曹秀麗,黃 佩,馬金花,黃茂林,官亞寧,陳 艷,何志旭

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 小兒內(nèi)科,貴州 遵義 563006;2.貴州省兒童醫(yī)院 小兒內(nèi)科,貴州 遵義 563006;3.遵義醫(yī)科大學(xué) 組織損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,貴州 遵義 563003)

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-cell acute lymphoblastic leukemia,T-ALL)為一種由停滯在特定分化階段的 T 細(xì)胞前體轉(zhuǎn)化所致惡性血液系統(tǒng)腫瘤,目前主要以綜合化療為主,并在高風(fēng)險(xiǎn)病例中進(jìn)行同種異體造血干細(xì)胞移植,仍有約20%～30%的兒童 和40%的成人患者復(fù)發(fā)[1]。因此,進(jìn)一步了解其發(fā)病機(jī)制以改善治療效果及長期預(yù)后至關(guān)重要。UNC-51 樣激酶 1(Unc51-like autophagy activating kinase 1,ULK1)為一種自噬的起始蛋白,其正向和負(fù)向調(diào)節(jié)都可以根據(jù)情況保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受過度自噬,其活性受AMP激活蛋白激酶(adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK)的調(diào)節(jié)[2]。研究顯示,ULK1在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)患者中存在高表達(dá)且促進(jìn)AML的發(fā)生發(fā)展,MRT68921 HCl抑制ULK1以不依賴自噬方式誘導(dǎo)AML白血病細(xì)胞死亡[3]。Olivas-Aguirre等[4]予地塞米松干預(yù)T-ALL白血病細(xì)胞株引發(fā)了細(xì)胞線粒體斷裂,且誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生線粒體自噬,而線粒體自噬在糖皮質(zhì)激素耐藥 Jurkat 細(xì)胞株中充當(dāng)一種促生存機(jī)制,但ULK1在T-ALL中的具體作用目前仍未完全闡明。鑒于此,本研究通過抑制和激活ULK1在T-ALL細(xì)胞株CEM-C7上的表達(dá),進(jìn)一步檢測細(xì)胞的凋亡情況,探討其發(fā)生凋亡的生物學(xué)行為具體途徑及與AMPKα/ULK1軸之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、主要試劑及儀器 人T-ALL細(xì)胞株CEM-C7為四川大學(xué)華西醫(yī)院饋贈(zèng);ULK1激活劑LYN-1604(HY-101923B)、ULK1抑制劑MRT68921(HY-100006A)均從MedChemEepress公司購買;凋亡試劑盒(Annexin V-Alexa Fluor488/Pl Apoptosis Detection Kit)購自蘇州四正柏生物科技有限公司;Edu-488細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物;Agarose購自美國Sigma公司;線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)購于索萊寶生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國 Gibco公司;胎牛血清購于上海達(dá)特希爾生物科技有限公司;ULK1兔抗、Bcl-2兔抗、Bax兔抗、PCNA兔抗購于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司;Caspase3兔抗、Cleaved-caspase3兔抗、MTT噻唑藍(lán)、雙色預(yù)染蛋白Marker、BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL顯影液(MA0186-1,Meilunbio/美侖生物)均購于成都睿雅生物公司;p-ULK1(Ser317)兔抗購于Affinity公司;AMPKα兔抗、p-AMPKα(Ser172)兔抗購于美國CST公司;SDS-PAGE 配膠試劑盒購買于上海雅酶生物科技有限公司;0.22 μm PVDF膜購自美國Mili-pore公司;CO2細(xì)胞敷箱、酶標(biāo)儀購于America Thermo Scientific公司;透射電子顯微鏡購自日本HTTACHITDGC2-0.5; 超凈工作臺購自上海先鋒電器廠;蛋白凝膠成像系統(tǒng)購自美國BIO-RAD公司。

