劉戀戀,吉雨恬,劉嬌莉,韓婧怡,李開(kāi)遠(yuǎn),張 淳,韓 勇

(遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

心肌細(xì)胞凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡形式,是心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI)、缺血性心肌病、心肌梗死以及心力衰竭等多種心臟疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的重要因素和主要病理特征[1-2]。20-羥二十烷四烯酸(20-hydroxyeicosatetraenoic acid,20-HETE)是經(jīng)細(xì)胞色素P450(CYP)4A/ 4F酶ω-羥化途徑催化花生四烯酸生成的一種具有血管活性的類(lèi)花生四烯酸[3]。在血管系統(tǒng)中,20-HETE可通過(guò)其血管收縮效應(yīng)、發(fā)揮血壓調(diào)節(jié)作用,從而參與高血壓、腦卒中等疾病的發(fā)生、發(fā)展[4]。近年在心臟的研究中證實(shí),20-HETE通過(guò)線(xiàn)粒體依賴(lài)性的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡信號(hào)通路,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,在MIRI、缺血性心肌病等心臟疾病中發(fā)揮重要作用[5-6],但其中的分子、細(xì)胞機(jī)制還不清楚,尤其是最近發(fā)現(xiàn)的20-HETE作用受體——G 蛋白偶聯(lián)受體75(G-protein-coupled receptor 75,GPR75),在其中發(fā)揮何種作用亟待研究。

GPR75受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族中視紫紅質(zhì)樣受體[7-8],自發(fā)現(xiàn)以來(lái)該受體的生物功能及配體研究一直不明確。最近,在血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞以及前列腺癌PC-3和LNCaP細(xì)胞、3T3-1分化的脂肪細(xì)胞、肺癌細(xì)胞系NCI-H460等研究中發(fā)現(xiàn),GPR75受體可被20-HETE激活并綁定,從而在調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞收縮、誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙以及促腫瘤細(xì)胞增殖和遷移等方面發(fā)揮重要作用[9-12]。本課題組前期在心臟中的研究表明,GPR75受體在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞及H9c2心肌細(xì)胞中表達(dá),且敲減其表達(dá)可有效降低20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用[13],但是其中的深入機(jī)制尚待進(jìn)一步闡明。因此,本研究在此基礎(chǔ)上,擬觀察GPR75受體偶聯(lián)的G蛋白信號(hào)通路在20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用與機(jī)制,為確證GPR75是20-HETE發(fā)揮生物作用的受體提供新的證據(jù),也為揭示20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 20-HETE、AAA購(gòu)自美國(guó)Cayman公司;PTX、U73122、Wortmannin購(gòu)自美國(guó)MCE公司;慢病毒包裝試劑盒購(gòu)自美國(guó)GeneCopoeia公司;IP3和NADPH氧化酶ELISA試劑盒購(gòu)自江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司; Fluo-4/AM及JC-1熒光探針購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;DHE活性氧檢測(cè)試劑盒及TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;抗體anti-GPR75、anti-EGFR、anti-ERK1/2、anti-AKT、anti-GSK3β、anti-Caspase-3、anti-Bcl-2一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;anti-p-EGFR、anti-p-ERK1/2、anti-p-AKT、anti-p-GSK3β和anti-Cyt C抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司;anti-Bax抗體購(gòu)自美國(guó)MCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 大鼠H9c2心肌細(xì)胞由中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)提供,細(xì)胞在恒溫37 ℃及5%CO2環(huán)境中,使用10%完全培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),20-HETE(100 nmol/L)孵育處理 24 h,其他組別依據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康?在 20-HETE 處理前1 h,參考相關(guān)文獻(xiàn)分別加入不同濃度的預(yù)處理藥物 :AAA(1 μmol/L)、U73122(1 μmol/L)、PTX(100 ng/mL)、Forskolin(20 μmol/L)和 Wortmannin(2 μmol/L),培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)[14]及試劑商說(shuō)明,通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的方法引入靶向GPR75的shRNA干擾載體及對(duì)照shCtrl轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞,慢病毒干擾載體由美國(guó)GeneCopoeia公司構(gòu)建,針對(duì)GPR75靶基因設(shè)計(jì)4個(gè)干擾克隆。培養(yǎng)的H9c2心肌細(xì)胞達(dá)到60%～70%的匯合度后,慢病毒轉(zhuǎn)染處理24 h,觀察熒光表達(dá)情況,更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h,RT-qPCR及Western blot評(píng)價(jià)敲減效率。

