。程偉等[38]從白酒釀造過程中篩選的酵母菌產(chǎn)乙酸乙酯量為0.248 9 g/L，與之相比較，L.garvieaeS5-4通過厭氧發(fā)酵產(chǎn)酯量提高了38.6%。根據(jù)菌株純培養(yǎng)結(jié)果也驗(yàn)證了對(duì)L.garvieaeS5-4代謝路徑酯合成產(chǎn)物的分析，它能夠利用自身的合成乙酸、乙醇和乳酸生成乙酸乙酯和乳酸乙酯。

3 討論

以往的研究多集中于產(chǎn)酯酶微生物的發(fā)酵條件和酶學(xué)性質(zhì)[39]，但很少?gòu)娜蚪M層面和代謝途徑上解析它們的機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)從基因組信息注釋和代謝路徑上分析了L.garvieaeS5-4生產(chǎn)酯類化合物的機(jī)理，進(jìn)一步了解酯酶的代謝特性。通過對(duì)該菌株代謝路徑的重建及驗(yàn)證分析，發(fā)現(xiàn)它能夠以半乳糖和淀粉為碳源在細(xì)胞內(nèi)生產(chǎn)乙酸、乙醇和乳酸和在細(xì)胞外合成乙酸乙酯和乳酸乙酯。目前已有研究表明，在窖泥和大曲中初篩細(xì)菌酯酶活力最高分別能達(dá)到10.43 U/mL[22]和12.52 U/mL[40]，本實(shí)驗(yàn)初步篩選出的L.garvieaeS5-4菌株，其酯酶活力可達(dá)15.74 U/mL。在后續(xù)的研究中，還可以利用正向突變技術(shù)，對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化（如溫度、pH值、接種量、培養(yǎng)時(shí)間等），提高酯酶活性，并對(duì)其代謝途徑進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而提高酯類化合物的產(chǎn)量。

酯類化合物的含量是白酒風(fēng)味物質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，主要包括己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯[41]。前期研究中，霉菌、酵母菌和一些細(xì)菌被作為篩選酯酶的對(duì)象，通過增加產(chǎn)酯酶的效率來提升大曲的質(zhì)量和白酒的香味[42]。本實(shí)驗(yàn)將產(chǎn)酯酶L.garvieaeS5-4菌株作為篩選對(duì)象，用于發(fā)酵過程中，以提高發(fā)酵液的酯含量。與霉菌、酵母菌相比，它的生產(chǎn)周期較短，與其他細(xì)菌相比，它的酯酶活力較高，在提高白酒中酯類物質(zhì)含量方面有較大應(yīng)用價(jià)值。此外，還可以將其接種于白酒發(fā)酵過程產(chǎn)生的副產(chǎn)物（酒糟和黃水）中進(jìn)行二次發(fā)酵[43]，生產(chǎn)酯類化合物，從而提升白酒的口感和質(zhì)量[20]。因此，篩選具有較高酯酶活性的細(xì)菌并利用這些副產(chǎn)物資源生產(chǎn)酯類化合物對(duì)白酒生產(chǎn)具有一定的科學(xué)研究意義和經(jīng)濟(jì)效益。

從濃香型白酒大曲中篩選出了1 株具有較強(qiáng)酯酶活性的菌株S5-4，產(chǎn)酯酶活力達(dá)到15.74 U/mL，經(jīng)鑒定為格氏乳球菌（L.garvieae）?；蚪M注釋顯示，該菌株能夠合成磷酸酯酶、?；o酶A脫酰酶、丙酸三酯酶、羧酸酯酶和木聚糖酯酶，根據(jù)酯酶編碼基因設(shè)計(jì)和構(gòu)建基因工程策略或調(diào)控酯酶活性相關(guān)的代謝通路中關(guān)鍵酶提高該菌株的酯酶活性。代謝途徑構(gòu)建顯示，S5-4菌株具有利用淀粉和乳糖合成乳酸、乙酸和乙醇的能力，并能在酯酶作用下合成乳酸乙酯和乙酸乙酯。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)證實(shí)該菌乙酸乙酯產(chǎn)量為（0.345 0±0.160 0）g/L，乳酸乙酯產(chǎn)量為（0.298 3±0.230 0）g/L。本研究為L(zhǎng).garvieaeS5-4的生理特性研究和進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供了參考。