鄒逢佳，蘇成安，林文東，謝永華，張兵，張靜

1 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校臨床醫(yī)學(xué)院，福建泉州 362011；2 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部；3 泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬人民醫(yī)院影像科

維生素D 是維持人體健康必需的一類營(yíng)養(yǎng)素，不僅能調(diào)節(jié)鈣磷代謝，維持體內(nèi)血鈣和血磷平衡，還能促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)和鈣化［1-2］。維生素D缺乏會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)鈣的吸收減少和利用障礙，從而引起骨量減少甚至骨質(zhì)疏松。孕婦是維生素D 缺乏的高危人群。如果孕婦長(zhǎng)期或嚴(yán)重缺乏維生素D，不僅會(huì)出現(xiàn)低鈣血癥和骨質(zhì)疏松的臨床表現(xiàn)，還會(huì)影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)不良、發(fā)育遲緩甚至佝僂病。有研究報(bào)道，孕期母體經(jīng)胎盤(pán)向胎兒主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)鈣非常活躍，當(dāng)鈣攝入不足時(shí)，母體會(huì)動(dòng)員自身骨鈣入血，從而滿足胎兒對(duì)鈣的需求，但長(zhǎng)此以往會(huì)對(duì)母胎健康造成不良影響［3］。亞臨床骨健康是指早于肉眼可見(jiàn)的骨骼形態(tài)異常之前，機(jī)體已經(jīng)在分子水平上發(fā)生了改變，從量變到質(zhì)變，逐漸出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的臨床表現(xiàn)。亞臨床骨健康很容易導(dǎo)致骨骼發(fā)生不可逆性損害，一旦出現(xiàn)骨質(zhì)丟失往往無(wú)法恢復(fù)骨量，從而影響機(jī)體正常的生長(zhǎng)發(fā)育。但目前生命早期維生素D缺乏對(duì)亞臨床骨健康的影響尚無(wú)定論。2020 年2 月—2022 年3月，本研究探討了生命早期維生素D缺乏對(duì)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育和亞臨床骨健康的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年SD 大鼠27只，清潔級(jí)，雄性9只、雌性18 只，8 周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。所有SD大鼠于泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校SPF 級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)分籠飼養(yǎng)，自由攝食和飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（22.0 ± 0.5）℃，相對(duì)濕度（50 ±10）%，光照12 h/12 h 明暗交替，通風(fēng)良好。標(biāo)準(zhǔn)飼料和維生素D缺乏飼料，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。除維生素D含量不同外，兩種飼料的營(yíng)養(yǎng)成分基本相同。正白光LED 燈（不含紫外光和紅外光）、白熾燈（含部分紫外光和紅外光），購(gòu)自浙江雷士照明科技有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備 所有雌性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、維生素D缺乏組（VDD組）、維生素D補(bǔ)充組（VDS組），每組6只。VDD組和VDS組予維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)，對(duì)照組和所有雄性SD大鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)4周，按雌雄比2∶1合籠交配，次日在雌鼠陰道口發(fā)現(xiàn)白色陰道栓視為交配成功，計(jì)為妊娠第1天。交配成功后，對(duì)照組與VDS組予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和白熾燈照明，VDD組繼續(xù)予維生素D缺乏飼料喂養(yǎng)和正白光LED燈照明，直至仔鼠21天離乳。所有仔鼠按母鼠飼養(yǎng)條件喂養(yǎng)至出生第7周末。每只雌鼠生育仔鼠最多挑選8只（雌雄大致相等）。對(duì)照組、VDD組、VDS組分別獲取仔鼠20、14、22只。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 仔鼠體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng) 仔鼠出生第1、2、3、4周末，稱量體質(zhì)量，測(cè)量身長(zhǎng)和尾長(zhǎng)。

