訾 靜，王 琰，李亮亮，張 琨，萬 一,*

（1.陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省科學(xué)院，秦嶺天然產(chǎn)物工程中心，陜西 西安 710043；3.西安理工大學(xué)理學(xué)院，陜西 西安 710054）

林麝是珍貴的野生藥用資源動物，已被列為國家一級重點保護野生動物[1]。隨著人類對生態(tài)環(huán)境的破壞及對林麝的過度捕殺，野麝資源瀕臨滅絕，人工養(yǎng)麝是保護野生麝資源的有效途徑，因此，做好圈養(yǎng)麝的疾病防治十分重要[2]。在林麝養(yǎng)殖群體中，高發(fā)病率和死亡率的化膿性疾病和腸炎性疾病一直是人工養(yǎng)殖規(guī)模擴大的重要制約因素[3]。通過對患有化膿病林麝個體的膿液進行病原菌分離鑒定，發(fā)現(xiàn)死亡個體體內(nèi)膿液病原菌主要包括化膿隱秘桿菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌等，尤其是化膿隱秘桿菌陽性檢出率高達(dá)60%以上[4-5]?？股亟?jīng)常被用來治療這類疾病。然而，抗生素的過度使用可能會導(dǎo)致動物腸道微生物組產(chǎn)生耐藥性[6]。因此，本研究通過從健康的林麝腸道中分離乳酸菌用于開發(fā)益生菌制劑，以期預(yù)防疾病和改善林麝健康狀況。

乳酸菌可以顯著改善動物胃腸道的微生物群落生態(tài)系統(tǒng)平衡，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)（如有機酸、細(xì)菌素等）和抗菌活性而被廣泛用于食品工業(yè)，用于改善動物和人類健康[7-8]。根據(jù)前人研究報道，從健康動物腸道中分離出的乳酸菌能抑制多種致病菌的生長，包括產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、福氏志賀菌、鼠傷寒沙門氏菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌等[9-10]。乳酸菌是否能作為益生菌，需要根據(jù)現(xiàn)有益生菌選擇標(biāo)準(zhǔn)和評價規(guī)程對其進行安全性評估，包括對胃腸道環(huán)境的酸耐受性和膽鹽耐受性；可黏附定植于腸道上皮；對常見病原菌具有一定的抑制能力；對抗生素的耐藥性以及不能攜帶可轉(zhuǎn)移的耐藥基因等[11]。

目前國內(nèi)外關(guān)于林麝腸道中乳酸菌分離及益生特性的報道較少，僅有四川農(nóng)業(yè)大學(xué)Luo Yan等[12]從健康林麝糞便中分離乳酸菌，進行耐酸耐膽鹽、抗生素耐藥性及抑菌活性研究。針對林麝腸道中乳酸菌的菌體表面特性、抗藥性基因型分析以及生長特性的研究鮮見報道。本研究從健康林麝糞便中分離鑒定乳酸菌，以商品化副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L22為陽性對照，測試分離株的耐酸和耐膽鹽、抗菌活性、自聚集和疏水性、抗生素敏感性，進一步對篩選的分離株進行抗性基因分析和生長曲線測定。另外，本研究檢測了分離株對一株化膿隱秘桿菌（Arcanobacterium pyogenes）LSN3（從林麝腸道化膿樣本中分離，GenBank登錄號OQ179914）的拮抗活性，以期篩選出具有良好抗菌活性的菌株，為開發(fā)適合林麝專用的益生菌制劑提供理論基礎(chǔ)和可靠的菌株來源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究所用的新鮮健康林麝糞便均在陜西鳳縣林麝繁育中心采集。共收集55 頭不同年齡的林麝糞便樣品，麝齡為0.5～10.5 歲。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus saureus）ATCC 25923、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1、腸炎沙門氏菌（Salmonella enterica）ATCC 13076均購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；化膿隱秘桿菌（A.pyogenes）LSN3、商品化副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）L22由本實驗室分離保存。

改良MRS培養(yǎng)基：在MRS肉湯培養(yǎng)基礎(chǔ)上，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%半胱氨酸鹽酸鹽和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4% LiCl。

MRS肉湯培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；牛膽鹽 上海麥克林生化科技有限公司；抗生素藥敏試紙杭州濱和微生物試劑有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1510型分光光度計 賽默飛世爾科技有限公司；1580R高速冷凍離心機 基因科技（上海）有限公司；LDZM-80KCS-II型全自動滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ超凈工作臺 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；GHP-9080型隔水式培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；T100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株培養(yǎng)、純化及分離

