鄒鈺珠，湯堯

（天津科技大學食品科學與工程學院/天津科技大學省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室,天津 300457）

藜麥中富含蛋白質、淀粉、礦物質等基本營養(yǎng)成分,同時含有大量酚類物質,是唯一一種單體植物即可滿足人體基本營養(yǎng)需求的食物,具有良好的應用前景。我國藜麥的種植面積在非原產(chǎn)地國家中排名第二位[1]。藜麥中的酚類物質可以消除由自由基引起的氧化應激現(xiàn)象,從而預防與氧化應激相關的疾病,如高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等[2-3]。越來越多的體內和體外試驗結果表明,來自藜麥的植物化學物質具有許多潛在的健康益處,合理膳食獲取酚類物質對于人們保持正常的抗氧化功能、減緩衰老、抗糖尿病和抗阿爾茨海默氏癥有重要作用[4-6]。

以精制米面為主的飲食習慣不利于人們的健康。全民膳食結構的改變,推進全谷物飲食,對提高健康和綠色低碳等方面具有積極作用[7]。全谷物中存在膳食纖維,使得全谷物產(chǎn)品通常表現(xiàn)出體積減小、硬度增大、顏色深、口感粗糙和缺乏彈性,這極大地限制了全谷物產(chǎn)品的工業(yè)開發(fā)和應用[8]。開發(fā)藜麥饅頭,有利于提升人們的膳食營養(yǎng),保持人們的健康體質,也為相關全谷物食品的加工技術的研究提供思路。

目前由于藜麥、青稞等全谷物制品存在適口性差的問題,是全谷物產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大瓶頸[9]。為改進全谷物的風味和適口性,采用預熟化處理能有效改善食物的營養(yǎng)品質和食用品質,但其耗能高、耗時長、易使產(chǎn)品產(chǎn)生異變；采用擠壓膨化技術,產(chǎn)品口感好,加工成本低,但在擠壓膨化過程中會發(fā)生大量復雜變化；采用萌發(fā)技術,初期的藜麥多酚、黃酮等生物活性物質增加,但時間過長或較短都會產(chǎn)生異味,影響產(chǎn)品市場接受度[10]。采用酶酵解可更多保留全谷物營養(yǎng),有效改善谷物適口性,試驗發(fā)現(xiàn)酶制劑可以改善饅頭內部結構,使其富有彈性,粗糙感減少,氣孔疏松,使得藜麥饅頭更易被大眾接受；同時酶制劑可以使藜麥在一定程度上水解釋放出酚類物質,提高抗氧化活性[11-13]。谷俊華等[14]研究發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶可以水解藜麥蛋白使其暴露出更多抗氧化活性基團,提高藜麥抗氧化活性。Tang 等[12]研究發(fā)現(xiàn)果膠酶可以效釋放酚類物質。Liu等[15]發(fā)現(xiàn)利用淀粉酶和木聚糖酶對面團的穩(wěn)定性和延展性有改良效果。

本研究選用常用于烘焙中的4 種酶制劑（木聚糖酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、真菌淀粉酶）,在保證藜麥饅頭的營養(yǎng)價值和特殊香味的基礎上,改善其彈性弱、延展性差、結構粗糙等問題,并通過測定藜麥饅頭中游離多酚、結合多酚、游離黃酮和結合黃酮的含量以及DPPH 自由基清除能力和鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power,FRAP）,探究酶制劑對藜麥酚類物質及抗氧化能力的影響,以期為我國全麥產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)提供參考,推動我國全谷物食品產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥:產(chǎn)自青海；面筋粉（糕點預拌粉）:新鄉(xiāng)良潤全谷物食品有限公司；安琪高活性干酵母粉、木聚糖酶（XYL200、29 000 U/g）、真菌酵母（FAM100、55 000 U/g）、木瓜蛋白酶（PA-2、50 000 U/g）:安琪酵母股份有限公司；果膠酶（食品級、100 000 U/g）:山東隆科特酶制劑有限公司；蘆丁標準品、甲醇、冰醋酸、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯、碳酸鈉、亞硝酸鈉、六水合三氯化鋁、福林酚、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris（2-pyridyl）-s-triazine,TPTZ）:國藥集團化學試劑有限公司。除特殊標記外其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HMJ-A50N1 型和面機:小熊電器股份有限公司；FLT-ZG 型304 不銹鋼蒸鍋:深圳瀾邦酒業(yè)有限公司；SHA-B 型水浴恒溫振蕩器:常州市天竟實驗儀器廠；DL-3021HR 型醫(yī)用離心機:安徽中科都菱商用電器股份有限公司；Synergy-HTX 型多功能酶標儀:美國伯騰儀器有限公司；SB-4200DT 型超聲清洗機:寧波新芝生物科技有限公司；TA.XT Plus 質構儀:美國博勒飛公司；LGJ-10N/A 型冷凍干燥機:北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；1000C 多功能粉碎機:永康市紅太陽機電有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 饅頭的制作

