◎ 張良明，田 斌，蘇亞慶

（西安天一生物技術(shù)股份有限公司，陜西 西安 710000）

南瓜籽是成熟南瓜的種子，其成分具有抗糖尿病、抗癌、改善前列腺增生的效果。研究表明，南瓜籽蛋白肽具有很好的抗氧化活性[1-3]。南瓜籽蛋白是南瓜籽榨油后的副產(chǎn)物——南瓜籽餅粕，其含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、多種維生素、微量元素，營(yíng)養(yǎng)豐富。以南瓜籽餅粕為原料，利用酶法，可以將蛋白質(zhì)降解為小分子多肽。在蛋白質(zhì)的水解中，需要采用專門的蛋白酶分解蛋白質(zhì)，以水解蛋白質(zhì)分子的肽鏈，生成多肽和氨基酸，使其成為具有良好溶解性、乳化性和生物活性的小分子肽，從而改善蛋白質(zhì)的功能特性，將其更廣泛地應(yīng)用于普通食品和功能性食品中。通過(guò)有效控制蛋白質(zhì)的水解程度，可以改善其乳化性能，更有利于氨基酸的吸收[4]。

基于此，本文通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)選了南瓜籽蛋白肽的傳統(tǒng)制備工藝。同時(shí)，通過(guò)膜分離技術(shù)對(duì)南瓜籽蛋白肽進(jìn)行提純，旨在促進(jìn)南瓜籽蛋白肽更好地實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與試劑

1.1 原材料與試劑

1.1.1 原材料

南瓜籽餅粕粉是西安天一生物技術(shù)股份有限公司自產(chǎn)的南瓜籽蛋白產(chǎn)品。以南瓜籽為原料，通過(guò)低溫壓榨，可得到南瓜籽油和南瓜籽蛋白餅粕；通過(guò)沖擊磨超微粉碎南瓜籽餅粕，可得到南瓜籽蛋白超微粉產(chǎn)品。

1.1.2 試劑

鹽酸、氫氧化鈉三氯乙酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液、混合指示液、混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、檸檬酸緩沖溶液、pH 5.2的乙酸鋰溶液、茚三酮溶液等；堿性蛋白酶（東恒華道生物科技有限公司）；風(fēng)味蛋白酶（山東隆科特生物）；堿性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶[諾維信（中國(guó)）生物技術(shù)有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

雷磁PHS-3C pH 計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、升降水油浴鍋RE-501（西安予輝儀器有限公司）、低速大容量離心機(jī)TDL-5-A（上海安亭科學(xué)儀器廠）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-5210A 和RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）、SHZ-95B 型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器設(shè)備有限公司）、DZF-6050 真空干燥箱（上?，樮帉?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、電熱鼓風(fēng)干燥箱101-AB（天津市泰斯特儀器設(shè)備有限公司）、小型噴霧干燥機(jī)MAI-GZJ（上海那艾精密儀器有限公司）、K9840 自動(dòng)凱氏定氮儀（山東海能儀器有限公司）、電子天平SQP[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]。

2 檢測(cè)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)方法

2.1 檢測(cè)依據(jù)

按照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品蛋白質(zhì)的測(cè)定》第一法：采用凱氏定氮法進(jìn)行干燥后，測(cè)定南瓜籽蛋白肽粉粗蛋白；采用GB/T 22492—2008附錄B，測(cè)定南瓜籽蛋白肽粉肽含量。

2.2 南瓜籽多肽的制備工藝

南瓜籽蛋白超微粉→溶解預(yù)熱→調(diào)節(jié)pH →調(diào)節(jié)溫度→加酶水解→滅酶→離心→噴霧干燥或真空干燥→南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品。