取健康林麝的新鮮糞便5 g接種于改良MRS液體培養(yǎng)基中，振蕩混勻，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。將富集菌液用無菌生理鹽水稀釋，分別吸取100 μL稀釋梯度為10-4、10-5和10-6的稀釋液涂布于改良MRS固體平板，37 ℃培養(yǎng)24～48 h至長出單菌落，挑選具有乳酸菌形態(tài)的單菌落，連續(xù)轉(zhuǎn)接于改良MRS固體培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)3 次后，挑取純的單菌落于MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)物進行革蘭氏染色和過氧化氫酶反應(yīng)測定。將純化后的菌株加入體積分?jǐn)?shù)30%的滅菌甘油中，于-80 ℃保藏備用。

1.3.2 16S rDNA基因擴增及序列分析

取甘油菌20 μL 接種至9 mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中充分活化，取1 mL 菌液6 000×g離心5 min，收集菌體，根據(jù)細(xì)菌DNA 提取試劑盒方法提取菌體DNA。以提取的DNA 為模板，利用PCR 技術(shù)擴增16S rDNA序列，選用16S rDNA通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）進行PCR擴增。反應(yīng)體系為50 μL：2×TaqMaster Mix (Dye Plus)25 μL、上下游引物各1.5 μL、DNA模板（20 ng/μL）2.0 μL，ddH2O補足50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，進行34 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。所得序列提交GenBank進行BLAST比對分析，并下載相似性最高的模式菌株序列，利用MEGA 6.0軟件進行多序列對比，構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹（No.of Bootstrap Replications＝1 000），初步確定菌株分類地位。

1.3.3 菌株耐酸和耐膽鹽能力測定

耐酸和耐膽鹽測定參照Manzoor等[13]方法。將活化后的菌液（108CFU/mL）按體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，6 000×g離心5 min，收集菌體，用滅菌的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.1 mol/L、pH 7.2）將菌體洗滌2 次后重懸于PBS中。取1 mL菌懸液分別接種至9 mL的MRS培養(yǎng)基（用1 mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)pH值分別為2、3和4；或者加入牛膽鹽分別至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%和1.0%），37 ℃培養(yǎng)4 h，分別在0 h和4 h用平板計數(shù)法測定活菌數(shù)，存活率計算公式如下：

式中：N0和Nt分別代表菌株處理前（0 h）和處理后（4 h）的菌落數(shù)。

1.3.4 菌株上清液抑菌能力測定

菌株上清液對致病菌的抑制作用采用牛津杯法[14]。取甘油菌接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，10 000×g離心10 min，上清液經(jīng)濾膜（0.22 μm）過濾收集。病原菌選取大腸埃希氏桿菌（E.coli）ATCC 25922、金黃色葡萄球菌（S.saureus）ATCC 25923、銅綠假單胞菌（P.aeruginosa）PAO1、腸炎沙門氏菌（S.enterica）ATCC 13076和化膿隱秘桿菌（A.pyogenes）LSN3，在平板底部傾倒薄層水瓊脂，將致病菌分別接種于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)16 h，取0.1 mL的菌液（108CFU/mL）涂布于LB固體培養(yǎng)基表面。在平板中均勻地放置滅菌的牛津杯，吸取0.1 mL待測菌上清液于牛津杯中，室溫靜置3～5 h，然后37 ℃培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈大小。

1.3.5 菌株自聚集能力測定

菌株自聚集能力的測定參考Polak-Berecka等[15]方法。將活化后的菌液（108CFU/mL）接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，6 000×g離心10 min，沉淀用無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次后重懸于無菌PBS中，調(diào)整菌懸液的OD600在0.50±0.05范圍內(nèi)。吸取4 mL已調(diào)整OD600的菌懸液加入試管中，靜置于室溫下6 h測定該菌懸液的OD600。自聚集率計算公式如下：

式中：OD0為0 h的OD600值；OD1為靜置6 h的OD600值。

1.3.6 菌株表面疏水性測定

采用Crow等[16]描述的方法，以氯仿為有機溶劑測定菌株表面疏水性。將活化后的菌液（108CFU/mL）接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)16 h，6 000×g離心10 min，沉淀用無菌PBS（pH 7.2）洗滌2 次后重懸于無菌PBS中，調(diào)整菌懸液的OD600在0.50±0.05范圍內(nèi)。吸取3 mL已調(diào)整OD600的菌懸液與1 mL氯仿渦旋混合30 s，停頓10 s后振蕩30 s，并于室溫靜置30 min。取上層水相，以PBS為空白對照，在波長600 nm處測量OD值。表面疏水率計算公式如下：