1.2 方法

1.2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 充分紫外照射消毒超凈臺,吸取適量對數(shù)生長期的CEM-C7細(xì)胞離心去上清后用含10% FBS1640培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)整濃度為3×105個(gè)/mL的密度接種于24孔板中,然后分別予不同濃度LYN-1604(0、1.2、2 μmol/L)、MRT68921(0、1.2、2 μmol/L)處理CEM-C7細(xì)胞,分為對照組、LYN-1604組、MRT68921組,細(xì)胞孵育箱中孵育24 h,用預(yù)冷的PBS洗滌2次,分別加入5 μL Annexin V-FITC 和10 μL碘化啶(PI),輕用槍頭混勻,避光孵育10 min,通過流式細(xì)胞術(shù)(BD Canto II Plus)進(jìn)行細(xì)胞凋亡率檢測。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖率 收集對數(shù)生長期CEM-C7細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為4.5×105個(gè)/孔,1.5 mL/孔接種于12孔板中,分別予2 μmol/L MRT68921、2 μmol/L LYN-1604干預(yù)對照組、MRT68921組、LYN-1604組、無Edu組,干預(yù)24 h后予EdU(10 mmol/L)/孔繼續(xù)37 ℃細(xì)胞孵育箱孵育2 h,收集細(xì)胞用預(yù)冷PBS清洗細(xì)胞后先后予4%多聚甲醛固定,3%BSA的PBS洗滌,0.3%Triton X-100的PBS透化,再以Edu-488試劑盒進(jìn)行染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞增殖率,FlowJo-10.8.1分析細(xì)胞增殖情況。

1.2.3 Soft agar檢測細(xì)胞克隆增殖 將處于對數(shù)生長期的CEM-C7細(xì)胞取出,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL,并分為對照組、2 μmol/L MRT68921組、2 μmol/L LYN-1604組,取1 mL 0.6%瓊脂(含20% FBS 2×1640培養(yǎng)基)鋪12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中作為下層瓊脂糖凝膠,4 ℃冰箱充分凝固30 min。取500 μL 20% FBS 2×1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并與等量0.6% 瓊脂混勻,平鋪在之前的0.6%瓊脂糖下層膠上,室溫放置15 min充分凝固,然后將裝有細(xì)胞的軟瓊脂培養(yǎng)板放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待到細(xì)胞長成肉眼可見的1～2 mm克隆球時(shí)(約2周),100 μL/孔5 mg/mL MTT進(jìn)行常溫避光染色1 h,掃描儀掃描并保存圖像,Image J分析細(xì)胞克隆情況。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位變化 使用JC-1染色試劑盒(M8650)檢測線粒體膜電位如下:將對數(shù)生長期CEM-C7細(xì)胞分為對照組、2 μmol/L MRT68921組、2 μmol/L LYN-1604組、CCCP陽性組,以3×105個(gè)/孔的密度接種在24孔板中,并在37 ℃下孵育24 h后,用1 mL培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。然后加入1 mL JC-1染色工作液,充分混勻細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min,取出細(xì)胞并用預(yù)冷的JC-1染色緩沖液洗滌2次,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化情況,FlowJo-10.8.1分析。