1.2.2 IP3及cAMP含量檢測(cè) 各組心肌細(xì)胞處理后提取蛋白,將HRP標(biāo)記的特異性抗體與樣本共孵育1 h(37 ℃),反應(yīng)體系中添加顯色溶液并在避光條件下孵育15 min(37 ℃),450 nm波長(zhǎng)的光譜下,酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的吸光度。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)處理后,加入Fluo-4/AM(4 μmol/L)熒光染料與Pluronic F-127的混合液,37 ℃避光染色40 min,激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm),ZEN2.3軟件分析。

1.2.4 細(xì)胞內(nèi)ROS含量檢測(cè) 各組細(xì)胞經(jīng)處理后,加入DHE熒光染料(10 μmol/L),37 ℃避光孵育35 min,激光共聚焦顯微鏡下熒光成像(激發(fā)波長(zhǎng)535 nm,發(fā)射波長(zhǎng)610 nm),ZEN2.3軟件分析。

1.2.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)藥物處理后,4%多聚甲醛室溫固定,TUNEL染色工作液于37 ℃下避光處理1 h,DAPI復(fù)染細(xì)胞核,熒光顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)不同視野(200×),統(tǒng)計(jì)綠色熒光與藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞數(shù)量比值。

1.2.6 線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)檢測(cè) 細(xì)胞處理后加入JC-1(10 μg/mL)熒光染料避光孵育30 min,激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光圖像,正常ΔΨm時(shí)JC-1呈多聚體(aggeregates,激發(fā)波長(zhǎng)510 nm,發(fā)射波長(zhǎng)580 nm,紅色熒光);ΔΨm降低時(shí),JC-1呈單體(monomers,激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)525 nm,綠色熒光),ZEN2.3軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.2.7 RT-qPCR Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA,反應(yīng)條件為:94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40個(gè)循環(huán);GPR75引物序列為上游:5′-GCCACAAGCCTGGTCTACAAA-3′;下游:5′-GTGCTCTGGTGCCTGCGATAC-3′;GADPH上游:5′-TCTCTGCTCCTCCCTGTTC-3′;下游:5′-ACACCGACCTTCACCATCT-3′。

1.2.8 Western blot檢測(cè) 提取各組細(xì)胞蛋白,BCA法測(cè)定蛋白濃度,SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后,一抗孵育4 ℃過(guò)夜(GPR75、EGFR、p-EGFR、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT、p-AKT、GSK3β、p-GSK3β、Cyt C、Caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin和GAPDH用作內(nèi)參),二抗室溫孵育,ECL法顯影,ImageJ 1.48軟件分析灰度值。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞GPR75受體的表達(dá) 本研究構(gòu)建了針對(duì)GPR75基因序列的4個(gè)shRNA干擾慢病毒載體shGPR75-1～4,轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞后,通過(guò)RT-qPCR和Western blot檢測(cè)GPR75受體的mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),shGPR75-1組和shGPR75-4組H9c2心肌細(xì)胞GPR75表達(dá)顯著降低,其中shGPR75-4組中GPR75受體的mRNA和蛋白表達(dá)水平分別降低67.16%和63.99%(P<0.05,圖1)。

A: Real-time qPCR檢測(cè)GPR75受體mRNA表達(dá);B: Western blot檢測(cè)GPR75受體蛋白表達(dá);*: 與Control組相比,P <0.05;n=4。

2.2 敲減GPR75受體表達(dá)或阻斷其作用對(duì)20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的影響 TUNEL檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20-HETE(100 nmol/L)處理組及20-HETE處理轉(zhuǎn)染shCtrl組心肌細(xì)胞凋亡率均明顯升高(P<0.05);而敲減GPR75表達(dá)或應(yīng)用AAA(1 μmol/L)預(yù)處理后均顯著抑制了20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用(P<0.05,圖2A)。線(xiàn)粒體膜電位(ΔΨm)水平檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2B),敲減GPR75表達(dá)或AAA預(yù)處理,顯著逆轉(zhuǎn)了20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ΔΨm下降效應(yīng)(P<0.05)。與上述結(jié)果類(lèi)似,通過(guò)對(duì)線(xiàn)粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果顯示(圖2C、D),與20-HETE處理組相比,敲減GPR75表達(dá)或AAA預(yù)處理,可阻斷20-HETE誘導(dǎo)的Bax、Cyt C和Caspase-3蛋白表達(dá)增高以及Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。

