◎ 李海燕

（怒江州食品藥品檢驗(yàn)所，云南 怒江 673199）

酸木瓜[Pseudocydonia sinensis(Thouin) C.K.Schneid.]別名鄒皮木瓜、木瓜海棠、木瓜等，是薔薇科木瓜屬灌木或小喬木[1]。酸木瓜中含較多果酸和單寧，吃起來酸、澀，解膩開胃，舒筋濕痹，在云南人的生活和菜品中多為常見?！对娊?jīng)》記載：“投我以木瓜，報(bào)之以瓊琚?！惫湃藢⑺崮竟弦暈楹汀碍傝ⅰ币话忝篮玫氖挛?。古籍中對(duì)酸木瓜的記載還有很多，關(guān)于木瓜泡酒早有記載?！洱R民要術(shù)》記載，木瓜以苦酒鼓汁，密度之，可按酒食，密封藏百日，乃食之，甚益人。酸木瓜中的主要化學(xué)成分有熊果酸、齊墩果酸、蘋果酸、綠原酸、蘆丁、多糖、黃酮、鞣質(zhì)等[2]。其中，熊果酸和齊墩果酸為五環(huán)三萜有機(jī)酸。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，齊墩果酸可消炎抑菌，降低轉(zhuǎn)氨酶，促進(jìn)肝細(xì)胞再生，防止肝硬化，強(qiáng)心、利尿、降血脂、降血糖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[3]。熊果酸是齊墩果酸的同分異構(gòu)體，藥理研究證明，熊果酸具有抗癌、促進(jìn)免疫、穩(wěn)定心血管、增強(qiáng)毛細(xì)血管彈性等作用。由于木瓜具有藥用、食用、觀賞等多種用途，越來越受人們的喜愛?；诖?，本文采用有機(jī)溶劑超聲提取，離心，旋轉(zhuǎn)濃縮，C18 柱凈化，正己烷洗脫，氮吹，旨在探索酸木瓜中熊果酸和齊墩果酸的提取工藝。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這種方法快速，且樣品損失較小，克服了傳統(tǒng)方法的不足，具有高效、簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，可以為木瓜的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑、材料

①儀器。島津液相色譜儀LC-30A，與三重四極桿質(zhì)譜儀LCMS-8050 聯(lián)用系統(tǒng)；GH252 雙量程電子天平；超聲提取儀；艾本德離心機(jī)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；氮吹儀。②試劑。甲醇、正己烷、乙醇，均為色譜純；C18 固相萃取柱。③材料。熊果酸、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定院）。

1.2 分析條件

液相色譜條件：XRODS-Ⅲ（2.0 mmI.D×75 mm，1.6 μm）；流動(dòng)相：A－甲醇，B－純水；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；質(zhì)譜條件：掃離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），負(fù)離子掃描模式。

用1 μg·mL-1熊果酸和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜掃描，并做電壓優(yōu)化，確定熊果酸和齊墩果酸的母離子為455.3，子離子為455.45，錐孔電壓熊果酸為25 V，齊墩果酸為28 V，碰撞電壓均為24 V。

1.3 樣品前處理

1.3.1 熊果酸和齊墩果酸2 種不同前處理方法比較

（1）方法1。取5 批次怒江州瀘水市老窩鄉(xiāng)不同產(chǎn)地的酸木瓜鮮果，去核、粉碎，精密稱定5.0 g，于50 mL 具塞離心管中，加入50 mL 乙醇，70 ℃超聲提取30 min，8 000 r 離心，取上清液過0.22 μm 針筒過濾頭，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析[4]。

（2）方法2。取5 批次怒江州瀘水市老窩鄉(xiāng)不同產(chǎn)地的酸木瓜鮮果，去核、粉碎，精密稱定5.0 g，于50 mL 具塞離心管中，加入50 mL 乙醇，振蕩提取20 min，8 000 r 離心，將離心液轉(zhuǎn)入100 mL 雞心瓶，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)到5 mL，過C18 固相柱（5 mL 甲醇，5 mL水活化固相柱），用5%乙醇水沖洗小柱2 次，再用6 mL 正己烷洗脫，收集洗脫液，50 ℃氮吹干，準(zhǔn)確加入1 mL 初始流動(dòng)相溶解，過0.22 μm 針筒過濾頭，濾液供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