取100 g 南瓜籽蛋白粉，以一定比例加純化水于四口瓶中配制南瓜籽蛋白溶液，持續(xù)攪拌，并進(jìn)行預(yù)熱處理30 min。將經(jīng)過(guò)預(yù)熱處理后的南瓜籽蛋白溶液調(diào)節(jié)pH 至反應(yīng)所需的條件，以底物蛋白量添加不同的蛋白酶，攪拌，恒溫水浴酶解，酶解結(jié)束后，升溫至85 ℃滅酶30 min，冷卻后放置4 ℃冰箱靜置12 h，離心，將上清液進(jìn)行減壓濃縮，噴霧干燥或真空干燥，得到南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品[5-10]。

2.2.1 多肽得率

多肽得率=（干燥產(chǎn)品中粗蛋白質(zhì)含量/原料中粗蛋白質(zhì)含量）×100%

2.2.2 蛋白酶的篩選

選用不同廠家不同型號(hào)的蛋白酶，分別對(duì)南瓜籽蛋白進(jìn)行水解（蛋白酶添加量為1.2%），在每種酶的最適條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別測(cè)定南瓜籽蛋白的水解度、多肽得率，平均實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值，篩選出適合南瓜籽蛋白肽的蛋白酶種類。根據(jù)酶的說(shuō)明書，與蛋白酶廠家技術(shù)人員溝通，確定不同蛋白酶的作用條件如表1 所示。

表1 不同蛋白酶的作用條件表

2.2.3 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合生產(chǎn)成本考慮，選取加酶量、pH、加水倍量、酶解時(shí)間為考察因素，以南瓜籽蛋白肽得率為指標(biāo)，優(yōu)選南瓜籽蛋白肽酶解最佳工藝條件，并對(duì)優(yōu)選出的最佳條件平行進(jìn)行3 次實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 膜分離技術(shù)進(jìn)行除雜，提純南瓜籽蛋白肽的含量采用優(yōu)選的南瓜籽蛋白肽酶解條件制備蛋白肽水解液，水解液經(jīng)離心機(jī)5 000 r·min-1離心，獲得小分子蛋白肽料液。將上述料液經(jīng)陶瓷膜系統(tǒng)進(jìn)行微濾，除掉懸浮物、菌體、大分子蛋白質(zhì)，濾液澄清，將上述澄清濾液通過(guò)有機(jī)超濾膜系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)純化，除掉大分子蛋白、色素等雜質(zhì)，提高產(chǎn)品純度。接著，通過(guò)納濾膜系統(tǒng)進(jìn)行納濾，脫除料液中的一價(jià)鹽，對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行濃縮，并將上述截留液經(jīng)噴霧干燥，設(shè)置進(jìn)料溫度160～190 ℃，塔內(nèi)溫度85～95 ℃，水分控制≤6.0%，得到南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品，測(cè)定粗蛋白含量和蛋白肽含量[11-12]。

3 結(jié)果與分析

3.1 南瓜籽蛋白正交實(shí)驗(yàn)

設(shè)定溫度55 ℃，酶解8 h，選取加酶量（A）、溶液pH（B）、加水倍量（C）3 個(gè)因素3 個(gè)水平進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以蛋白肽得率為指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見下表2、直觀分析表見表3、效應(yīng)曲線圖見圖1。

圖1 效應(yīng)曲線圖

表2 南瓜籽蛋白肽正交實(shí)驗(yàn)表

表3 正交實(shí)驗(yàn)直觀分析表

通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，加酶量是影響水解的關(guān)鍵因素，優(yōu)選的蛋白肽水解條件為加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，55 ℃水解8 h，之后進(jìn)行滅酶，冷卻后離心處理，清液干燥得南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品。

3.2 不同廠家蛋白酶篩選

采用不同廠家的蛋白酶，酶添加量1.2%，pH=9，加水（純化水）倍量12 倍，采用四口瓶水浴55 ℃攪拌水解8 h，對(duì)等量的南瓜籽蛋白進(jìn)行酶解，不同廠家的蛋白酶得率見表4。