將藜麥種子用去離子水沖洗3 次,用紙將表面水分吸干,置于陰涼通風處12 h。用粉碎機將洗后的藜麥種子粉碎成粉末過80 目篩網(wǎng),得到藜麥粉。

稱取120 g 藜麥粉和40 g 面筋粉混合均勻,加入1.0%（質量分數(shù)）用37 ℃去離子水活化后的酵母水溶液,添加酶制劑,用適量水溶解后加入面粉中,隨后邊攪拌邊加入適量水,整個制作過程共加入120 g 水。使用和面機和面15 min,醒發(fā)1 h。得到面團均勻分成3 份,手工搓圓,塑性后,再在室溫下醒發(fā)30 min,放于蒸鍋中蒸20 min（冒氣起計時）后取出,放于室溫下冷卻1 h 后,進行相關指標測定。

1.3.2 饅頭樣品質構檢測

采用質構儀進行全質構分析（texture profile analysis,TPA）測定。取放于室溫冷卻1 h 后的饅頭,去除饅頭表皮,用專用切刀將饅頭切成20 mm×20 mm×30 mm的長方體。采用?100 mm 的圓柱形平底探頭測定,儀器參數(shù)設定參考Kou 等[16]的方法并略作修改:數(shù)據(jù)采集速率200 pps,測前速率3 mm/s,測中速率為1 mm/s,測后速率3 mm/s,觸發(fā)力設置為“Auto”,引發(fā)模式為應變,壓縮速度1 mm/s,壓縮程度60%。

1.3.3 饅頭酚類物質提取

將饅頭切成0.3 mm×0.3 mm×0.3 mm 方粒,將方粒用液氮預冷后,再放入冷凍干燥機中,脫水12 h 得到樣品,用研缽粉碎,得到粉末放于-40 ℃冰箱中備用。

游離態(tài)和結合態(tài)酚類物質的提取參考Tang 等[12]的方法并略作修改。準確稱取1 g 藜麥饅頭粉放入10 mL 的塑料離心管中,加入5 mL 70%甲醇（含1%冰乙酸）,進行超聲提取30 min（溫度25 ℃,功率40 kW）。在室溫下用水浴恒溫振蕩器在暗處提取2 h,6 000×g離心20 min。殘渣再提取1 次,合并上清液作為粗提物。

上述殘渣（1.0 g）用12.5 mL 2 mol/L 氫氧化鈉溶液在室溫下水解4 h,加入6 mol/L 鹽酸酸化至pH 值為2,然后6 000×g離心5 min。上清液用5 mL 乙酸乙酯萃取6 次,合并萃取液后用N2在黑暗中吹干,然后用2 mL 70%甲醇溶液中復溶,得到結合酚。

