黨玉婷

張 彥1

井波鑫1

蘇曉萌2

柴希艷3

(1. 西安醫(yī)學(xué)院,陜西 西安 710021;2. 陜西福祿成工貿(mào)有限公司,陜西 西安 710032;3. 西安雨潤(rùn)百德健康管理有限公司,陜西 西安 710065)

黑豆在中國(guó)栽培歷史悠久,品種較多,如:黑豆、黑大豆、小黑豆和馬料豆等[1]。2020版《中國(guó)藥典》記載其性狀“長(zhǎng)6～12 mm,直徑5～9 mm,種皮呈黑色或灰黑色,有益精明目,養(yǎng)血祛風(fēng),利水,解毒的作用”[2]。歷代古籍均認(rèn)為“種皮黑者方可做藥用”且“黑者入藥,小者質(zhì)佳”[3-4]。近年來(lái)陜北地區(qū)種植栽培黑豆已具有一定規(guī)模,且全部為小粒品種[5]。

黑豆可作為食品添加劑應(yīng)用于大健康領(lǐng)域,在改善人類(lèi)膳食結(jié)構(gòu)和預(yù)防代謝綜合征、肥胖和海爾默茲綜合征中發(fā)揮著重要作用[6],這可能與黑豆中的次生代謝產(chǎn)物的抗氧化作用有關(guān)。但前人對(duì)黑豆的研究多集中在花青素、異黃酮等提取工藝上[7]。對(duì)于適合藥用的黑豆品種,魏玉等[8]指出中藥炮制輔料黑豆汁應(yīng)選用“烏衣黃仁小扁粒黑豆”;李佳榮等[9]也通過(guò)比較不同產(chǎn)地黑豆大豆苷和大豆苷元的含量,提出優(yōu)質(zhì)藥用的品種應(yīng)是皮緊粒小的;李瑞等[10]比較了可作為豆芽、豆腐等豆制品的黑豆品種。從藥用及食用價(jià)值兩方面對(duì)黑豆進(jìn)行綜合評(píng)價(jià),以及對(duì)不同品種黑豆活性進(jìn)行比較的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

體外酶抑制和抗氧化活性測(cè)定是初步篩選生物活性的一種簡(jiǎn)便的方法[11]。胰脂肪酶是消化脂肪的關(guān)鍵酶;α-淀粉酶是重要的碳水化合物水解酶;乙酰膽堿酯酶是生物神經(jīng)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵酶;酪氨酸酶是黑色素合成的關(guān)鍵限速酶[11]。以上酶抑制作用均與預(yù)防代謝綜合征有關(guān),與氧化應(yīng)激也有關(guān)[11]。當(dāng)前雖有黑豆體外抗氧化的研究[12],但尚未見(jiàn)對(duì)黑豆代謝綜合征相關(guān)酶的抑制作用研究。

研究擬比較不同品種黑豆的主成分,并測(cè)定黑豆對(duì)代謝綜合征相關(guān)酶的抑制作用和抗氧化活性,明確其生物活性,探討其在代謝綜合征的輔助預(yù)防中應(yīng)用的可能性,以期為闡釋黑豆藥用與食用的適宜品種提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

黑豆樣品:含水量<5%,根據(jù)《中國(guó)農(nóng)業(yè)百科全書(shū)》[13]中有關(guān)中國(guó)大豆品種分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn),按照籽粒重量將其分為大粒(百粒重18.0 g以上)、中粒(百粒重12.0～17.9 g)、小粒(百粒重11.9 g以下)三類(lèi)(見(jiàn)表1),市售;

表1 各黑豆樣品信息

沒(méi)食子酸、石杉?jí)A甲、曲酸、矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷、(+)-兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品:純度>98%,寶雞辰光生物科技有限公司;

福林酚:分析純,上海源葉生物科技有限公司;

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH):分析純,成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司;

2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS):分析純,美國(guó)Sigma公司;

α-淀粉酶:13 U/mg,北京索萊寶科技有限公司;

胰脂肪酶:15～35 U/mg,上海阿拉丁生化科技有限責(zé)任公司;

乙酰膽堿酯酶(AChE):200～1 000 U/mg,美國(guó)Sigma公司;

酪氨酸酶:500 U/mg,寶雞辰光生物科技有限公司;

L-酪氨酸:分析純,上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司;

維生素C片:華中藥業(yè)股份有限公司;