A: TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率;B: JC-1染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞ΔΨm;C: Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá);D: Western blot檢測(cè)Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá);*: 與Control組相比,P <0.05;#: 與20-HETE組相比,P <0.05;n=4。

2.3 20-HETE對(duì)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)IP3及cAMP含量的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示(圖3A),與對(duì)照組相比,20-HETE處理后細(xì)胞內(nèi)IP3含量升高 3.66 倍(P<0.05);而敲減GPR75表達(dá)、應(yīng)用AAA或者PLC信號(hào)通路阻斷劑U73122(1 μmol/L)預(yù)處理后,有效阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的該效應(yīng)(P<0.05);應(yīng)用Gαi蛋白活化抑制劑PTX(100 ng/mL)處理后,未影響20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)IP3生成增高作用(P>0.05)。對(duì)cAMP含量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖3B),雖然使用cAMP生成誘導(dǎo)劑Forskolin(20 μmol/L)處理后可顯著升高含量,但是無(wú)論20-HETE處理、敲減GPR75受體或者AAA處理,均對(duì)cAMP生成無(wú)明顯影響(P>0.05)。如上結(jié)果提示, GPR75受體被20-HETE激活后,通過(guò)活化與其偶聯(lián)的Gαq而非Gαi/Gαs蛋白信號(hào)通路,參與20-HETE對(duì)心臟功能的調(diào)節(jié)作用。

A: ELISA檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)IP3含量;B: ELISA檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量;*: 與Control組相比,P <0.05;#: 與20-HETE組相比,P <0.05;n=3。

2.4 GPR75受體介導(dǎo)信號(hào)通路對(duì)20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞Ca2+濃度和ROS生成的影響 Fluo-4/ AM染色檢測(cè)結(jié)果顯示(圖4A),與對(duì)照組相比,20-HETE處理后H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著升高(P<0.05);而敲減GPR75、應(yīng)用AAA或U73122預(yù)處理后,顯著抑制了20-HETE上述作用(P<0.05);而Gαi蛋白活化抑制劑PTX處理組與20-HETE組無(wú)顯著差異(P>0.05)。DHE染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成,結(jié)果顯示(圖4B),20-HETE處理后心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成顯著升高(P<0.05);而敲減GPR75表達(dá)、應(yīng)用AAA或U73122處理后則有效阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的促心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成作用(P<0.05); PTX處理組與20-HETE組無(wú)顯著差異(P>0.05)。

A: Fluo-4/AM染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度;B: DHE染色法檢測(cè)心肌細(xì)胞內(nèi)ROS生成;*: 與Control組相比,P <0.05;#: 與20-HETE組相比,P <0.05;n=4。

2.5 20-HETE對(duì)GPR75受體下游調(diào)控蛋白磷酸化作用 Western Blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,20-HETE處理后H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)EGFR、ERK1/2、AKT以及GSK3β蛋白的磷酸化水平顯著升高(圖5,P<0.05);而敲減GPR75表達(dá)或者應(yīng)用AAA預(yù)處理均顯著抑制了20-HETE誘導(dǎo)的上述蛋白磷酸化作用(P<0.05)。

A: Western blot檢測(cè)p-EGFR、p-ERK1/2蛋白表達(dá);B: Western blot檢測(cè)p-AKT、p-GSK3β蛋白表達(dá);*: 與Control組相比,P <0.05;#: 與20-HETE組相比,P <0.05;n=4。

2.6 GPR75受體介導(dǎo)信號(hào)通路在20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用 GPR75受體介導(dǎo)信號(hào)通路在20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的作用見(jiàn)圖6。應(yīng)用PLC信號(hào)通路抑制劑U73122及PI3K信號(hào)通路抑制劑Wortmannin(2 μmol/L)預(yù)處理后, TUNEL檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率,與對(duì)照組相比,20-HETE處理后H9c2心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05); 而應(yīng)用U73122和Wortmannin預(yù)處理后可顯著抑制20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用(P<0.05,圖6A)。JC-1染色及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(圖6B、C),H9c2心肌細(xì)胞使用U73122和Wortmannin預(yù)處理后,明顯阻斷了20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞ΔΨm下降、Bax、Cyt C和Caspase-3蛋白表達(dá)增高以及Bcl-2蛋白表達(dá)降低效應(yīng)(圖6D,P<0.05)。