1.2.5 透射電鏡檢測細(xì)胞核及線粒體超微結(jié)構(gòu)變化 將對照組、1.2 μmol/L MRT68921組細(xì)胞離心棄上清后將細(xì)胞重懸保存于4 ℃電鏡固定液固定4 h,隨后用1%鋨酸避光室溫固定2 h,依次加入30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%酒精脫水,每次20 min,予丙酮∶812包埋劑=1∶1,37 ℃ 2～4 h,丙酮∶812包埋劑=1∶2,37 ℃滲透過夜,純812包埋劑包埋5～8 h。將純812包埋劑倒入包埋板,將樣品插入包埋板后37 ℃溫箱過夜。包埋板放于60 ℃烤箱聚合48 h,取出樹脂塊備用。用切片機(jī)(UC7,Leica,德國)對樣品進(jìn)行切片,150目方華膜銅網(wǎng)撈,銅網(wǎng)于2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min,70%酒精清洗3次,超純水清洗3次,2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min,超純水清洗3次,濾紙稍吸干,銅網(wǎng)切片放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。透射電子顯微鏡下觀察,采集圖像分析。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn) 將CEM-C7細(xì)胞以3×105個(gè)/mL的密度接種于6孔板中,并分為對照組、2 μmol/L MRT68921組、2 μmol/L LYN-1604組,細(xì)胞孵育箱孵育24 h后,離心棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷PBS洗兩遍,在含有蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物的高效RIPA裂解液(R0010)中進(jìn)行裂解。隨后,使用BCA蛋白定量試劑盒(PC0020)對總蛋白進(jìn)行定量。每孔約50 μg蛋白質(zhì),通過浸沒在電泳緩沖液中的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠進(jìn)行分離,然后從凝膠轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移緩沖液中的PVDF膜(0.22 μm,Millipore,美國)。隨后,用5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h。用 TBST 沖洗3遍,每遍10 min,將膜與一抗在4 ℃搖床孵育過夜。孵育16 h洗膜并與二抗室溫?fù)u床孵育1 h,然后用TBST洗膜。加入ECL顯色液,蛋白凝膠成像系統(tǒng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行可視化。Image J軟件對條帶進(jìn)行量化。

2 結(jié)果

2.1 ULK1對于CEM-C7細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比:1.2、2 μmol/L ULK1抑制劑MRT68921分別作用CEM-C7 細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05),2 μmol/L MRT68921組凋亡率明顯高于1.2 μmol/L MRT68921組(P<0.05);1.2、2 μmol/L ULK1激活劑LYN-1604分別作用CEM-C7 細(xì)胞24 h后,細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.05),并選擇2 μmol/L劑量做后續(xù)實(shí)驗(yàn)干預(yù)濃度。蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對照組相比2 μmol/L ULK1抑制劑MRT68921組凋亡蛋白效應(yīng)酶Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2有下降趨勢,促凋亡蛋白Bax無明顯改變。2 μmol/L ULK1激動(dòng)劑LYN-1604組凋亡蛋白效應(yīng)酶Cleaved-caspase3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05),提示抑制ULK1可促進(jìn)CEM-C7細(xì)胞凋亡,激活ULK1可抑制CEM-C7細(xì)胞凋亡(圖1)。

A、B、C:不同濃度LYN-1604及MRT68921對CEM-C7細(xì)胞凋亡率的影響;D、E、F、G:相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá);*、**、***:P<0.01、P<0.001、P<0.0001;ns:差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 ULK1對于CEM-C7細(xì)胞增殖率的影響 流式細(xì)胞術(shù)及Soft agar實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對照組相比,MRT68921干預(yù)CEM-C7 細(xì)胞24 h后,細(xì)胞增殖明顯下降(P<0.05),LYN-1604作用CEM-C7 細(xì)胞24 h后細(xì)胞增殖無明顯影響;蛋白印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對照組相比,MRT68921組增殖細(xì)胞核抗原PCNA蛋白表達(dá)有降低趨勢。提示ULK1可抑制CEM-C7細(xì)胞增殖(圖2)。

A、B、C:2 μmol/L LYN-1604及MRT68921對CEM-C7細(xì)胞增殖率的影響;D:增殖蛋白PCNA的表達(dá);E、F:Soft agar檢測CEM-C7細(xì)胞的克隆增殖;ns:與對照組相比,P>0.05;*、**:與對照組相比,P<0.05、P<0.01。

