楊海帆

丁 莉2

徐妙文1

沈 康1

王煦博1

(1. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚州 225001;2. 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院,江蘇 揚州 225001)

硫酸慶大霉素和硫酸新霉素是眾多氨基糖苷類抗生素家族中的一員,具有廣譜的抗菌作用[1-2],在畜牧業(yè)中常與硫酸結(jié)合使用[3-4]。盡管目前養(yǎng)殖業(yè)更多使用毒性較小的抗生素,但氨基糖苷類抗生素因低成本和高效的優(yōu)勢仍被廣泛應(yīng)用于禽畜疾病的預(yù)防和治療,然而長期使用可能會導(dǎo)致動物組織中抗生素殘留。人類長期攝入抗生素含量超標(biāo)的食物不僅會誘導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性[5],甚至?xí)?dǎo)致過敏反應(yīng)、耳毒性和腎毒性[6]。GB 31650—2019規(guī)定牛、豬肌肉組織中慶大霉素和新霉素的最大殘留限量分別為100,500 mg/kg。目前,氨基糖苷類抗生素的檢測方法主要有液相色譜法[7]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[8]、免疫層析法[1,9]和酶聯(lián)免疫吸附分析法等[10-12]。色譜法和免疫層析法的靈敏度高,但耗時、成本高,難以實現(xiàn)現(xiàn)場化、快速化和規(guī)模化檢測;而酶聯(lián)免疫吸附分析法易發(fā)生交叉反應(yīng),其假陽性率高。

表面增強拉曼散射(SERS)是一種快速、無損、不受水分干擾的檢測方法,結(jié)合拉曼光譜與表面材料技術(shù),利用局域表面等離子體共振(LSPR)和化學(xué)吸附的方法使得SERS信號顯著提升,高靈敏地檢測低濃度分析物[13-14]。當(dāng)檢測某些超低濃度的殘留物時,納米材料產(chǎn)生的SERS增強十分關(guān)鍵。金納米花(AuNFs)具有粗糙的表面和許多分支,在材料表面形成大量的“熱點”,為待測分子提供特殊的吸附位點,從而顯著增強SERS效應(yīng)[15]。因此,AuNFs被廣泛用作SERS活性基底的制備。PP合成紙是一種典型的疏水材料,可使納米顆粒在其表面聚集,增強SERS效應(yīng)。有研究[16]表明,采用還原氧化石墨烯—金復(fù)合納米材料檢測氧氟沙星,檢測限為0.3 ng/mL。Wattanavichean等[17]以銀納米棒作為基底檢測恩諾沙星、土霉素和新霉素,檢測限分別為0.5,2.0,100.0 μmol/L,但未應(yīng)用于食品中抗生素殘留的檢測。

食品樣品成分復(fù)雜,傳統(tǒng)樣品前處理耗時長、精度低,引入誤差大[18-19],而樣品前處理技術(shù)直接關(guān)系到整個檢測過程的準(zhǔn)確性和精密性。QuEChERs方法是目前動物抗生素殘留檢測領(lǐng)域備受關(guān)注的前處理技術(shù)[20],具有快速、簡單、廉價、有效、可靠、耐用和安全的優(yōu)點,可極大提高樣品前處理效率[21]。目前,QuEChERs方法已成功應(yīng)用于SERS技術(shù)檢測食品中抗生素殘留[22-23],但將該方法與SERS技術(shù)結(jié)合檢測動物中氨基糖苷類藥物殘留的研究尚未見報道。研究擬以疏水性PP合成紙為襯底制備方陣排列SERS基底,通過QuEChERs方法對樣品進(jìn)行前處理,并對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留進(jìn)行定量分析,旨在為豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留提供快速、定量和高通量的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸、鹽酸多巴胺、無水乙醇、4-巰基苯甲酸(4-MBA)、乙腈、乙酸、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鎂:分析純,上海阿拉丁生化科技有限公司;

硫酸慶大霉素、硫酸新霉素:北京索萊寶科技有限公司;

PP合成紙:上海天成紙品紙業(yè)合作公司;

試驗用水為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)。

1.2 儀器與設(shè)備

場發(fā)射掃描電子顯微鏡:S-4800Ⅱ型,日本日立公司;

顯微共焦拉曼光譜儀:Renishaw inVia型,英國Renishaw公司;

透射電子顯微鏡:Tecnai 12型,荷蘭Philips公司;

透射電子顯微鏡:FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN型,美國FEI公司;

顯微拉曼成像光譜儀:DXRxi型,美國Thermofisher公司;

紫外—可見分光光度儀:Cary UV-5000型,揚州貝歐生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 AuNFs的合成 取0.4 mL HAuCl4溶液(50 mmol/L)加入到含10 mL超純水的燒杯中,劇烈攪拌混勻,加入0.8 mL鹽酸多巴胺溶液(53 mmol/L),60 ℃水浴攪拌30 min,3 000 r/min離心10 min,去除上清液,向沉淀中加入1 mL超純水,混勻得AuNFs溶液,4 ℃貯藏備用。

