◎ 左 丹

（湖南省分析測試中心有限公司，湖南 長沙 410000）

1 實驗部分

1.1 實驗材料與設(shè)備

1.1.1 實驗材料

牛肉：經(jīng)檢驗β-受體激動劑呈現(xiàn)陰性的牛肉，絞碎均質(zhì)。

1.1.2 主要試劑

甲醇、乙腈、甲酸、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、高氯酸、氨水、氫氧化鈉溶液、乙酸銨緩沖液、甲酸水溶液-甲醇溶液（體積比=90 ∶10）、β-葡萄糖醛酸酶（30 U·mL-1）。

對照品：萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇（含量均≥98%）。同位素內(nèi)標(biāo)：萊克多巴胺-d3、克倫特羅-d9、沙丁胺醇-d3。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

TSQ Quantis 型號高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配電噴霧離子源（ESI）；分析天平；氮吹儀；水平振蕩器；固相萃取裝置等[1]。

1.2 混合對照品溶液及內(nèi)標(biāo)液的制備

準(zhǔn)確稱取萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇各10 mg,放置于100 mL 的棕色量瓶內(nèi)，用甲醇定容，將其制備為0.1 mg·mL-1的混合對照品溶液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?，臨用時可用甲醇稀釋為所需濃度混合液。稱取3 種同位素內(nèi)標(biāo)10 mg，同樣的方法配置為100 μg·mL-1的儲備液保存，用時可用甲酸水溶液稀釋為100 μg·L-1的混合液，獲得內(nèi)標(biāo)工作液[2]。

1.3 樣品前處理

1.3.1 酶解和提取

稱取新鮮或者冷藏解凍的試料2 g 置于50 mL 離心管內(nèi)，加入0.2 mol·L-1的乙酸銨緩沖液6 mL、β-葡萄糖醛酸酶40 μl，渦旋均勻，于避光條件下37 ℃水浴振蕩16 h，放至室溫備用。

1.3.2 萃取、凈化、濃縮

取上步驟獲得備用液，加入100 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)液100 μL,渦旋均勻并在8 000 r·min-1的條件下離心8 min，取上清液，加入5 mL 高氯酸溶液（0.1 mol·L-1）,渦旋均勻，用高氯酸調(diào)節(jié)pH 至1，在8 000 r·min-1的條件下離心8 min，在獲得的上清液中加入NaOH 溶液（10 mol·L-1）,調(diào)節(jié)pH 至10。加入乙酸乙酯15 mL，中速振蕩5 min，在5 000 r·min-1的條件下離心5 min，獲取上層有機(jī)相。對于上層水相，可加入叔丁基甲醚10 mL 進(jìn)行提取，將前后2 次提取的有機(jī)相進(jìn)行合并，50 ℃氮吹，并用甲酸溶液（2%）溶解備用[3]。

應(yīng)用混合型陽離子交換固相萃取柱進(jìn)行凈化，分別用3 mL 甲醇及3%甲酸活化萃取柱后，備用液過柱后用2%甲酸與甲醇各3 mL 淋洗、抽干，用5%的氨化甲醇溶液3 mL 洗脫后50 ℃氮吹。

用0.5 mL 甲醇-1%甲酸溶液溶解殘余物后過濾膜（0.22 μm 孔徑），獲得供試品溶液。

1.4 儀器條件

色譜柱：Waters C18 (Xbridge BEH 2.5 μm)；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.2 mL·min-1；流動相：溶劑A+溶劑B。梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相及梯度洗脫程序表

離子源：電噴霧（ESI+）；掃描方式：選擇反應(yīng)檢測掃描（SRM）；離子噴霧電壓：3 500 V；離子傳輸管溫度：320 ℃；蒸汽溫度：350 ℃；鞘氣流速：40 Arb；輔助氣流速：5 Arb。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解溫度的優(yōu)化

通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)得知，β-葡萄糖醛酸酶適用的溫度處于40～110 ℃，于試料牛肉離心管內(nèi)，加入0.2 mol·L-1的乙酸銨緩沖液6 mL、β-葡萄糖醛酸酶40 μL,渦旋均勻后分別于避光條件下37、45、53、61、69 ℃水浴振蕩16 h，再經(jīng)萃取、凈化、濃縮后對3 種β-受體激動劑含量進(jìn)行檢測，結(jié)果見表2。

表2 不同酶解溫度對β-受體激動劑測定結(jié)果的影響表

表2 顯示,當(dāng)酶解溫度在37～45 ℃范圍內(nèi)時，3 種β-受體激動劑的測定結(jié)果差距不明顯,均與推薦值最接近，隨著溫度的繼續(xù)升高，在達(dá)到53 ℃后，測定值會有所降低，這可能因為溫度過高會導(dǎo)致物質(zhì)揮發(fā)丟失。所以，最合適的酶解溫度為37 ℃[4-5]。

2.2 酶解時間的優(yōu)化

設(shè)置樣品酶解與提取前處理的酶解時間為37 ℃下水浴振蕩8、12、16、20、24 h，再經(jīng)萃取、凈化、濃縮后對3 種β-受體激動劑含量檢測，結(jié)果見表3。

表3 不同酶解時間對β-受體激動劑測定結(jié)果的影響表

表3 顯示，酶解時間為8、12、16 h 時，β-受體激動劑含量測定值差距相對較小，均接近推薦值5 μg·kg-1，適合酶解時間為8 h。

2.3 凈化條件的優(yōu)化

應(yīng)用SPE 技術(shù)凈化，分別創(chuàng)建4 種淋洗液與洗脫程序，研究加標(biāo)回收率，選擇最佳凈化條件，具體見表4。

表4 不同凈化條件的β-激動劑回收率表

表4 顯示，方法1 與方法2 下3 種β-激動劑的平均回收率差異性不大，分別為98.5%、98.4%。因此，該實驗凈化條件可以選擇方法1 或者方法2。

2.4 方法回收率分析

各稱取牛肉樣品2 g，按照上述最佳前處理條件，分別添加不同梯度的3 種β-受體激動劑標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0、5、5、10 ng，并定容至1 mL，計算其分析結(jié)果及回收率見表5。

表5 3 種β-受體激動劑加標(biāo)回收實驗結(jié)果表

由表5 可知，β-受體激動劑化合物的加標(biāo)回收率處于84.6%～97.2%，代表該檢測方法具備較高的準(zhǔn)確度，可以滿足檢測要求。

3 結(jié)語

本實驗采用酶解與固相萃取的前處理技術(shù)和液質(zhì)聯(lián)用對牛肉中的3 種β-受體激動劑進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)最佳的酶解溫度為37 ℃，酶解時間為8 h，凈化條件如下?；罨? mL 甲醇；3 mL 甲酸(3%)。淋洗：3 mL甲酸（2%）或者3 mL 高氯酸（0.1 mol·L-1）；3 mL甲醇。洗脫：3 mL 氨化甲醇溶液（5%）或者用代替淋洗中的甲酸，該方法具備較高的加標(biāo)回收率，可檢測牛肉中的“瘦肉精”藥劑殘留。