多奈哌齊:浙江華海藥業(yè)股份有限公司;

奧利司他:湖南明瑞制藥有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀:ReadMax 1900/1900Plus型,上海生物閃譜科技有限公司;

超聲波清洗器:KQ-250B型,昆山市超聲儀器有限公司;

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:XD-52AA型,上海申生科技有限公司;

全自動(dòng)凱氏定氮儀:K1100F型,深圳市賽亞泰科儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同方法制備黑豆樣品

(1) 超聲提取:黑豆用粉碎機(jī)粉碎,過(guò)100目篩,備用。取黑豆粉2 g,按1∶10 (g/mL)的料液比加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇,60 ℃超聲提取2 h后7 000 r/min離心8 min,取上清液,殘?jiān)谙嗤瑮l件下重復(fù)提取1次,合并兩次上清液,得質(zhì)量濃度為100 mg/mL黑豆提取液。另取20 g黑豆粉同以上操作。將超聲提取液濃縮蒸干制得黑豆提取物浸膏。稱(chēng)取浸膏125 mg用pH為7.2～7.4的PBS緩沖液配成質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL樣品溶液,再稀釋為質(zhì)量濃度0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/mL的黑豆提取物樣品溶液。

(2) 丙酮提取:取0.5 g過(guò)篩后的黑豆粉,置于5 mL酸性70%丙酮(0.5%乙酸)溶液中超聲3 h,避光靜置12 h后,3 000 r/min離心10 min,取上清液。殘?jiān)聪嗤椒ㄔ偬崛?次,合并浸提液,得黑豆提取液。

1.3.2 黑豆主成分測(cè)定

(1) 總酚酸含量:參照文獻(xiàn)[11]取1.3.1中超聲提取制備的黑豆提取液,采用福林酚法測(cè)定其總酚酸含量。

(2) 總黃酮含量:以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品,取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液,參照文獻(xiàn)[14]采用亞硝酸鈉—硝酸鋁法測(cè)定總黃酮含量,結(jié)果以每毫克兒茶素當(dāng)量表示(mg CAE/g樣品)。

(3) 縮合單寧含量:以(+)-兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品采用香草醛鹽酸法,參照文獻(xiàn)[15]略作修改,取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液采用香草醛甲醇溶液—濃鹽酸法,測(cè)定黑豆樣品中縮合單寧的含量,結(jié)果以每毫克兒茶素當(dāng)量表示(mg CAE/g樣品)。

(4) 總花色苷含量:參照文獻(xiàn)[16]修改如下:取1.3.1中超聲提取制備的黑豆提取液3 mL,分別用pH 1.0的0.025 mol/L KCl溶液和pH 4.5的0.4 mol/L醋酸鈉緩沖溶液定容至10 mL。平衡1 h后,分別在530,700 nm處測(cè)吸光值,按式(1)～式(3)計(jì)算總花色苷含量(以矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷計(jì))。

Aλmax=(A530 nm-A700 nm)pH 1.0-(A530 nm-A700 nm)pH 4.5,

(1)

(2)

(3)

式中:

Aλmax——最大吸收波長(zhǎng)處的吸光值;

A530 nm——530 nm處的吸光度;

A700 nm——700 nm處的吸光度;

MW——矢車(chē)菊-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量,449.2;

D——稀釋體積;

F——濃度校正因數(shù);

ε——消光系數(shù),29 600 L/(mol·cm);

l——光路長(zhǎng)度,cm;

WA——總花色苷含量,mg/100 g;

C——花色苷質(zhì)量濃度,mg/L;

V——待測(cè)液的體積,mL;

M——樣品質(zhì)量,g。

(5) 總多糖含量:取1.3.1中丙酮提取制備的黑豆提取液,參照文獻(xiàn)[17]采用苯酚硫酸法測(cè)定黑豆中總多糖。

(6) 總蛋白含量:取粉碎過(guò)100目篩的黑豆粉末,按GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法(凱氏定氮法)測(cè)定總蛋白含量。

1.3.3 抗氧化活性

(1) DPPH自由基清除活性:參照文獻(xiàn)[18]修改如下:取1.3.1中超聲提取制備的黑豆粗提液和DPPH溶液與無(wú)水乙醇反應(yīng)測(cè)吸光度,按式(4)計(jì)算DPPH自由基清除率。

(4)

式中:

Y——DPPH自由基清除率,%;