2.3 ULK1激活劑LYN-1604、ULK1抑制劑MRT68921對于CEM-C7細(xì)胞線粒體膜電位的影響 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與對照組相比,MRT68921干預(yù)CEM-C7 細(xì)胞24 h后,細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降(P<0.05),LYN-1604作用CEM-C7 細(xì)胞24 h后細(xì)胞線粒體膜電位無明顯變化(圖3);TEM實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,與對照組相比1.2 μmol/L MRT68921組CEM-C7細(xì)胞呈凋亡征象,細(xì)胞膜表面微絨毛消失,胞質(zhì)稀疏,細(xì)胞器腫脹并見凋亡小體,細(xì)胞核碎裂,染色質(zhì)大面積塊裝凝集,呈新月狀,線粒體明顯腫脹,嵴斷裂或消失,部分膜破損、基質(zhì)外溢,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴(kuò)張,脫顆粒,未見明顯自噬溶酶體。說明抑制ULK1可促進(jìn)CEM-C7細(xì)胞發(fā)生凋亡,結(jié)合抑制ULK1后CEM-C7細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降及抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)有下降趨勢,推測細(xì)胞發(fā)生凋亡可能與內(nèi)源性凋亡途徑即線粒體途徑有關(guān)。

A:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞膜電位;B:2 μmol/L LYN-1604組統(tǒng)計(jì)結(jié)果;C:2 μmol/L MRT68921組統(tǒng)計(jì)結(jié)果;D:CEM-C7細(xì)胞的TEM圖像;AB:凋亡小體(紅箭頭所指);ns:與對照組相比,P>0.05;*:與對照組相比,P<0.01。

2.4 抑制ULK1對于CEM-C7細(xì)胞中p-AMPKα(Ser172)、p-ULK1(Ser317)的影響 蛋白印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,MRT68921干預(yù)CEM-C7細(xì)胞24 h后,細(xì)胞中p-AMPKα、p-ULK1均有下降(P<0.05,圖4),提示MRT68921抑制ULK1后抑制了ULK1磷酸化317位點(diǎn)的表達(dá),同時(shí)抑制AMPKα172磷酸化位點(diǎn)的表達(dá),說明MRT68921引起CEM-C7細(xì)胞發(fā)生凋亡,可能是通過抑制AMPKα/ULK1軸的磷酸化水平導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。

A:AMPKα/ULK1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá);B:相關(guān)蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果;*、**:與對照組相比,P<0.05、P<0.01。

3 討論

急性T淋巴細(xì)胞白血病(T-ALL)為一種惡性T細(xì)胞發(fā)育的侵襲性血液系統(tǒng)腫瘤,約占兒童ALL病例的15%和成人ALL病例的25%[5],具有高度異質(zhì)性和白細(xì)胞高、造血功能衰竭、中樞神經(jīng)系統(tǒng)浸潤等不良臨床特征[6],目前該疾病的治療主要以化療為主,但化療藥物的耐藥及疾病的復(fù)發(fā)導(dǎo)致了治療的失敗。T-ALL在兒童的總體生存率低于急性B淋巴細(xì)胞白血病(B-cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL),耐藥復(fù)發(fā)后5年總體生存率(OS)<35%,成人生存率約為50%[7-9],化療后的同種異體干細(xì)胞移植及選擇性 T-ALL 活性的新型藥物(例如奈拉濱)可能會(huì)改善某些患者的生存率,但強(qiáng)化化療后的嚴(yán)重細(xì)胞毒性、移植配型困難、新型藥物的有限選擇范圍及昂貴的價(jià)格讓許多患者望而卻步。由此,尋找新的更為安全有效的分子靶向藥物顯得尤為重要。ULK1 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,以哺乳動(dòng)物中自噬的啟動(dòng)子而聞名,與酵母中的自噬相關(guān)蛋白 (ATG) 1 和秀麗隱桿線蟲中的 UNC-51 具有同源性[10]。其功能可受AMPK磷酸化和激活調(diào)節(jié)[11-12],由于Atg1/ULK1在蛋白質(zhì)運(yùn)輸、能量和營養(yǎng)感應(yīng)等過程發(fā)揮的關(guān)鍵作用,導(dǎo)致ULK1與自噬或非自噬途徑相關(guān)的疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),且多項(xiàng)研究已證明ULK1參與了癌癥[13]、神經(jīng)性疾病[14-15]、血液疾病[16]等疾病的發(fā)生,靶向ULK1的小分子藥物對多種疾病都具有一定療效[17-18]。故對ULK1抗T-ALL作用及機(jī)制研究尤為重要。