1.3.2 SERS基底的制備 將PP合成紙切割成2 cm×2 cm小塊,并按3×3排列,在其表面滴50 mL AuNFs溶液,自然干燥即得研究使用的方陣排列SERS基底。

1.3.3 樣品前處理 取10 g冷凍豬肉,研磨,倒入50 mL離心管中。將13.5 mL乙腈和300,150,75,15 mL乙酸滴入離心管中,得到的乙酸體積分?jǐn)?shù)分別為2%,1%,0.5%,0.1%,并用超純水定容到15 mL。加入脫水劑,渦旋振蕩3 min,8 000 r/min離心5 min,取上清液于4 ℃貯藏備用。稱取一定量的硫酸慶大霉素和硫酸新霉素,加入豬肉提取液并超聲溶解。使用超純水梯度稀釋,最終得到濃度為1×10-10～1×10-3mol/L的豬肉提取液加標(biāo)樣品,并將樣品滴加到制備好的基底表面,選擇激發(fā)波長785 nm,曝光時間10 s和光源強度5 mW進(jìn)行SERS檢測。

增強因子(EF)是SERS檢測領(lǐng)域的一個重要參數(shù),表示信號分子與納米結(jié)構(gòu)表面相互作用的SERS信號的放大倍數(shù)。EF的計算需要仔細(xì)評估SERS和正常拉曼條件下的信號強度和分子數(shù)量,并按式(1)進(jìn)行計算。

(1)

式中:

FE——增強因子;

ISERS——4-MBA標(biāo)記的方陣排列SERS基底在當(dāng)前濃度(CSERS)測量的SERS強度;

IRS——僅有4-MBA的PP合成紙在當(dāng)前濃度(CRS)下的SERS強度。

1.3.4 SERS檢測條件的優(yōu)化 分別考察乙酸體積分?jǐn)?shù)(2.0%,1.0%,0.5%,0.1%)、脫水劑種類(NaCl、MgSO4和MgCl2)及脫水劑添加量對1×10-6mol/L氨基糖苷類抗生素濃度的豬肉提取液加標(biāo)樣品SERS光譜圖的影響。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析 樣本的拉曼光譜均采集3次,取平均值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNFs的表征

由圖1可知,AuNFs表面有許多不規(guī)則的突起,大小均一,顆粒大小約為500 nm。晶面是晶體具有一定空間角度的一系列平行平面,用垂直于平面的矢量表示。AuNFs的晶面間距為0.24 nm,表明AuNFs優(yōu)先在(111)晶面生長。AuNFs溶液在473 nm處有一個吸收峰。綜上,通過一步合成法,簡單、快速合成了大小均一,形貌均勻的AuNFs。

圖1 AuNFs的結(jié)構(gòu)表征圖

2.2 方陣排列SERS基底的表征

由圖2可知,PP合成紙表面有高密度的AuNFs,呈多層排列,可增強基底的SERS效應(yīng)。SERS映射的顏色在1 077 cm-1處的特征峰較為規(guī)則,說明以PP合成紙為襯底的方陣排列SERS基底有良好的均勻性。4-MBA標(biāo)記的方陣排列SERS基底有很強的SERS信號。當(dāng)CSERS為1×10-6mol/L,CRS為1 mol/L時,EF為3.9×107,高于金納米星的[24],表明AuNFs有很強的SERS表面增強效應(yīng)。

圖2 方陣排列SERS基底的表征圖

使用4個不同批次的方陣排列SERS基底分別檢測4-MBA,結(jié)果如圖2(d)所示。4次SERS光譜波形相似且在1 077 cm-1處RSD為7.01%。因此,該基底表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性。將制備好的SERS基底于4 ℃靜置1,7,14 d后,SERS光譜的波形和強度相似,且在1 077 cm-1特征峰處,貯藏14 d的SERS強度與貯藏1 d的相比僅下降了9.93%,說明AuNFs基底有較好的穩(wěn)定性,具有疏水特性的PP合成紙阻止了水性AuNFs溶液吸收,并使AuNFs均勻地保留在PP合成紙表面,因此方陣排列SERS基底表現(xiàn)出良好的性能。

2.3 硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的SERS光譜圖

硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的結(jié)構(gòu)式如圖3和表1所示。

表1 硫酸慶大霉素結(jié)構(gòu)組成

圖3 硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的結(jié)構(gòu)式

為了進(jìn)一步定量檢測豬肉中硫酸慶大霉素和硫酸新霉素殘留,對其特征峰進(jìn)行分析。由圖4可知,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素在997,1 074,1 572 cm-1處表現(xiàn)出明顯的特征峰,分別由H—N—H搖擺振動、C—O拉伸振動和N—H的彎曲振動引起[25],因此將這些特征峰歸屬于氨基糖苷類抗生素分子的SERS特征峰。而硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的SERS光譜圖分別在475,619 cm-1處表現(xiàn)出微弱且獨有的特征峰,是由H—N—H的扭轉(zhuǎn)振動和N—H的彎曲振動引起。因此,選擇475,619 cm-1處的峰作為硫酸慶大霉素和硫酸新霉素定性分析的特征峰,并以此處SERS信號強度確定最佳試驗條件,對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留進(jìn)行定量分析。