1.3.2 仔鼠血清Ca2+、甲狀旁腺激素（PTH）、25-羥基維生素D［25-（OH）D］水平 仔鼠出生第7 周末，麻醉后經(jīng)心臟取血，離心留取血清。采用偶氮砷Ⅲ法檢測(cè)血清Ca2+，采用雙位點(diǎn)酶免疫法檢測(cè)血清PTH，采用ELISA法檢測(cè)血清25-（OH）D。

1.3.4 仔鼠骨礦物質(zhì)含量和骨密度 仔鼠出生第7 周末，采用雙能X 射線骨密度儀檢測(cè)全身骨礦物質(zhì)含量和骨密度。

1.3.5 仔鼠血清磷、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、Ⅰ型前膠原N 端延長(zhǎng)肽（P1NP）、堿性磷酸酶（ALP）水平 仔鼠出生第7周末，麻醉后經(jīng)心臟取血，離心留取血清。采用酶法檢測(cè)血清磷，采用ELISA法檢測(cè)血清IGF-1，采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)血清P1NP、ALP。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料服從正態(tài)分布且方差齊性，以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組仔鼠出生4 周內(nèi)體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)變化 見(jiàn)表1。

表1 三組仔鼠出生4周內(nèi)體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)比較（± s）

表1 三組仔鼠出生4周內(nèi)體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)比較（± s）

注：與本組出生第1 周末比較，*P＜0.05；與本組出生第2 周末比較，#P＜0.05；與本組出生第3 周末比較，△P＜0.05；與對(duì)照組同期比較，▲P＜0.05；與VDD組同期比較，▽P＜0.05。

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2.2 三組仔鼠血清Ca2+、PTH、25-（OH）D 水平比較 見(jiàn)表2。

表2 三組仔鼠血清Ca2+、PTH、25-（OH）D水平比較（± s）

表2 三組仔鼠血清Ca2+、PTH、25-（OH）D水平比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與VDD組比較，#P＜0.05。

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2.3 三組仔鼠出生第7 周末骨礦物質(zhì)含量和骨密度比較 見(jiàn)表3。

表3 三組仔鼠出生第7周末骨礦物質(zhì)含量和骨密度比較（± s）

表3 三組仔鼠出生第7周末骨礦物質(zhì)含量和骨密度比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與VDD組比較，#P＜0.05。

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2.4 三組仔鼠出生第7 周末基礎(chǔ)指標(biāo)比較 見(jiàn)表4。

表4 三組仔鼠出生第7周末基礎(chǔ)指標(biāo)比較（± s）

表4 三組仔鼠出生第7周末基礎(chǔ)指標(biāo)比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與VDD組比較，#P＜0.05。

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3 討論

維生素D是人體必需的脂溶性維生素，屬于類固醇衍生物，與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育、骨骼健康以及神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)功能有著密切聯(lián)系［4-5］。一旦機(jī)體出現(xiàn)維生素D缺乏，不僅會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良，還會(huì)引起體內(nèi)鈣磷代謝紊亂。如果孕婦長(zhǎng)期或嚴(yán)重缺乏維生素D，在生命早期就會(huì)影響胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，維生素D缺乏和不足已成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，涉及各年齡段。各年齡段人群維生素D缺乏或不足所致的疾病越來(lái)越多，尤其是與骨代謝、骨健康以及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的疾病，這些疾病成為當(dāng)前臨床研究的重點(diǎn)［6］。亞臨床骨健康作為一種較為常見(jiàn)的骨骼亞健康狀態(tài)，主要是指早于肉眼可見(jiàn)的骨骼形態(tài)異常之前，機(jī)體已經(jīng)在分子水平上發(fā)生了改變。但目前生命早期維生素D缺乏對(duì)亞臨床骨健康的影響尚無(wú)定論。

