陳相霖 汪 靜 朱曉寧 張玉蓉 彭昭宣

1.西南醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院 (四川 瀘州, 646000) 2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院肝膽病科

肝細(xì)胞癌(以下簡稱肝癌)是原發(fā)性肝癌的主要組織學(xué)類型,是全球第七大常見癌癥,也是第三大癌癥相關(guān)死因[1]。早期肝癌可通過手術(shù)切除、消融或肝移植等進(jìn)行治療,激酶抑制劑和免疫治療成為中晚期肝癌患者主要選擇。然而肝癌患者五年的相對生存率僅18%[2]。肝癌內(nèi)含有豐富血管,與新生血管生成密切相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)在肝癌細(xì)胞間質(zhì)中過度表達(dá),是干預(yù)肝癌生成和發(fā)展的重要因子[3,4]。索拉非尼是被BCLC分期系統(tǒng)推薦用于晚期肝癌治療的一線靶向藥物,能通過抑制VEGF和PDGF在內(nèi)的酪氨酸激酶受體的活性,來抑制腫瘤內(nèi)部的新生血管的生成和腫瘤增殖,有效延長中晚期肝癌患者生存時間[5,6]。單一的索拉非尼治療的患者的中位生存時間僅延長10.7月,毒副作用較大且總體預(yù)后差[7]。諸多證據(jù)證實(shí),草藥中的天然化合物具有多活性成分、多靶點(diǎn)和低毒性等優(yōu)點(diǎn),是抑制惡性腫瘤的理想候選者,逐漸被選為全球手術(shù)、化療和放療后癌癥患者的補(bǔ)充和替代療法[8]。

研究團(tuán)隊總結(jié)臨床肝癌治療經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)制的和樞消積丸已獲國家專利并成為院內(nèi)制劑。前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,和樞消積丸可抑制人肝癌細(xì)胞增殖、遷移,促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡[9]。因此,本研究通過構(gòu)建H22皮下異位肝癌動物模型,觀察和樞消積丸對H22荷瘤小鼠的抑瘤作用,初步探討其抗肝癌機(jī)制, 積極尋找有效抗肝細(xì)胞癌的中西結(jié)合治療方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 實(shí)驗(yàn)動物:雄性BALB/c小鼠,清潔級,鼠齡5～6周,體重18～20 g,來源于成都生物實(shí)驗(yàn)動物有限公司(生產(chǎn)許可:四川SCXK2020-034)。細(xì)胞株:小鼠肝癌腹水瘤細(xì)胞系H22細(xì)胞(中國碧云天公司)。實(shí)驗(yàn)藥物:和樞消積丸由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供,中藥材的煎劑、提取、濃縮由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)院制劑科完成,根據(jù)人與動物之間表面積的轉(zhuǎn)換比進(jìn)行劑量轉(zhuǎn)換[10]。索拉非尼購自北京索萊寶科技有限公司(生產(chǎn)批號222B024)。主要試劑:HE染色試劑盒購自北京索萊寶公司(批號G1120),VEGF抗體、PDGF抗體購自美國Abcam公司(批號ab51745、ab23914),β-Actin抗體購自北京索萊寶公司(批號K0218),天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)均購自南京建成生物工程(批號C009-2、C010-2)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 隨機(jī)分組,實(shí)驗(yàn)組30只小鼠均在右腋窩皮下注射200 μl H22細(xì)胞懸液(4.5×106個/ml),空白組小鼠5只不做特殊處理。第3天觸及直徑達(dá)2～4 mm的瘤體則造模成功。將30只H22荷瘤小鼠隨機(jī)分為6組(每組5只):模型組、中藥低劑量組(1.37 g/kg和樞消積丸)、中藥中劑量組(2.73 g/kg和樞消積丸)、中藥高劑量組(5.46 g/kg和樞消積丸)、索拉非尼組(30 mg/kg索拉非尼)、聯(lián)合組(30 mg/kg索拉非尼聯(lián)合5.46 g/kg和樞消積丸)[11],持續(xù)灌胃14 d。實(shí)驗(yàn)期間,每3 d測量1次腫瘤大小,計算腫瘤體積,腫瘤體積=(長度×寬度2)/2。實(shí)驗(yàn)結(jié)束剝離瘤體,測量瘤重,計算抑瘤率,抑瘤率=治療后瘤重/模型組瘤重。新鮮瘤組織固定并脫水,通過HE染色觀察腫瘤細(xì)胞病理改變。測量小鼠肝功能(AST、ALT水平)。通過免疫組化和Western Blotting法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、PDGF蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 H22荷瘤小鼠的生命活動和體重變化 模型組和索拉非尼組小鼠出現(xiàn)明顯食欲不振、運(yùn)動緩慢、精神狀態(tài)低下、腹瀉等癥狀;聯(lián)合組小鼠運(yùn)動敏捷,精神狀態(tài)、食欲良好且大便正常。各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后體重比及各組間體重比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。結(jié)果表明,和樞消積丸具有提高H22荷瘤小鼠生活質(zhì)量和改善索拉非尼毒副作用的潛能,且對小鼠體重?zé)o明顯影響。