圖4 豬肉提取液的SERS光譜圖

2.4 SERS檢測條件的優(yōu)化

2.4.1 提取液 由圖5可知,當(dāng)乙酸體積分?jǐn)?shù)為1%時,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素的特征峰明顯。因此,采用90%乙腈(1%乙酸)水溶液作為提取液。

圖5 乙酸體積分?jǐn)?shù)對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS光譜圖的影響

2.4.2 脫水劑種類 由圖6可知,加入NaCl時,氨基糖苷類抗生素SERS特征峰明顯,因此,選擇NaCl作為脫水劑。

圖6 脫水劑種類對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS光譜圖的影響

2.4.3 脫水劑添加量 由圖7可知,當(dāng)NaCl添加量為2 g時,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素分別在475,619 cm-1特征峰處SERS強度最大,說明此時的脫水效果最佳。因此,選擇2 g NaCl作為脫水劑。

圖7 NaCl添加量對硫酸慶大霉素和硫酸新霉素SERS強度的影響

2.5 豬肉中氨基糖苷類抗生素的定量分析

由圖8可知,隨著加標(biāo)濃度的增加,硫酸慶大霉素和硫酸新霉素對應(yīng)特征峰SERS強度逐漸增強。硫酸慶大霉素加標(biāo)濃度為1×10-10mol/L的樣品在1 074,1 572 cm-1處有特征峰,但由于氨基糖苷類抗生素特征峰的共性,僅能將其定性為氨基糖苷類抗生素殘留,不能定性為硫酸慶大霉素殘留;而在475 cm-1處未表現(xiàn)出明顯的特征峰,因此選擇1×10-9mol/L作為硫酸慶大霉素的最低檢測限(LOD)。硫酸新霉素加標(biāo)濃度為1×10-9mol/L的樣品在619 cm-1處未表現(xiàn)出明顯的特征峰,因此選擇1×10-8mol/L作為硫酸新霉素的LOD。在475 cm-1特征峰處建立豬肉提取液硫酸慶大霉素加標(biāo)樣品的SERS強度與濃度(1×10-9～ 1×10-3mol/L)的對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y=395.98x+4 845.37,相關(guān)系數(shù)(R2)為0.991 6。在619 cm-1特征峰處建立豬肉提取液硫酸新霉素加標(biāo)樣品的SERS強度與濃度(1×10-8～ 1×10-3mol/L)的對數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,線性回歸方程為y=1 080.78x+9 280.72,R2為0.990 7。因此,方陣排列SERS基底可實現(xiàn)豬肉提取液加標(biāo)樣品的定量檢測。

圖8 豬肉提取液硫酸慶大霉素和硫酸新霉素加標(biāo)樣品的SERS光譜圖

由表2可知,試驗采用的方陣排列SERS基底檢測靈敏度高,僅次于間接競爭性化學(xué)發(fā)光酶免疫分析,且檢測速度快,有較好的穩(wěn)定性,因此SERS技術(shù)對氨基糖苷類抗生素的檢測具有較高的應(yīng)用前景。

表2 基于不同方法檢測氨基糖苷類抗生素

2.6 實際樣品中氨基糖苷類抗生素的測定

在最佳檢測條件下,豬肉樣品中未檢出氨基糖苷類抗生素殘留,說明該豬肉符合國家檢測標(biāo)準(zhǔn)。為驗證SERS方法的可行性,對1×10-6mol/L氨基糖苷類抗生素加標(biāo)濃度的豬肉提取液樣品進(jìn)行檢測,結(jié)果見表3。由表3可知,試驗方法的檢測回收率和酶聯(lián)免疫法的相近,結(jié)果無顯著性差異(P>0.05),且RSD均<8%,表明基于方陣排列SERS基底對豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留的檢測方法具有較高的準(zhǔn)確性和可行性。

表3 實際樣品中氨基糖苷類抗生素殘留的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

研究以疏水性PP合成紙為襯底,制備了一種基于AuNFs的方陣排列SERS基底。通過與QuEChERS方法結(jié)合,快速、定量和高通量檢測豬肉中氨基糖苷類抗生素殘留。基于PP合成紙的疏水特性,AuNFs聚集更加緊密,使該基底具有良好的均一性、穩(wěn)定性和SERS增強效應(yīng)。與傳統(tǒng)檢測方法相比,基于方陣排列SERS基底的檢測方法更加方便快捷、靈敏度高。后期探究不同肉類樣品對SERS信號的影響,實現(xiàn)肉類樣品中抗生素殘留經(jīng)濟(jì)、高效、高靈敏的檢測。