A1——待測(cè)試樣吸光度;

A2——不加待測(cè)試樣而用無(wú)水乙醇代替待測(cè)試樣的吸光度;

A3——待測(cè)試樣自身的吸光度。

(2) ABTS自由基清除活性:參照文獻(xiàn)[16]修改如下:將ABTS水溶液與K2S2O8水溶液混合暗反應(yīng)12 h后,用甲醇稀釋使其吸光度在0.78～0.82,得ABTS自由基工作液。在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液或無(wú)水乙醇中加入ABTS自由基工作液混勻測(cè)定吸光度。按式(5)計(jì)算ABTS自由基清除率。

(5)

式中:

Y——ABTS自由基清除率,%;

A0——無(wú)水乙醇+ABTS自由基工作液的吸光度;

A1——提取液+ABTS自由基工作液的吸光度。

1.3.4 體外酶抑制活性研究

(1) 胰脂肪酶:參照文獻(xiàn)[19]的方法配制胰脂肪酶溶液、底物PNPP溶液和陽(yáng)性藥奧利司他溶液。在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液中加入緩沖液和胰脂肪酶,反應(yīng)體系如表2所示,測(cè)定各組吸光度,按式(6)計(jì)算胰脂肪酶抑制率。

(6)

表2 胰脂肪酶反應(yīng)體系

式中:

Y——抑制率,%;

A1——空白組吸光度;

A2——空白對(duì)照組吸光度;

A3——抑制組吸光度;

A4——抑制對(duì)照組吸光度。

(2)α-淀粉酶:參照文獻(xiàn)[20]的方法配制α-淀粉酶溶液、淀粉溶液和DNS顯色劑溶液。根據(jù)如表3所示的反應(yīng)體系測(cè)定在1.3.1中超聲提取的黑豆提取物樣品溶液各組的吸光度,按式(6)計(jì)算α-淀粉酶抑制率。

表3 α-淀粉酶活性測(cè)定體系

(3) 乙酰膽堿酯酶:以陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲為陽(yáng)性藥,參照文獻(xiàn)[21]的方法測(cè)定各黑豆提取物的吸光度,按式(7)計(jì)算乙酰膽堿酯酶抑制率。

(7)

式中:

Y——乙酰膽堿酯酶抑制率,%;

A樣品——只加樣品吸光度;

A背景——PBS溶液代替酶液吸光度;

A空白——溶劑代替樣品吸光度。

(4) 酪氨酸酶:參照文獻(xiàn)[22],按式(8)計(jì)算酪氨酸酶抑制率。

(8)

式中:

Y——酪氨酸酶抑制率,%;

A——空白對(duì)照組(PBS 130 μL+酶50 μL+底物20 μL)吸光度;

B——空白背景組(PBS 180 μL+底物20 μL)吸光度;

C——不同濃度樣品組(PBS 80 μL+酶50 μL+樣品溶液50 μL+底物20 μL)吸光度;

D——試驗(yàn)背景組(PBS 130 μL+供試品溶液50 μL+底物20 μL)吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 各黑豆樣品的浸膏提取率

將1.3.1項(xiàng)下超聲提取液濃縮蒸干制得的各黑豆樣品的浸膏計(jì)算提取率,提取率為浸膏質(zhì)量與提取之前的黑豆粉總重之比,詳見(jiàn)表4。

表4 各黑豆樣品的浸膏提取率

2.2 各黑豆總酚酸、總黃酮、縮合單寧、花色苷、多糖與總蛋白含量

小黑豆和馬料豆中總酚酸含量和總黃酮、縮合單寧含量普遍遠(yuǎn)高于黑豆,以上3種分成含量為馬料豆>小黑豆>黑豆。尤其是小黑豆的總黃酮與縮合單寧含量約是黑豆的5～10倍,馬料豆約是黑豆的8～20倍。就總花色苷、總多糖和總蛋白含量而言,小黑豆與黑豆含量差別不大。比較發(fā)現(xiàn)總花色苷為馬料豆>小黑豆>黑豆,總多糖為小黑豆>黑豆>馬料豆,總蛋白為馬料豆>黑豆>小黑豆,詳見(jiàn)表5。