式中：OD0為0 h的吸光度；OD1為靜置30 min后的OD600值。

1.3.7 菌株對抗生素耐藥性測定

分離株對抗生素的耐藥性檢測采用藥敏紙片瓊脂擴散法[17]。取9 種抗生素包括哌拉西林（100 μg）、氨芐西林（10 μg）、頭孢曲松（30 μg）、鏈霉素（10 μg）、四環(huán)素（30 μg）、氯霉素（30 μg）、紅霉素（15 μg）、環(huán)丙沙星（5 μg）和萬古霉素（30 μg）。吸取0.1 mL菌懸液（108CFU/mL）涂布到MRS瓊脂培養(yǎng)基表面，待完全吸收后，將藥敏紙片貼放表面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后測量并記錄抑菌圈直徑。根據(jù)抑菌圈直徑大小將每個分離株的耐藥性分為耐藥（R）、敏感（S）或中介（I），評價標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（2014年）進行[18]。

1.3.8 乳酸菌抗藥性的基因型分析

根據(jù)文獻(xiàn)報道的乳酸菌常見抗生素抗性基因特異性引物，對篩選出的6 株乳酸菌的抗藥性基因：環(huán)丙沙星抗性基因gyrA、parC；萬古霉素抗性基因vanE、vanA、vanX；鏈霉素抗性基因ant6、aadA和aadE進行PCR擴增并分析，所使用的引物序列及退火溫度見表1。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 抗藥性基因特異性引物及PCR條件Table 1 Specific primers and PCR conditions for amplification of antibiotic resistance genes

1.3.9 菌株生長曲線測定

將活化后的菌液（108CFU/mL）按體積分?jǐn)?shù)1%接種量接種于50 mL MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每隔2 h取樣測定發(fā)酵液的OD600。以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)，OD600為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。同時測定24 h后的菌液pH值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05表示差異顯著。全部實驗均重復(fù)3 次，結(jié)果用表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)和鑒定結(jié)果

從健康林麝糞便樣品中分離菌株，經(jīng)純化后在MRS培養(yǎng)基上菌落形態(tài)呈白色且表面光滑。經(jīng)革蘭氏染色后，得到12 株革蘭氏陽性菌，所有菌株過氧化氫酶反應(yīng)均呈陰性。菌株經(jīng)過16S rDNA序列測序后，提交NCBI進行BLAST比對，申請基因登錄號（表2）。使用MEGA 6.0軟件對菌株16S rDNA序列和模式株序列進行多序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖1。結(jié)果表明，12 株菌經(jīng)序列比對可明確分為6 種，其中SX129、SX130、SX137、SX140和SX141與植物乳植桿菌（L.plantarum）親緣關(guān)系最近；SX115、SX61和SX142與屎腸球菌（Enterococcus faecium）親緣關(guān)系最近；SX45、SX100、SX78和SX131分別與耐久腸球菌（E.durans）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和短乳桿菌（L.brevis）的親緣關(guān)系最近，序列相似性均高于99%。

圖1 基于菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rDNA gene sequences

表2 篩選出的12 株乳酸菌屬16S rDNA序列相似性比對Table 2 Similarity analysis of bacterial 16S rDNA sequences of12 lactic acid bacterial isolates

2.2 菌株耐酸和耐膽鹽能力

12 株乳酸菌在不同pH值條件下的存活率結(jié)果見圖2A。隨著pH值的降低，菌株的存活率也隨之降低。所有菌株均能在pH 4條件下生長，5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌存活率達(dá)88.5%以上；在pH 3條件下，該6 株菌存活率達(dá)84%以上；在pH 2條件下，僅6 株菌存活率在33%～37%之間，其余均在30%以下。所有菌株在pH 4和pH 3（除SX100以外）條件下，存活率與對照菌相比無顯著性差異，在pH 2條件下，有2 株菌（SX61和SX78）存活率與對照菌相比有顯著性差異（P＜0.05）。

圖2 不同條件下乳酸菌株的存活率Fig.2 Survival rates of lactic acid bacterial strains under different conditions