本研究探索了生命早期維生素D缺乏對(duì)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育和亞臨床骨健康的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和VDS 組仔鼠出生第1～4 周末體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均高于VDD組仔鼠同期，并且VDS組仔鼠出生第1～4周末體質(zhì)量、身長(zhǎng)、尾長(zhǎng)均高于對(duì)照組仔鼠同期。提示生命早期維生素D 缺乏可影響仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育，而及時(shí)補(bǔ)充維生素D則能促進(jìn)仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出生第7周末，對(duì)照組和VDS組仔鼠血清Ca2+、25-（OH）D 水平均顯著高于VDD 組仔鼠，血清PTH 水平低于VDD 組仔鼠。25-（OH）D 是血液中維生素D 的主要循環(huán)形式，是反映體內(nèi)維生素D狀況的可靠指標(biāo)，也是促進(jìn)腸道鈣磷吸收和維持骨骼礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)必需的物質(zhì)。PTH對(duì)機(jī)體內(nèi)的血鈣和血磷有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。有研究報(bào)道，維生素D 能夠促進(jìn)腸道對(duì)鈣的吸收，而當(dāng)骨密度降低時(shí)，25-（OH）D 缺乏會(huì)產(chǎn)生反饋性作用，促使PTH 升高，這在一定程度上加快了骨轉(zhuǎn)換過(guò)程，此時(shí)骨代謝平衡遭到嚴(yán)重破壞［7-8］。本研究三組仔鼠出生第7周末血清Ca2+、PTH、25-（OH）D 水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)通過(guò)補(bǔ)充維生素D 不僅可濃度依賴性提高血清Ca2+水平，還可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，從而更好地促進(jìn)仔鼠的生長(zhǎng)發(fā)育［9］。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，出生第7周末，對(duì)照組和VDS組仔鼠骨礦物質(zhì)含量和骨密度均高于VDD 組仔鼠，并且VDS組仔鼠骨礦物質(zhì)含量和骨密度均高于對(duì)照組仔鼠。提示及時(shí)補(bǔ)充維生素D能夠改善仔鼠亞臨床骨健康。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，出生第7 周末，對(duì)照組和VDS 組仔鼠血清ALP、磷、IGF-1 水平均高于VDD 組仔鼠，血清P1NP 水平均低于VDD 組仔鼠；VDS 組仔鼠血清ALP、磷、IGF-1水平均高于對(duì)照組仔鼠，血清P1NP 水平低于對(duì)照組仔鼠。P1NP 是從Ⅰ型前膠原蛋白分子的兩端裂解出來(lái)的前膠原肽。當(dāng)骨細(xì)胞合成增多時(shí)，血清P1NP 水平會(huì)明顯升高［10］，說(shuō)明骨吸收速度加快，此時(shí)骨量丟失會(huì)導(dǎo)致骨密度降低［11］。有研究報(bào)道，若持續(xù)存在維生素D不足或缺乏，機(jī)體最突出的病理性改變是鈣磷代謝紊亂和骨質(zhì)損傷，此時(shí)機(jī)體血清ALP 水平無(wú)法升高，與正常生長(zhǎng)發(fā)育人群相比，其血清ALP 甚至可出現(xiàn)較低水平［12］。有研究認(rèn)為，機(jī)體正常生長(zhǎng)發(fā)育受IGF-1軸調(diào)控，IGF-1軸功能異常會(huì)引起生長(zhǎng)激素分泌不足，或生長(zhǎng)激素依賴性胰島素樣生長(zhǎng)因子水平降低，繼而導(dǎo)致IGF-1水平降低，維生素D 不足，二者呈明顯正相關(guān)，此時(shí)機(jī)體處于生長(zhǎng)發(fā)育落后的狀態(tài)［13-14］。本研究結(jié)果證實(shí)，生命早期及時(shí)補(bǔ)充維生素D 能夠促進(jìn)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育，其間骨代謝相關(guān)物質(zhì)也會(huì)得到相應(yīng)改善。

綜上所述，生命早期維生素D缺乏可影響仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育并引起亞臨床骨健康，而及時(shí)補(bǔ)充維生素D則能促進(jìn)仔鼠生長(zhǎng)發(fā)育，逆轉(zhuǎn)亞臨床骨健康。