1.3.4 藜麥饅頭酚類物質含量測定

1.3.4.1 總多酚含量測定

參考Tang 等[12]的方法采用Folin-Ciocalteu 法測定不同標準品總酚含量（total phenol contents,TPC）,稍作修改。將25μL 樣品或標品（250、125、62.5、31.25、15.626μg/mL）加入至96 孔板,然后與125μL 0.2 mol/L福林-環(huán)鈣酸鹽試劑混合。反應10 min 后,加入125μL 7.5% Na2CO3溶液。室溫孵育30 min 后,在765 nm 處讀取吸光度。以沒食子酸的濃度（μg/mL）為橫坐標（x）,吸光度為縱坐標（y）,繪制標準曲線。標準曲線回歸方程為y=0.006 3x+0.207 5,R2=0.998 5,線性范圍15～250μg/mL。根據(jù)線性回歸方程計算樣品中游離多酚和結合多酚含量,兩項之和為總多酚含量。

1.3.4.2 總黃酮含量測定

參照Gu 等[17]的方法,稍作修改。將25μL 樣品或標品（500、375、250、187.5、125、61.25、31.625μg/mL）加入至96 孔板,向提取液中加入25μL 10% NaNO2溶液反應6 min,隨后加入20μL 5% AlCl3·6H20 反應5 min,然后加入30μL 1 mol/L NaOH 溶液和75μL 蒸餾水,在510 nm 處測定吸光度。以蘆丁的質量濃度（μg/mL）為橫坐標（x）,吸光度為縱坐標（y）,繪制標準曲線。蘆丁線性回歸方程為y= 0.000 7x+ 0.039,R2=0.998 0。線性范圍31～500μg/mL。

1.3.5 酚類物質抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH 自由基能力測定

采用Tang 等[12]的方法,稍作修改,測定DPPH 自由基清除活性。將25μL 樣品或標品（62.5、125、250、500、750、1 000 μmol/L）加入到200μL DPPH 溶液（350μmol/L 甲醇溶液）中。將混合物在室溫黑暗中反應4 h。以200μL DPPH 溶液（350μmol/L）為空白,在517 nm 處測定吸光度。DPPH 自由基清除活性表示為每克干馬鈴薯的Trolox 當量（trolox equivalent,TE）（μmol TE/g）（y=-0.004 8x+2.115 7,R2=0.999 0）。

1.3.5.2 FRAP 鐵離子還原能力測定

采用Tang 等[12]等的方法,稍作修改,測定FRAP。FRAP 試劑由0.3 mol/L 醋酸緩沖液（pH3.6）與10 mmol/L TPTZ 在40 mmol/L 鹽酸和20 mmol/L FeCl3·6H2O 溶液中以10∶1∶1（體積比）混合制備。將10μL 樣品或標品（62.5、125、250、500、750、1 000μmol/L）和新鮮制備的FRAP 試劑（300μL）加入96 孔板中,室溫孵育2 h,以300μL FRAP 試劑為空白,在593 nm 處測定吸光度。FRAP 的抗氧化活性以每克干馬鈴薯的抗壞血酸當量（ascorbic acid equivalents,AAE）（μmol AAE/g）（y=0.001 5x+0.121 8,R2=0.999 5）表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 對數(shù)據(jù)進行整理,每組試驗設置至少3 個平行,取均值,應用SPSS 26 軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進行方差分析,P<0.05 表示差異顯著。由Excel 2010 版軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 酶制劑處理藜麥饅頭對形態(tài)的影響

不同酶制劑處理后藜麥饅頭的表觀狀態(tài)如圖1所示。

圖1 不同酶制劑處理后藜麥饅頭的表觀圖Fig.1 Morphological images of quinoa steamed bread treated with different enzyme preparation

由圖1 可知,與未經(jīng)酶制劑處理的藜麥饅頭相比,酶制劑處理后藜麥饅頭的色澤發(fā)生了不同程度的改變,其中木瓜蛋白酶處理的饅頭顏色較其他處理更深,酶制劑處理組的饅頭內部結構變得更加細膩,表面光滑程度增大,面團更易成型。

2.2 酶制劑處理藜麥饅頭對質構特性的影響

食品的感官表現(xiàn)直接影響消費者對食物的接受和喜愛程度,酶制劑的添加對饅頭的質構影響如表1所示。

表1 不同酶制劑處理藜麥饅頭的質構特征Table 1 Texture characteristics of quinoa steamed bread treated with different enzymes