12 株乳酸菌在不同膽鹽環(huán)境中的存活率結(jié)果見圖2B。所有菌株能耐受質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%的膽鹽環(huán)境。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽鹽環(huán)境中，5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌存活率在87%以上。所有菌株中SX140存活率最高，達(dá)91.3%，SX61存活率最低為81.2%。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，有6 株菌的存活率在80%以上，其中植物乳植桿菌存活率較高，在86.0%～89.5%之間，SX45存活率最低，為70%。所有菌株在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%膽鹽環(huán)境中，存活率與對照菌相比無顯著性差異（P＞0.05），在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，4 株菌（SX78、SX100、SX142和SX45）存活率與對照菌相比有顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 菌株上清液抑菌能力

12 株乳酸菌對常見病原菌的抑菌活性檢測結(jié)果見表3。5 株植物乳植桿菌和乳酸片球菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和腸炎沙門氏菌表現(xiàn)出較好的拮抗活性（抑菌圈直徑17.20～20.19 mm），對化膿隱秘桿菌LSN 3 的抑菌活性（抑菌圈直徑14.23～15.53 mm）優(yōu)于對照菌株L22（抑菌圈直徑10.05 mm）。其他6 株分離菌對銅綠假單胞菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑為12.88～14.98 mm，對腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和化膿隱秘桿菌的抑菌圈直徑為9.05～12.46 mm。

表3 12 株乳酸菌對病原指示菌抑菌活性測定Table 3 Inhibitory activities of 12 lactic acid bacterial isolates against pathogenic indicators

2.4 菌株自聚集能力和表面疏水性

12 株乳酸菌自聚集性以及對氯仿的表面疏水性檢測結(jié)果如圖3所示。9 株分離株自聚集率在50.9%～56.8%之間，其中5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌自聚集率在53.1%～56.2%之間；其余3 株菌自聚集率在39.1%～48.9%之間。所有分離株自聚集能力與對照菌相比無顯著性差異（P＞0.05），表現(xiàn)出與對照菌相當(dāng)?shù)淖跃奂浴?2 株分離株中有7 株表面疏水率在52.4%～56.0%之間，其中植物乳植桿菌和乳酸片球菌表面疏水率在52.9%～ 56.0%之間。表面疏水率最高的是SX140（56.0%），最低的是SX100（25.9%），3 株菌（SX131、SX45和SX100）表面疏水性與對照菌相比差異顯著（P＜0.05）。

圖3 12 株乳酸菌的自聚集率和表面疏水率Fig.3 Auto-aggregation capacity and surface hydrophobicity of12 lactic acid bacterial strains

2.5 菌株對抗生素耐藥性

12 株乳酸菌對9 種常用抗生素的耐藥性檢測結(jié)果見表4。所有菌株對鏈霉素耐藥，11 株菌對環(huán)丙沙星耐藥，9 株菌對萬古霉素耐藥。植物乳植桿菌和乳酸片球菌分別對6 種和5 種抗生素敏感或中度耐藥。有4 株菌對哌拉西林耐藥。耐久腸球菌對9 種抗生素耐藥，對頭孢曲松和紅霉素中度耐藥。

表4 12 株乳酸菌對不同抗生素的敏感性Table 4 Susceptibility of 12 lactic acid bacterial strains to different antibiotics

2.6 乳酸菌抗藥性的基因型分析

根據(jù)特異性引物利用PCR技術(shù)對篩選獲得的6 株乳酸菌的抗生素抗性基因進行分析，雖然所有菌株表現(xiàn)為環(huán)丙沙星和鏈霉素抗性，但這些菌株都不攜帶這兩種抗生素的抗性基因。6 株乳酸菌中均檢測出對萬古霉素的抗藥性基因vanX，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖4。

圖4 PCR擴增植物乳植桿菌和乳酸片球菌中萬古霉素的抗藥性基因vanXFig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified vanX gene from selected L.plantarum and P.acidilactici isolates

2.7 菌株生長曲線

根據(jù)益生特性實驗結(jié)果，對益生潛力最大的6 株菌的生長曲線進行測定，結(jié)果見圖5。5 株植物乳植桿菌生長情況相似，培養(yǎng)基OD600值皆于接種后4 h快速上升，進入對數(shù)生長期。接種后10 h進入細(xì)菌生長穩(wěn)定期，24 h后的OD600達(dá)9.0～9.7。乳酸片球菌SX78在接種4 h后進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)至12 h后進入生長穩(wěn)定期，24 h后的OD600達(dá)7.1。