A: TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡率;B: JC-1染色法檢測(cè)心肌ΔΨm;C: Western blot檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá);D: Western blot檢測(cè)Cyt C、Caspase-3蛋白表達(dá);*: 與Control組相比,P <0.05;#: 與20-HETE組相比,P <0.05;n=6。

3 討論

近年在臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中證實(shí),心臟中表達(dá)CYP4A/4F酶,在MIRI、心肌梗死等心臟疾病中,心肌組織內(nèi)20-HETE過(guò)量生成,抑制CYP4A/4F酶作用,減少20-HETE合成,對(duì)于心臟功能恢復(fù)具有重要作用[5-6]。課題組前期在心臟中的研究發(fā)現(xiàn),20-HETE可通過(guò)促進(jìn)心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)生成以及誘導(dǎo)Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)失衡,引起心肌線(xiàn)粒體功能障礙從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15],這可能是20-HETE導(dǎo)致MIRI后加重心肌梗死發(fā)生的重要機(jī)制。最近,Garcia等[16]在血管系統(tǒng)的研究中,首次報(bào)道20-HETE對(duì)GPR75受體具有明顯的激活效應(yīng),并通過(guò)GPR75受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞收縮以及誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂,從而在高血壓等心血管疾病中發(fā)揮重要作用。

GPR75受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體(g-protein coupled receptors,GPCRs)家族中視紫紅質(zhì)樣受體,其生物學(xué)功能及內(nèi)源性配體尚未完全闡明[17]。 除Garcia等[16]在血管系統(tǒng)中的相關(guān)研究外,最近Cárdenas等[18]在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn),敲減GPR75表達(dá)或者應(yīng)用一種水溶性的GPR75受體拮抗劑——N-disodium succinate-20-hydroxyeicosa 6(Z),15(Z)-diencarboxamide(AAA),可顯著阻斷20-HETE誘導(dǎo)的前列腺腫瘤細(xì)胞向惡性表型的分化。以及在肺癌細(xì)胞系NCI-H460中敲低CYP4F11基因可顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖和遷移,同時(shí)20-HETE的產(chǎn)生顯著降低[12]。Gilani等[19]的研究同樣表明,應(yīng)用AAA處理后可有效抑制20-HETE誘導(dǎo)的3T3-1脂肪細(xì)胞胰島素受體磷酸化,證實(shí)GPR75受體參與20-HETE對(duì)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的干擾作用。本課題組前期在心臟中的研究,觀察到GPR75受體在培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞及H9c2心肌細(xì)胞中表達(dá),且通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)干擾敲減GPR75受體表達(dá)后,可有效抑制20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用[13-14]。與上述結(jié)果一致,本研究中敲減GPR75表達(dá)或應(yīng)用AAA抑制其作用后,顯著抑制了20-HETE誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞凋亡,同時(shí)逆轉(zhuǎn)了20-HETE誘發(fā)的心肌細(xì)胞線(xiàn)粒體膜電位下降以及凋亡相關(guān)蛋白Bax、CytC、Caspase-3蛋白表達(dá)升高等效應(yīng),為確證20-HETE通過(guò)GPR75受體介導(dǎo)調(diào)節(jié)心臟功能提供了新的證據(jù)。但是,GPR75受體介導(dǎo)的信號(hào)通路參與20-HETE誘導(dǎo)心肌功能損傷的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。