表4 不同廠家的蛋白酶選擇表

以南瓜籽蛋白肽得率為指標(biāo)，可以看出B 廠家的* 專用蛋白酶和C 廠家的堿性蛋白酶得率偏高，E 廠家的復(fù)合蛋白酶得率最高。為了使南瓜籽多肽具有更好的得率和更好的生物活性，選擇B 廠家的* 專用蛋白酶和C 廠家的5# 堿性蛋白酶同A 廠家的風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配比例2 ∶1[13-15]。以優(yōu)選的實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，同E 廠家的復(fù)合蛋白酶開展蛋白肽得率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，多肽含量計(jì)算平均值，樣品粗蛋白含量和蛋白肽得率見表5。

表5 蛋白肽得率驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表

3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

由表5 可以看出，通過(guò)堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的復(fù)配，可以提高蛋白肽的得率，復(fù)配比例為2 ∶1，多肽得率為86.52%和86.18%，粗蛋白質(zhì)含量均＞80%，多肽含量＞55%。

3.4 膜分離提純除雜實(shí)驗(yàn)

根據(jù)上述優(yōu)選的條件，通過(guò)復(fù)配的蛋白酶制備南瓜籽蛋白肽離心液，采用膜分離技術(shù)進(jìn)行除雜，提純南瓜籽蛋白肽的含量，表6 為進(jìn)料液pH、溫度及固形物濃度參數(shù)。

表6 進(jìn)料液pH、溫度及固形物濃度參數(shù)表

采用陶瓷-MF 進(jìn)行膜過(guò)濾，運(yùn)行時(shí)間：185 min；溫度：43～46 ℃；壓力：0.25～0.3 MPa，平均通量：61.5 L·min-1，45 Hz 的情況下通量隨時(shí)間變化曲線，見圖2。

圖2 陶瓷膜膜過(guò)濾通量隨時(shí)間變化曲線圖

采用卷式超濾膜-1#UF 進(jìn)行膜過(guò)濾，運(yùn)行時(shí)間：135 min；溫度：33～36 ℃；壓力：0.65～0.85 MPa，過(guò)濾倍量：15 倍；平均通量：48 L·min-1，通量隨時(shí)間變化曲線見圖3。

圖3 卷式超濾膜膜過(guò)濾隨時(shí)間通量變化曲線圖

通過(guò)上述陶瓷膜過(guò)濾、卷式陶瓷膜除雜、卷式納濾膜濃縮后，蛋白肽固含量達(dá)17.8%，經(jīng)噴霧干燥后檢測(cè)產(chǎn)品粗蛋白含量為92.7%，多肽含量為81.8%，工藝重復(fù)2次，設(shè)備運(yùn)行良好，蛋白肽含量均＞80%（以干基計(jì)），粗蛋白含量＞90%（以干基計(jì)），陶瓷膜過(guò)濾后，經(jīng)純化水頂洗收率達(dá)95%，卷式超濾膜收率93%以上。

4 結(jié)論及建議

本研究以低溫壓榨得到的南瓜籽餅粕，采用沖擊磨粉碎后的南瓜籽蛋白超微粉，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得出南瓜籽蛋白制備南瓜籽蛋白肽的最佳制備工藝：加酶量1.2%，pH=9，倍量16 倍，溫度為55 ℃，酶解8 h，該條件下，多肽得率＞85%，粗蛋白質(zhì)含量≥80%，多肽含量≥55%。同時(shí)，本研究進(jìn)行膜分離除雜提純實(shí)驗(yàn)，得到最終產(chǎn)品粗蛋白含量≥90%（以干基計(jì)），多肽含量≥80%（以干基計(jì)）。結(jié)果表明，該制備工藝穩(wěn)定、可行，可以獲得一種簡(jiǎn)便易行、綠色環(huán)保、成本可控、溶解性好的高含量南瓜籽蛋白肽產(chǎn)品。因此，本研究結(jié)果可以為南瓜籽蛋白肽膜過(guò)濾濃縮除雜純化方式提供數(shù)據(jù)支持。