圖5 植物乳植桿菌和乳酸片球菌生長曲線Fig.5 Growth curves of the selected L.plantarum and P.acidilactici isolates

3 討論

本研究從林麝糞便樣品中篩選獲得12 株乳酸菌，通過細(xì)胞個體形態(tài)特征和16S rDNA序列分析鑒定，包括4 個屬、6 個種，其中植物乳植桿菌5 株，屎腸球菌3 株，乳酸片球菌、腸膜明串珠菌、耐久腸球菌和短乳桿菌各1 株，隨后對分離株進行體外益生性能評價，包括耐受性、抗病原菌活性、抗生素敏感性和菌體表面特性（菌體自聚集能力和表面疏水性）。

潛在益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)之一是能適應(yīng)胃腸道中的苛刻環(huán)境（胃酸的低pH值以及小腸膽鹽形成的高滲透壓環(huán)境），這迫使益生菌必須具有耐酸和耐膽鹽能力才能在腸道中存活[25]。許多研究認(rèn)為pH 2～3是研究益生菌菌株耐酸性的最適pH值[26]。動物膽汁濃度是不恒定和不可預(yù)測的，往往隨著飲食的改變而改變，一般選擇膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.3%～1.0%范圍內(nèi)[27]。結(jié)合Luo Yan等[12]對林麝乳酸菌的研究報道，本研究采用pH 2、3和4考察菌株的耐酸能力，采用膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%和1.0%作為考察菌株耐膽鹽的指標(biāo)。結(jié)果表明，所有乳酸菌對低pH值（pH 3和pH 4）和膽鹽（0.5%和1.0%）均具有良好的耐受性，表現(xiàn)出不同的存活率，說明乳酸菌的耐受能力具有菌株特異性[28]。植物乳植桿菌和乳酸片球菌在pH 3的環(huán)境中，存活率分別最高達(dá)90.5%和89.5%。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.0%膽鹽環(huán)境中，存活率分別最高達(dá)89.5%和73.5%，高于之前報道的乳酸菌在相同條件下的存活率[12,25,28-29]。所有分離株在pH 2的環(huán)境下存活率大幅下降，這與前人報道的“許多益生菌在pH 2或更低的條件下，菌株的存活率顯著下降”這一結(jié)果[29]相似。

體外對致病菌的抗菌活性被認(rèn)為是益生菌的重要益生特性。本研究評價12 株乳酸菌對常見腸道病原菌的抑菌活性。植物乳植桿菌和乳酸片球菌上清液對5 種病原菌均表現(xiàn)出抗菌作用，其中對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的抑菌性（抑菌圈直徑＞16 mm）優(yōu)于先前的報道[12,25,30]。短乳桿菌、腸球菌和腸膜明串珠菌對病原菌的抗菌活性較弱，或者無抑菌活性。所有的菌株上清液被中和后（pH 6），抗菌活性大幅降低（數(shù)據(jù)沒有列出），說明分離株的抑制特性主要歸因于有機酸的產(chǎn)生。本研究首次報道了植物乳植桿菌和乳酸片球菌對林麝源化膿隱秘桿菌具有一定程度的抑制作用，抑制效果優(yōu)于其他菌株，這可能與其發(fā)酵pH值有關(guān)。植物乳植桿菌和乳酸片球菌在培養(yǎng)24 h后pH值在3.8～3.9，其他幾株分離株pH值在4.0～4.5。Luo Yan等[12]研究報道乳酸菌的抑菌活性與其發(fā)酵pH值有關(guān)，其發(fā)酵pH值越低，抑菌活性越強。

細(xì)菌的黏附能力被認(rèn)為是益生菌選擇的重要標(biāo)準(zhǔn)[31]。盡管在本研究中沒有直接探究乳酸菌對上皮細(xì)胞的黏附能力，但通過自聚集能力和疏水特性來間接評估其黏附能力。益生菌的自聚集能力影響其對腸上皮細(xì)胞的黏附[32]。本研究測定植物乳植桿菌、腸球菌和乳酸片球菌在6 h后，自聚集率達(dá)到了50.9%～56.8%，與之前報道的結(jié)果[10]相似。疏水性使得益生菌與宿主上皮細(xì)胞之間的相互作用增加[31]。本研究通過與氯仿的相互作用模擬黏附于腸上皮細(xì)胞的能力。參照Lu Youyou等[33]報道對疏水性程度的劃分標(biāo)準(zhǔn)，12 株分離菌中有7 株表面疏水率在52.4%～56.0%之間，表明它們可能具有較高的黏附性，這是菌株能夠發(fā)揮其潛在功能的重要前提。其中植物乳植桿菌的疏水率最高達(dá)56%，其次為屎腸球菌（53.5%）和乳酸片球菌（52.9%），這與之前文獻(xiàn)報道乳酸菌的疏水率在60%[33]結(jié)果相似。結(jié)合自聚集能力評估結(jié)果，推斷植物乳植桿菌、屎腸球菌和乳酸片球菌可能具有較高的黏附活性，易黏附于腸道細(xì)胞發(fā)揮益生作用。