表5 各黑豆樣品中主要活性成分含量

2.3 黑豆提取物體外抗氧化活性

各類(lèi)黑豆均具有一定的抗氧化活性。其中,馬料豆>小黑豆>黑豆。黑豆各類(lèi)品種中馬料豆的抗氧化活性最好,但相同質(zhì)量濃度下均不及陽(yáng)性藥維生素C(VC)的抗氧化活性,詳見(jiàn)圖1、圖2及表6。

圖1 體外對(duì)DPPH自由基清除曲線

圖2 體外對(duì)ABTS自由基清除曲線

表6 各黑豆提取物體外抗氧化活性的IC50值

2.4 黑豆提取物體外酶抑制活性

2.4.1 胰脂肪酶 以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)作圖,得到各樣品質(zhì)量濃度與抑制率的曲線圖,見(jiàn)圖3。各品種黑豆粗提物對(duì)胰脂肪酶抑制作用的IC50,結(jié)果見(jiàn)表7。

圖3 各黑豆提取物體外對(duì)胰脂肪酶的抑制作用

表7 各黑豆提取物體外抑制胰脂肪酶的IC50值

由圖3和表7可知,各黑豆提取物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)胰脂肪酶均有較好的抑制作用,小黑豆>黑豆>馬料豆。其中,小黑豆和黑豆的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性藥奧利司他。

2.4.2α-淀粉酶 以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)作圖,得各樣品質(zhì)量濃度與抑制率的曲線圖,見(jiàn)圖4。計(jì)算各黑豆提取物對(duì)α-淀粉酶活性抑制作用的IC50,結(jié)果見(jiàn)表8。

圖4 各黑豆提取物體外對(duì)α-淀粉酶的抑制作用

表8 各黑豆提取物體外抑制α-淀粉酶的IC50值?

由圖4和表8可知,各類(lèi)黑豆提取物在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)α-淀粉酶均有抑制作用,其中馬料豆>黑豆>小黑豆。

2.4.3 乙酰膽堿酯酶 以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)作圖,得到各樣品質(zhì)量濃度與抑制率的曲線圖,見(jiàn)圖5。計(jì)算黑豆提取物對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制作用的IC50,結(jié)果見(jiàn)表9。

圖5 各黑豆提取物體外對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用

表9 各黑豆提取物體外抑制乙酰膽堿酯酶的IC50值?

由圖5和表9可知,除黑豆外,小黑豆、馬料豆及花青素單體(矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷)和陽(yáng)性藥石杉?jí)A甲對(duì)乙酰膽堿酯酶均有一定的抑制作用,其中小黑豆>馬料豆。

2.4.4 酪氨酸酶 以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo)作圖,得到各樣品質(zhì)量濃度與抑制率的曲線圖,見(jiàn)圖6。計(jì)算粗提物對(duì)酪氨酸酶活性抑制作用的IC50,結(jié)果見(jiàn)表10。

圖6 黑豆提取物體外對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

表10 黑豆提取物體外抑制酪氨酸酶的IC50值

由圖6和表10可知,各類(lèi)黑豆在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)酪氨酸酶均有抑制作用,黑豆>馬料豆>小黑豆。其中,黑豆的抑制效果優(yōu)于陽(yáng)性藥曲酸。

3 結(jié)論

酚酸、黃酮、花色苷等植物次生代謝產(chǎn)物與多種疾病治療密切相關(guān),而小黑豆的總酚酸、總黃酮、縮合單寧、總花色苷和總多糖含量高于其他品種,故小黑豆的藥用價(jià)值更高。馬料豆其百粒重量?jī)H為小黑豆的1/10,黑豆的1/40。而馬料豆除多糖含量外,其余主成分主要活性成分均高于小黑豆和黑豆,其抗氧化活性和酶抑制活性也較好。這印證了前人[8-9]提出的藥用黑豆炮制何首烏等藥材時(shí)應(yīng)選擇小黑豆的觀點(diǎn)。

研究從藥用和食用兩個(gè)方面評(píng)價(jià)不同黑豆品種,發(fā)現(xiàn)黑豆體外有抗氧化和抑制多種代謝綜合征相關(guān)酶的作用,其有輔助預(yù)防代謝綜合征的應(yīng)用價(jià)值[23]。后期可加強(qiáng)小黑豆藥用價(jià)值的開(kāi)發(fā)與研究,進(jìn)一步開(kāi)展整體動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)而對(duì)黑豆不同品種降脂降糖和預(yù)防海爾默茲綜合征等生物活性進(jìn)行深入研究。