GPR75受體作為典型的GPCRs,與其偶聯(lián)的G蛋白是聯(lián)系細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白,該蛋白是由α、β以及γ 3個(gè)亞單位構(gòu)成的異三聚體,其中Gα亞基是其主要功能亞單位,依據(jù)基因序列的同源性和功能不同,Gα亞基可分為Gαs、Gαi、Gαq和Gα124大類(lèi)[20]。其中,Gαs、Gαi蛋白主要參與cAMP信號(hào)通路激活,而Gαq蛋白則通過(guò)激活I(lǐng)P3信號(hào)通路發(fā)揮功能調(diào)節(jié)作用[21]。本研究中,首先觀察到20-HETE處理后可顯著增加H9c2細(xì)胞內(nèi)IP3含量,但對(duì)cAMP生成無(wú)顯著影響,提示GPR75受體激活后參與20-HETE生物作用與Gαq蛋白的活化密切相關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該結(jié)論,本研究通過(guò)敲減GPR75基因表達(dá)、應(yīng)用AAA阻斷GPR75受體作用或者U73122阻斷Gαq蛋白下游重要信號(hào)分子——PLC的作用,均觀察到可顯著抑制20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)IP3生成;與之相反,雖然使用cAMP生成誘導(dǎo)劑Forskolin明顯升高了cAMP含量,但無(wú)論20-HETE處理還是敲減GPR75表達(dá)或阻斷其作用均對(duì)cAMP生成無(wú)顯著影響。這表明20-HETE激活GPR75受體后,通過(guò)活化Gαq蛋白及其介導(dǎo)的信號(hào)通路發(fā)揮心臟功能調(diào)節(jié)作用。

心肌細(xì)胞內(nèi)IP3生成后可通過(guò)1,4,5-三磷酸肌醇受體介導(dǎo)誘發(fā)肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+釋放[22],Ca2+不僅參與心肌收縮/舒張功能,并且作為第二信使是調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)分子[23]。本研究中,敲減GPR75表達(dá)、阻斷其作用或者抑制PLC信號(hào)通路,除明顯阻斷20-HETE誘導(dǎo)的IP3生成,同時(shí)也減少了心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。此外,心肌細(xì)胞內(nèi)ROS過(guò)量生成導(dǎo)致的氧化應(yīng)激損傷是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的另一重要途徑[24-25],本研究中同樣發(fā)現(xiàn),GPR75受體及Gαq蛋白介導(dǎo)的PLC信號(hào)通路在20-HETE誘導(dǎo)ROS過(guò)量生成中發(fā)揮重要作用。另外,應(yīng)用PTX特異性阻斷Gαi蛋白信號(hào)通路,對(duì)20-HETE誘導(dǎo)的Ca2+濃度升高和ROS生成無(wú)明顯影響,再次證實(shí)GPR75受體介導(dǎo)20-HETE生物效應(yīng)的非Gαi/Gαs依賴(lài)機(jī)制。如上結(jié)果表明,GPR75受體由20-HETE激活后,通過(guò)活化與其偶聯(lián)的Gαq蛋白,經(jīng)PLC信號(hào)通路誘導(dǎo)IP3生成,導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載以及ROS過(guò)量生成,從而參與20-HETE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用。

研究證實(shí),GPCRs被相應(yīng)配體激活后,可通過(guò)活化Gαq蛋白繼而磷酸化激活EGFR、ERK1/2、AKT以及GSK3β等信號(hào)激酶[26],而EGFR/ERK/AKT/GSK3β信號(hào)通路的激活被證明在心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27-29]。本研究觀察到,H9c2心肌細(xì)胞使用20-HETE處理后,EGFR、ERK1/2、AKT以及GSK3β等蛋白磷酸化水平顯著提高,敲減GPR75表達(dá)或阻斷其作用可有效逆轉(zhuǎn)20-HETE上述作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn),應(yīng)用Wortmannin阻斷AKT上游PI3K信號(hào)通路后,具有明顯抑制20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡的作用。這些結(jié)果提示20-HETE通過(guò)GPR75受體介導(dǎo),活化與其偶聯(lián)的Gαq蛋白,磷酸化激活細(xì)胞膜上EGFR,繼而激活ERK/AKT/GSK3β信號(hào)通路,最終發(fā)揮誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡作用。

綜上所述,本研究在H9c2心肌細(xì)胞中,明確了GPR75受體偶聯(lián)的Gαq蛋白及其介導(dǎo)的PLC、EGFR/ERK/AKT/GSK3β信號(hào)通路在20-HETE誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡中的重要作用,為深入闡明20-HETE在心臟中的生理、病理學(xué)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。同時(shí),也為探究GPR75受體在機(jī)體內(nèi)的生物學(xué)功能,拓展了研究思路與領(lǐng)域。后續(xù)研究中,尚需進(jìn)一步探究20-HETE對(duì)于GPR75受體的直接綁定效應(yīng),以及過(guò)表達(dá)GPR75后探究該受體在20-HETE誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用,從而確證20-HETE誘導(dǎo)心肌損傷的GPR75受體依賴(lài)性機(jī)制。