黃華林 覃仙玲 農(nóng)志文 賴俊翔 蘇芯瑩 賴海清 黃丹蕾 李菲

摘要：目的 選取3種海洋赤潮甲藻為研究對(duì)象，從廣西潿洲島海域來(lái)源細(xì)菌中篩選出高效溶藻的菌株，研究菌株的溶藻效果和初步作用機(jī)制，為開(kāi)展赤潮的防治工作奠定基礎(chǔ)。方法 采用細(xì)菌發(fā)酵液與甲藻共培養(yǎng)來(lái)測(cè)定菌株的溶藻活性，檢測(cè)藻細(xì)胞中丙二醛和抗氧化相關(guān)酶系統(tǒng)的響應(yīng)規(guī)律，分析甲藻胞外溶解性有機(jī)物組成，并通過(guò)KEGG和CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)目標(biāo)菌株合成溶藻物質(zhì)的能力。結(jié)果 從24株細(xì)菌中篩選到15株對(duì)至少一種甲藻表現(xiàn)出溶藻活性的菌株，總陽(yáng)性率為62.5%，菌株M026對(duì)3種甲藻均表現(xiàn)出顯著的溶藻效果。添加10%的M026發(fā)酵無(wú)菌濾液，共培養(yǎng)3 d后，3種甲藻細(xì)胞死亡率均高達(dá)95.0%。生理生化響應(yīng)表明，在M026發(fā)酵無(wú)菌濾液脅迫下，甲藻細(xì)胞膜脂過(guò)氧化損傷嚴(yán)重，3種抗氧化相關(guān)酶（SOD、CAT和APX）活性先增加后下降，且三維熒光光譜檢測(cè)到藻細(xì)胞內(nèi)溶產(chǎn)物為類富里酸和類蛋白類物質(zhì)。通過(guò)全基因組分析，菌株M026含有溶藻活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成基因，及多種降解植物細(xì)胞壁的酶。結(jié)論 菌株M026可作為微生物溶藻菌劑的候選菌株。

關(guān)鍵詞：潿洲島；可培養(yǎng)細(xì)菌；甲藻；溶藻活性

中圖分類號(hào)： Q939.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Study on the algicidal activity of culturable bacteria isolated

from seawater in Weizhou Island

Abstract Objective To screen highly effective algicidal bacterial strains from the seawater in Weizhou Island， Guangxi Zhuang Autonomous Region， China. Three marine dinoflagellates were selected as the research object to study the algicidal efficiency and mechanism of those strains for the prevention and control of red tide. Methods The bacterial fermentation broth and dinoflagellate were co-cultured to determine the algicidal effect of the strains， determine the response rules of malondialdehyde （MDA） and antioxidant related enzyme systems in algae cells， analyze the composition of extracellular soluble organic matter （EDOM） in dinoflagellate， and predict the ability of the target strain to synthesize algicidal substances through KEGG and CAZy databases. Results Total 15 strains that showed algicidal activity against at least one species of dinoflagellate were screened out from 24 strains of bacteria. The total positive rate was 62.5%. Among them， strain M026 showed significant algicidal activity against three dinoflagellates. After inoculating 10% of M026 fermentation sterile filtrate and co-culturing for 3 days， the cell death rate of the three dinoflagellates reached 95.0%. The physiological and biochemical responses indicated that algae suffered serious lipid peroxidation， three related enzymes （SOD， CAT and APX） activities increased first and decreased subsequently under the oxidative stress of M026 sterile filtrate. Three-dimensional fluorescence spectroscopy results showed that the algae lysates were fulvic acid-like and protein-like substances. According to the analysis of draft genome， strain M026 contains potential secondary metabolite biosynthetic gene with algicidal activity， as well as a variety of plant cell wall degrading enzymes. Conclusion Due to the high algicidal efficiency and mechanism of strain M026， it can be used as a candidate strain to develop microbial algicidal agents.

Key words Weizhou island; Culturable bacteria; Dinoflagellate; Algicidal activity

赤潮（red tide）是海洋生態(tài)系統(tǒng)中藻類生物條件性暴發(fā)增殖或高密度聚集而引發(fā)水體變色的一種異常現(xiàn)象[1]。赤潮不僅嚴(yán)重破壞海洋生態(tài)平衡，影響漁業(yè)和旅游業(yè)發(fā)展，給人類帶來(lái)直接經(jīng)濟(jì)損失；還常常伴隨藻毒素和溶解氧耗盡等問(wèn)題，威脅著魚類、海洋哺乳動(dòng)物、貝類和其他海洋生物的生長(zhǎng)，且攝食藻毒素積累的海鮮也會(huì)導(dǎo)致人類和動(dòng)物的疾病和死亡[2-3]。目前，赤潮防治的方法主要有化學(xué)、物理和生物法，其中物理和化學(xué)法對(duì)有害藻類具有很強(qiáng)的殺滅作用，但因其成本高、大規(guī)模應(yīng)用難、二次污染引入及非目標(biāo)生物毒性等缺點(diǎn)，很大程度上限制了這些方法的應(yīng)用[4]。生物法則是利用生物間互作關(guān)系來(lái)控制或除去赤潮生物，該法具有溶藻潛力高和生態(tài)友好等優(yōu)點(diǎn)，是近年來(lái)有害藻華治理最具前景的手段[5]。在過(guò)去的幾十年里，研究人員從藻華水體、污泥、土壤、植物等介質(zhì)中分離和鑒定出眾多的溶藻細(xì)菌，其中擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）占50%，γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）占45%和放線菌門（Actinobacteria）占5% [6]。