表1 H22荷瘤小鼠體重變化情況

2.2 H22荷瘤小鼠異位瘤體積和瘤重 見表2。結(jié)果表明,和樞消積丸具有單獨(dú)抑制肝癌生長和增殖的能力,與索拉非尼聯(lián)用時效果最佳。

表2 實(shí)驗(yàn)小鼠H22異位瘤體積及瘤重變化情況

2.3 H22荷瘤小鼠肝功能變化 見圖1。結(jié)果表明,和樞消積丸具有改善肝功能、減緩肝損傷的功效,與索拉非尼聯(lián)用效果優(yōu)于單用索拉非尼。

與模型組比較,*P<0.01

2.4 H22皮下異位瘤組織學(xué)變化 模型組小鼠的腫瘤細(xì)胞排列緊密,細(xì)胞膜較完整;中藥低、中、高劑量組小鼠的腫瘤細(xì)胞均發(fā)生不同程度的破裂和壞死,與劑量呈正相關(guān);聯(lián)合組小鼠的腫瘤細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)紊亂明顯。各組小鼠病理組織結(jié)構(gòu)紊亂程度與腫瘤增長指數(shù)趨勢負(fù)相關(guān)。見圖2。結(jié)果表明,和樞消積丸能破環(huán)腫瘤細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu),具有抑瘤作用,并且能夠提高索拉非尼抑制肝癌細(xì)胞增殖和發(fā)展的潛力。

圖2 H22荷瘤小鼠瘤組織病理結(jié)構(gòu)改變(HE,200×)

2.5 H22皮下異位瘤的VEGF和PDGF蛋白表達(dá) 與模型組比較,各治療組小鼠瘤組織的VEGF和PDGF蛋白表達(dá)均下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。免疫組化實(shí)驗(yàn)顯示,VEGF和PDGF陽性細(xì)胞的數(shù)量與和樞消積丸的劑量呈負(fù)相關(guān)。與單用和樞消積丸或索拉非尼比較,聯(lián)合治療時瘤組織VEGF和PDGF表達(dá)下降最為明顯(P<0.01),與Western Blotting法檢測結(jié)果基本一致。見圖3。結(jié)果表明,和樞消積丸具有抑制VEGF和PDGF表達(dá)的中藥,能夠協(xié)同索拉非尼拮抗肝癌細(xì)胞增殖。

與模型組比較,**P<0.01;與索拉非尼組比較,##P<0.01

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為肝癌屬于“積聚”“癌毒”等范疇,全國優(yōu)秀中醫(yī)臨床人才、四川省名中醫(yī)汪靜教授基于中醫(yī)學(xué)“兩本三樞”理論和全國名老中醫(yī)孫同郊教授“和調(diào)”學(xué)術(shù)思想,認(rèn)為發(fā)病于脾、腎和少陽、少陰兩樞以及脾胃中樞功能失調(diào)密切相關(guān)?！白趟尽薄耙姼沃?知肝傳脾,當(dāng)先實(shí)脾”,當(dāng)補(bǔ)脾腎,顧護(hù)先后天之本。少陽為陰陽之道路、表里之樞機(jī);少陰為人身性命之樞機(jī),能量儲存之地。脾胃處中焦,脾主升清而胃主降濁,脾升則下焦肝腎二臟之氣升,胃降則上焦心肺之氣降,脾升胃降斡旋一身之氣機(jī),為氣機(jī)升降之樞,故“樞機(jī)利則百氣轉(zhuǎn)”。是以基于仲景“小柴胡湯”、張錫純“新擬和肝丸”和《內(nèi)經(jīng)》“四烏賊骨一蘆茹丸”融合創(chuàng)新,創(chuàng)制和樞消積丸。方中柴胡、黃芩,行小柴胡之意,調(diào)和少陽樞機(jī),共為君藥;雞內(nèi)金、麥芽兩藥配伍使肝氣升發(fā),胃氣通降,脾氣健運(yùn),共為臣藥;黃芪、白術(shù)顧護(hù)后天之本,肉桂固先天之本,抑肝木橫恣,茜草活血化瘀,海螵蛸疏通血脈,鱉甲軟堅散結(jié),連翹清熱散結(jié),白芍潤以柔肝護(hù)肝,共為佐藥;甘草以緩肝兼調(diào)和諸藥,冰片、薄荷腦芳香通肝絡(luò),共為使藥。諸藥配伍,使氣機(jī)調(diào)暢,肝胃調(diào)和,脾氣得健,濕熱清利,癥積自消。前期臨床觀察研究發(fā)現(xiàn)該方能夠延長肝癌患者總生存期,臨床療效明確。

為研究和樞消積丸對肝癌的抑制作用及機(jī)制,我們構(gòu)建了H22皮下異位種移植小鼠模型,發(fā)現(xiàn)各治療組小鼠的腫瘤體積、腫瘤抑制率均顯著低于模型組,聯(lián)合組小鼠的抑瘤作用明顯高于單用和樞消積丸或索拉非尼。實(shí)驗(yàn)觀察到和樞消積丸可以破環(huán)腫瘤組織內(nèi)部結(jié)構(gòu),協(xié)助索拉非尼減緩肝癌細(xì)胞的發(fā)展進(jìn)程。不同劑量的和樞消積丸均能不同程度下調(diào)H22荷瘤小鼠AST、ALT水平,而索拉非尼組小鼠的AST、ALT水平與模型組相近,提示和樞消積丸改善肝臟功能、減緩肝損傷的作用優(yōu)于索拉非尼。VEGF可與血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體結(jié)合,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,同時提高微血管的通透性,為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì);PDGF可促進(jìn)細(xì)胞生化和增殖,能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[3],因此,抑制肝癌血管生成相關(guān)因子是治療肝癌的重要途徑。本文通過免疫組化和Western blotting實(shí)驗(yàn),證實(shí)和樞消積丸能夠抑制VEGF和PDGF表達(dá)水平,聯(lián)合索拉非尼使用時效果更優(yōu)。

綜上所述,和樞消積丸具有抑制H22異位移植瘤生長和提高索拉非尼抗肝癌療效的作用,機(jī)制可能與抑制血管新生相關(guān)VEGF和PDGF相關(guān)。本研究也存在局限性,H22荷瘤小鼠樣本量有限,在今后的研究中還需利用體外模型、人體組織樣本進(jìn)一步闡明作用機(jī)制。