由表1 可知,果膠酶、木聚糖酶明顯提高了藜麥饅頭的硬度、彈性、黏聚性、回復性,經(jīng)真菌淀粉酶處理后的饅頭硬度、咀嚼性、彈性和回復性分別增強87%、96%、8% 和23%,李進才等[18]發(fā)現(xiàn)真菌淀粉酶可作用于藜麥中的淀粉,使其含量降低,硬度增強,在藜麥中淀粉的含量與硬度和咀嚼性均極顯著負相關,與回復性和黏聚性呈顯著負相關,與本試驗中使用真菌淀粉酶后所得結論一致。木聚糖酶和果膠酶均作用于細胞壁,在饅頭質構特性方面的改變具有相似性,但木聚糖酶在彈性、黏聚性、咀嚼性的改善效果較果膠酶更為突出,木聚糖酶在饅頭彈性方面增強17%。木瓜蛋白酶作用后的藜麥饅頭質構特性各項指標均降低,木瓜蛋白酶主要作用于藜麥中的藜麥蛋白,使得藜麥的硬度和黏聚性降低,這與前人研究結果較為一致[19]。

2.3 酶制劑對藜麥饅頭多酚含量的影響

植物多酚是廣泛存在于植物體內的天然次生代謝產(chǎn)物,存在于人類飲食中常見的許多植物源性食品和飲料中[20]。不同酶制劑對饅頭中多酚含量的影響如圖2 所示。

圖2 不同酶制劑處理對藜麥饅頭中多酚含量的影響Fig.2 Effects of different enzyme preparations on the content of polyphenols in quinoa steamed bread

由圖2 可知,經(jīng)不同酶處理后,游離多酚、結合多酚、總多酚的含量分別為129.13～343.84、48.51～72.06、177.65～404.63 mg/100 g。與對照組相比,經(jīng)木瓜蛋白酶處理后總多酚含量提高99.23%,游離多酚的含量增加了162.14%,這可能是由于木瓜蛋白酶作用于蛋白多酚復合體從而釋放出游離酚并導致總酚含量增加[21]。李夢瑤等[22]發(fā)現(xiàn)藜麥發(fā)酵時伴隨蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等酶的生成,導致藜麥中蛋白質、纖維素的結構變化從而引起結合多酚的釋放。木聚糖酶處理后游離多酚、結合多酚、總多酚含量分別增加5.57%、5.09%、5.40%。結腸中微生物區(qū)能夠代謝出木聚糖酶,木聚糖酶處理后藜麥饅頭釋放多酚有利于人體吸收和代謝[23]。果膠酶處理組中結合多酚含量下降約32.67%。真菌淀粉酶、果膠酶處理組與對照組中游離多酚含量無顯著性差異（P>0.05）。綜上,木瓜蛋白酶能促進藜麥中的酚類物質的釋放,木聚糖酶能增加結合多酚含量,真菌淀粉酶處理對藜麥饅頭的多酚含量沒有顯著影響,而果膠酶則會使藜麥饅頭中的多酚含量有所損失。

2.4 酶制劑處理藜麥饅頭對黃酮含量的影響

谷物是黃酮的主要膳食來源,是評價食物健康功效的主要指標之一[24-25]。不同酶制劑對饅頭中黃酮含量的影響如圖3 所示。

圖3 不同酶制劑處理對藜麥饅頭中黃酮含量的影響Fig.3 Effects of different enzyme preparations on flavonoid content in quinoa steamed bread