甲藻（dinoflagellate）是一類能自由運(yùn)動(dòng)的單細(xì)胞真核生物，多分布于海洋環(huán)境，是海洋浮游生物群落的重要組成部分[7]，也是形成有害藻華的原因種之一[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球范圍內(nèi)存在約300種浮游植物可產(chǎn)生藻華，其中甲藻約184種，占比55%（有毒甲藻類約94種）[9-10]。這些甲藻赤潮分布廣泛，在我國(guó)邊緣海近岸環(huán)境中時(shí)常暴發(fā)，嚴(yán)重威脅我國(guó)沿海生態(tài)環(huán)境和經(jīng)濟(jì)。綜上，本論文擬采用室內(nèi)藻類培養(yǎng)觀察、生理生化試驗(yàn)及生物學(xué)手段探索廣西潿洲島海域來(lái)源細(xì)菌對(duì)3種甲藻的溶藻活性和潛在機(jī)制，為探索更高效廣譜的微生物溶藻劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試藻種

東海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）、微小原甲藻（Prorocentrum minimum）和米氏凱倫藻（Karenia mikimotoi）均保藏于廣西海洋科學(xué)院藻種庫(kù)，藻種培養(yǎng)采用f/2培養(yǎng)基[11]，培養(yǎng)條件：溫度（20±1） ℃，光照強(qiáng)度為2000 lx，光暗周期12 h：12 h。

1.2 供試菌株

選擇供試細(xì)菌24株（表1），來(lái)源于廣西潿洲島海域（21°1'2''N，109°2'29''E）的表層海水樣品，該采樣區(qū)域爆發(fā)夜光藻；經(jīng)2216E固體培養(yǎng)基分離純化，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rRNA測(cè)序分析，并通過(guò)EzBioCloud數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ezbiocloud.net/）[12]在線比對(duì)，現(xiàn)保藏于廣西科學(xué)院北部灣海洋微生物種質(zhì)資源庫(kù)中。

1.3 溶藻細(xì)菌的初篩

將24株細(xì)菌分別接種至1/10的2216E液體培養(yǎng)基（MA，海博生物；3.7 g/L 2216E液體培養(yǎng)基，1000 mL

蒸餾水，121 °C高壓滅菌20 min），180 r/min搖床，

28 °C培養(yǎng)5 d。發(fā)酵菌液經(jīng)8000 r/min離心10 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm的PES膜濾（BKMAM）以收集無(wú)菌濾液，于4 °C下儲(chǔ)存?zhèn)溆?。?0 mL無(wú)菌濾液加入90 mL生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的藻液中，初始藻細(xì)胞密度為

104 cells/mL。以2216E液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，按藻種培養(yǎng)條件培養(yǎng)24，48和72 h后，取1 mL藻液用魯哥氏碘液固定，通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察藻細(xì)胞形態(tài)變化，并對(duì)其進(jìn)行拍照。再用血球計(jì)數(shù)板對(duì)藻細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，每個(gè)處理設(shè)3組平行，以此抑制率（AR， %）評(píng)估溶藻效果。計(jì)算公式如下：

AR= （Ct-Tt）/Ct×100%

式中Ct和Tt分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中甲藻細(xì)胞數(shù)量（cells/mL）。

1.4 目標(biāo)菌株M026的溶藻特性

1.4.1 M026不同生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻活性影響

將生長(zhǎng)初期（培養(yǎng)1 d），對(duì)數(shù)期（培養(yǎng)3 d），穩(wěn)定期（培養(yǎng)5 d），衰亡期（培養(yǎng)7 d）的M026菌液以10%含量分別添加至對(duì)數(shù)期3種甲藻培養(yǎng)物中，以加入等體積2216E液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組。按藻種培養(yǎng)條件培養(yǎng)24，48和72 h取樣觀察和計(jì)數(shù)。

1.4.2 M026菌液不同投加量對(duì)溶藻活性影響

將穩(wěn)定期的M026發(fā)酵菌液，以1%，2.5%，5%和10%（V/V）含量分別添加至3種對(duì)數(shù)期甲藻培養(yǎng)物中，以加入等體積2216E液體培養(yǎng)基作為對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)3組平行。按藻種培養(yǎng)條件培養(yǎng)24，48和

72 h后取樣觀察和計(jì)數(shù)。

1.4.3 葉綠素a含量測(cè)定

采用丙酮比色法[13]測(cè)定“1.4.1”和“1.4.2”中共培養(yǎng)24，48和72 h后的藻液中葉綠素a（Chl-a）含量。將共培養(yǎng)的藻液過(guò)濾收集藻細(xì)胞，置于5 mL