目前有關(guān)ULK1的研究主要與細(xì)胞自噬密切相關(guān),但自噬、細(xì)胞凋亡與腫瘤之間的關(guān)系仍未完全闡明,其具體分子機(jī)制也知之甚少。細(xì)胞凋亡為Ⅰ型程序性細(xì)胞死亡,可決定細(xì)胞的死亡,而自噬是為了細(xì)胞的生存,然而細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的細(xì)胞死亡比自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡更為被普遍接受和認(rèn)可[19-21]。Yang等[22]研究發(fā)現(xiàn)ULK1在AML細(xì)胞株及T-ALL細(xì)胞株中存在高表達(dá),抑制ULK1誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡與細(xì)胞自噬無關(guān),但其具體機(jī)制還未完全闡明。也有研究表明應(yīng)激激酶p38α可以磷酸化ULK1 Ser555,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。Biswas等[24]也表明,過度的自噬也會(huì)導(dǎo)致凋亡細(xì)胞死亡。Petricca等[25]予巴弗洛霉素A1抑制自噬導(dǎo)致MIX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增強(qiáng),而AMPK (Thr 172)磷酸化進(jìn)一步激活ULK1 Ser 555 磷酸化改變也參與其中。故本研究首先探索了ULK1在T-ALL細(xì)胞株CEM-C7細(xì)胞中的抗凋亡作用。本研究結(jié)果表明,ULK1抑制劑MRT68921作用于CEM-C7后,細(xì)胞凋亡率明顯增加,凋亡蛋白Cleaved-caspase3在CEM-C7細(xì)胞的表達(dá)增加,而ULK1激動(dòng)劑LYN-1604處理組凋亡蛋白Cleaved-caspase3表達(dá)降低,說明ULK1在CEM-C7細(xì)胞中具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的作用。但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Liu等[26]研究表明NVP-BEZ235通過 AMPK/ULK1 途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬,敲低 AMPK 或 ULK1 來阻斷自噬可抑制細(xì)胞增殖,并進(jìn)一步促進(jìn) NVP-BEZ235 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而抑制自噬可明顯抑制細(xì)胞增殖,但不具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用,而顯著增加NVP-BEZ235誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示抑制ULK1后CEM-C7細(xì)胞發(fā)生了明顯的細(xì)胞凋亡,并抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖,且該過程可能與AMPKα/ULK1的磷酸化調(diào)控有關(guān),這與上述研究部分結(jié)果一致,結(jié)合TEM對細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察,CEM-C7細(xì)胞也明顯呈細(xì)胞凋亡表現(xiàn)且無明顯自噬溶酶體表現(xiàn),說明ULK1也可能通過非自噬途徑導(dǎo)致疾病的發(fā)生,也有可能自噬也參與了CEM-C7抗凋亡的過程,但最終未以自噬的形式表現(xiàn)出來。

綜上所述,抑制ULK1可明顯增加T-ALL細(xì)胞株CEM-C7的凋亡,并抑制其增殖,引起細(xì)胞線粒體膜電位下降,導(dǎo)致細(xì)胞線粒體凋亡,且可能受AMPKα/ULK1軸磷酸化水平的影響。因此,抑制細(xì)胞ULK1的表達(dá),可能為治療T-ALL提供新的選擇方案。但自噬是否參與其中需進(jìn)一步驗(yàn)證,且本研究僅限于體外細(xì)胞層面的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,未來可在白血病小鼠模型及臨床實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用比較治療T-ALL的效果,并進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。