由圖3 可知,酶制劑對藜麥饅頭中黃酮含量的影響存在差異。藜麥饅頭經(jīng)酶加工處理后,總黃酮的含量均有所提高。這可能是由于黃酮在高溫及高壓條件下極易分解,酶解法條件溫和,能夠有效促進有效成分溶出。其中,木瓜蛋白酶處理的藜麥饅頭游離黃酮、結合黃酮和總黃酮含量分別增加了17.98%、12.50% 和15.50%。木瓜蛋白酶可將蛋白質水解成多肽及氨基酸類,并促進黃酮類化合物等成分的釋放[26]。經(jīng)過木聚糖酶處理的藜麥饅頭游離黃酮的含量增加25.00%,但結合黃酮的含量降低14.16%；果膠酶處理后結合黃酮增加15.22%,游離黃酮含量損失4.83%,這可能是由于果膠酶作用于細胞壁間相連的果膠物質,將果膠分解成小分子物質,減少了黃酮向主體溶劑擴散的傳質阻力,便于黃酮的浸出[27]。真菌淀粉酶處理對總黃酮、游離黃酮和結合黃酮均無顯著性影響（P>0.05）。

2.5 酶制劑處理藜麥饅頭對多酚提取物的抗氧化活性的影響

2.5.1 酶制劑處理藜麥饅頭對多酚提取物的DPPH 自由基清除能力的影響

不同酶制劑處理后藜麥饅頭的DPPH 自由基清除能力如圖4 所示。

圖4 不同酶制劑處理藜麥饅頭多酚提取物的DPPH 自由基清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of polyphenol extract from quinoa steamed bread treated with different enzyme preparations

由圖4 可知,藜麥饅頭中多酚的DPPH 自由基清除能力與游離和總多酚的含量呈正相關。不同酶制劑處理藜麥饅頭的DPPH 自由基清除能力存在差異。與對照組相比,木瓜蛋白酶處理后游離多酚、結合多酚和總多酚的DPPH 自由基清除能力分別增強了96.67%、17.90% 和61.60%；但真菌淀粉酶處理后結合多酚DPPH 自由基清除能力降低了23.34%,游離多酚和總多酚與對照組間無顯著差異（P>0.05）,木聚糖酶和果膠酶處理后DPPH 自由基清除能力與對照組相比均無顯著差異（P>0.05）。果膠酶處理結合多酚占總多酚含量的27.31%,但結合多酚DPPH 自由基的清除能力占總多酚的43.68%,可能是因為藜麥中結合酚類物質DPPH 自由基清除能力優(yōu)于游離多酚的貢獻[28]。

2.5.2 酶制劑處理藜麥饅頭對多酚提取物的FRAP 的影響

不同酶制劑處理藜麥饅頭的FRAP 如圖5 所示。

圖5 不同酶制劑處理藜麥饅頭多酚提取物的FRAPFig.5 FRAP iron ion reduction capacity of quinoa steamed bread polyphenol extract treated with different enzyme preparations

由圖5 可知,與對照組相比,木瓜蛋白酶處理后藜麥饅頭中游離多酚FRAP 增強了32.30%,但結合多酚FRAP 減弱了18.93%；經(jīng)真菌淀粉酶、果膠酶、木聚糖酶處理的藜麥饅頭FRAP 與對照組相比無顯著差異（P>0.05）。綜上所述,木瓜蛋白酶處理藜麥饅頭對藜麥饅頭FRAP 影響最為顯著。因此,木瓜蛋白酶處理能夠更好地保留和釋放藜麥饅頭中的抗氧化活性物質。

3 結論

本試驗采用木聚糖酶、真菌淀粉酶、果膠酶、木瓜蛋白酶處理藜麥饅頭,對其質構及抗氧化活性進行測定。結果表明,在質構方面,真菌淀粉酶處理后,饅頭硬度、咀嚼性上分別提高87%、96%,而木瓜蛋白酶在硬度上降低30%；在抗氧化活性方面,木瓜蛋白酶處理后游離多酚的含量增加162.14%,游離黃酮增加17.98%,游離態(tài)DPPH 自由基清除能力增強96.67%,鐵離子還原能力增強32.30%；其他處理差異不明顯。因此本研究揭示了不同酶制劑處理后藜麥饅頭品質和多酚、黃酮總含量及其抗氧化活性的變化,為藜麥饅頭抗氧化、降血糖的深入研究以及相關全谷物產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。