益生菌的一個重要安全要求就是不可攜帶可轉(zhuǎn)移抗性基因，因此益生菌的候選菌株必須鑒定其抗生素敏感性，并有必要進行抗性基因的測定和可轉(zhuǎn)移性分析[34]。本研究評價了12 株乳酸菌對9 種抗生素的耐藥性。大部分菌株表現(xiàn)出對鏈霉素、環(huán)丙沙星和萬古霉素高耐藥性，這與之前報道的結(jié)果[10,29]相似。4 株腸球菌對6 種抗生素的敏感性存在較大差異，說明腸球菌對抗菌藥物的敏感性具有種屬依賴性[12]。先前研究表明，屎腸球菌對萬古霉素具有高耐藥性[12]，但本研究測試的3 株屎腸球菌對萬古霉素呈現(xiàn)中度耐藥。結(jié)合體外益生菌評價實驗的結(jié)果，本研究篩選出具有良好益生潛力的5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌作為益生菌候選菌株，進一步對這6 株乳酸菌進行抗藥性基因分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗性表型與基因型差異很大，盡管菌株表現(xiàn)出對環(huán)丙沙星和鏈霉素的抗性，但是沒有擴增到環(huán)丙沙星和鏈霉素的抗性基因，說明這些乳酸菌表現(xiàn)出的抗性屬于固有抗性，其抗性產(chǎn)生可能與細(xì)胞膜對該抗生素的低滲透性有關(guān)[30,33]，一般這類抗性是安全的，不發(fā)生基因轉(zhuǎn)移。此外，篩選出的6 株乳酸菌均檢測出萬古霉素抗性基因vanX，這與之前報道的vanX基因廣泛存在于乳酸菌中結(jié)論一致[35]。有研究表明，vanX基因負(fù)責(zé)編碼蛋白D,D-二肽酶，導(dǎo)致肽聚糖前體的合成終止于D-丙氨酸-D-乳酸而不是D-丙氨酸-D-丙氨酸，從而消除藥物靶點[36]。這種耐藥性通常是染色體編碼的，被認(rèn)為是固有耐藥，它們的基因已經(jīng)被證明是不可轉(zhuǎn)移的[37]。

此外，對篩選出的6 株乳酸菌在MRS肉湯培養(yǎng)基中的生長曲線進行測定。結(jié)果表明，乳酸菌在接種4 h進入對數(shù)生長期，10～12 h后進入穩(wěn)定期，這與前人報道[38]基本一致。值得注意的是，本實驗測定的植物乳植桿菌和乳酸片球菌在培養(yǎng)24 h后的OD600分別達(dá)9.0和7.1左右，高于文獻(xiàn)報道的從其他動物腸道中分離的乳酸菌生長OD600值（3.0～4.0）[39-40]，這可能和菌株來源不同有關(guān)，說明林麝腸道中的植物乳植桿菌和乳酸片球菌具有快速生長的特點。

4 結(jié)論

本研究從林麝糞便中分離篩選出12 株乳酸菌，采用16S rDNA測序?qū)θ樗峋M行種水平鑒定。以現(xiàn)有的商品化益生菌作為對照，通過耐酸耐膽鹽能力、抗生素敏感性、拮抗活性、自聚集能力和細(xì)胞表面疏水性等益生特性研究，篩選出5 株植物乳植桿菌和1 株乳酸片球菌，它們具有較好的益生特性和快速生長的特點，但還需要進一步的體內(nèi)研究證實其應(yīng)用潛力。本研究揭示了從林麝腸道中收集的乳酸菌分離株的益生特性，為研制出能夠充分適應(yīng)林麝腸道環(huán)境、改善林麝健康狀況的益生菌制劑提拱了可靠的菌種來源。