精密稱定熊果酸和齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg 用甲醇定容至10 mL，配成1.0 mg·mL-1的母液，再用初始流動(dòng)相稀釋配成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM 色譜圖

0.02 ng·mL-1混合標(biāo)液的MRM 色譜圖，如圖1所示。

圖1 0.02 ng·mL-1 混合標(biāo)液的MRM 色譜圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系與檢出限、定量限

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液按1.2 中的分析條件進(jìn)行測(cè)定，在1.2 色譜條件下依次進(jìn)樣測(cè)定，以待測(cè)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程和相關(guān)系數(shù)。該方法熊果酸的線性方程為Fx=3.952 9e+007*x+104 321，相關(guān)系數(shù)為0.999 938 6；齊墩果酸的線性方程為Fx=3.797 90e+007*x+386 09.2，相關(guān)系數(shù)為0.999 177 1。熊果酸和齊墩果酸線性范圍均為0.001～0.2 μg·mL-1，峰面積在該線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。用初始流動(dòng)相逐級(jí)稀釋對(duì)照品混合液，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣，以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的溶液濃度為方法檢出限，該法的熊果酸和齊墩果酸的檢出限均為0.000 2 mg·kg-1。

2.3 2 種提取方法對(duì)結(jié)果的影響

實(shí)驗(yàn)表明，以5 號(hào)樣品為例，方法1 用乙醇超聲提取后直接上機(jī)測(cè)定，得到的色譜峰比較雜亂，基線不平穩(wěn)，待測(cè)物含量偏低。方法2 用乙醇振蕩提取后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，過C18 固相柱，正己烷洗脫、氮吹后，上機(jī)測(cè)定的結(jié)果待測(cè)物含量偏高，雜峰干擾少，基線平穩(wěn)，因?yàn)闈饪s、過柱能去除大分子物質(zhì)和一些雜質(zhì)，降低離子抑制程度，提高分析的靈敏度[5]。2 種提取方法所得色譜圖，分別如圖2、3 所示。

圖2 方法1 所得的色譜圖

圖3 方法2 所得的色譜圖

2.4 精密度試驗(yàn)

將5 號(hào)酸木瓜樣品按1.2 中分析條件進(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣6 次。熊果酸（n=6）的保留時(shí)間（RSD%）為3.619%，色譜峰面積分別為2 942 307、2 986 988、2 792 078、2 814 979、2 799 595、2 766 655，平均峰面積為2 851 285，峰面積（n=6）的（RSD%）為2.913，齊墩果酸（n=6）的保留時(shí)間（RSD%）為3.313%，色譜峰面積分別為2 663 911、2 591 525、2 539 461、2 572 418、2 536 866、2 506 049，平均峰面積為2 569 431，峰面積（n=6）的（RSD%）為1.974。由此可知，該方法儀器精度良好，滿足檢測(cè)要求。

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取5 個(gè)木瓜樣品，加入適量的熊果酸和齊墩果酸對(duì)照品，按1.3 樣品前處理方法進(jìn)行樣品前處理，按1.2中分析條件進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，熊果酸和齊墩果酸加標(biāo)回收率結(jié)果如表1 所示。

表1 熊果酸和齊墩果酸加樣回收試驗(yàn)表

3 結(jié)論

本文初步研究了云南省怒江州瀘水市老窩鄉(xiāng)的酸木瓜中熊果酸和齊墩果酸含量，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定其含量，從提取工藝中得知，樣品經(jīng)提取、濃縮，通過C18 固相柱后，可以有效減少雜質(zhì)干擾。結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可靠，可以為酸木瓜的開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。