90%丙酮浸泡24 h，4000 r/min離心10 min后收集上清液，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定，波長(zhǎng)設(shè)定為664、647、630和750 nm。Chl-a含量計(jì)算公式如下：

Chl a（%）=（11.85×△1-1.54×△2-0.08×△3） ×V1/V

△1=A664-A750，△2=A647-A750，△3=A630-A750；

式中，A為不同波長(zhǎng)下吸光度；V為樣品量；V1為上清液定容量。

1.4.4 丙二醛含量和抗氧化酶活性測(cè)定

取10 mL目標(biāo)活性菌株的無(wú)菌發(fā)酵濾液，分別添加至90 mL對(duì)數(shù)期3種甲藻培養(yǎng)物中，對(duì)照組不加菌液而加等體積2216E（1/10）液體培養(yǎng)基。按藻種培養(yǎng)條件培養(yǎng)24，48和72 h取樣。粗酶液制備：取

30 mL樣品經(jīng)6500 r/min離心5 min，收集藻細(xì)胞，在冰水浴中勻漿5次（8000 r/min，作用時(shí)間10 s，間隔時(shí)間5 s），加入2 mL預(yù)冷的PBS緩沖液（0.1 mol/L，

pH 7.4），渦旋混勻3 min，8000 r/min離心10 min取上清液，即粗酶液儲(chǔ)存在-20 °C待測(cè)[14]。采用相應(yīng)試劑盒（南京建城生物工程研究所）測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性。

1.4.5 胞外溶解性有機(jī)物（EDOM）組成

收集“1.4.3”中樣品的上清濾液，經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜（BKMAM）后收集胞外溶解性有機(jī)物溶液，使用熒光分光光度計(jì)（F-7000，日立）檢測(cè)。參數(shù)設(shè)置：激發(fā)光源為15 W氙燈，光電倍增管電壓700 V，信噪比>110，激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）和發(fā)射波長(zhǎng)（Em）掃描范圍分別為220～500 nm和220～550 nm，步長(zhǎng)為10 nm，掃描速度為12000 nm/min[15]。數(shù)據(jù)經(jīng)OriginPro 2021軟件繪圖，圖中誤差棒代表3次實(shí)驗(yàn)之間的標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.5 目標(biāo)菌株的基因組分析

將菌株接種于1/10的2216E液體培養(yǎng)基中，28 °C、

180 r/min搖瓶震蕩培養(yǎng)5 d，8000 r/min離心10 min收集菌體，用無(wú)菌水洗滌菌體三次后裝入離心管，迅速冷凍后寄送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成基因組的提取、測(cè)序、組裝和注釋，通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，http：//www.genome.jp/kegg/）和碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（CAZy，http：//www.cazy.org/）分別預(yù)測(cè)目標(biāo)菌株中參與溶藻作用的代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶的合成基因。

2 結(jié)果與討論

2.1 溶藻細(xì)菌篩選

將24株細(xì)菌進(jìn)行溶藻活性篩選，獲得15株細(xì)菌對(duì)至少一種甲藻表現(xiàn)出溶藻活性（抑制率大于50%，表2），總計(jì)有10株、4株和10株細(xì)菌分別對(duì)東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻表現(xiàn)出溶藻效果；其中，菌株M026對(duì)3種甲藻均表現(xiàn)出顯著的溶藻活性。

在對(duì)照組中，3種甲藻的藻細(xì)胞生長(zhǎng)良好，細(xì)胞膜完整，葉綠體分布均勻（圖1A/B/C-對(duì)照組）；在實(shí)驗(yàn)組中，東海原甲藻（圖A-實(shí)驗(yàn)組）和微小原甲藻（圖B-實(shí)驗(yàn)組）細(xì)胞膜破裂，胞內(nèi)溶物呈顆粒狀逐漸散開(kāi)，最終藻細(xì)胞死亡；米氏凱倫藻細(xì)胞出現(xiàn)萎縮，邊緣模糊，葉綠體聚團(tuán)并出現(xiàn)黃化現(xiàn)象，體積顯著減少，進(jìn)而細(xì)胞破裂，內(nèi)容物流出，細(xì)胞死亡（圖C-實(shí)驗(yàn)組）。隨著共培養(yǎng)時(shí)間增加，視野中死亡的藻細(xì)胞數(shù)量增加?？梢?jiàn)，菌株M026對(duì)于3種甲藻具有很強(qiáng)的破壞能力。

2.2 菌株M026溶藻特性

2.2.1 M026不同生長(zhǎng)階段對(duì)溶藻活性影響

不同生長(zhǎng)階段M026發(fā)酵無(wú)菌濾液對(duì)東海原甲藻，微小原甲藻和米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響如圖2所示。隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，3對(duì)照組的藻生物量增加，各階段的M026菌液對(duì)3種甲藻的抑制活性增加。當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間相同，實(shí)驗(yàn)組中的3種甲藻細(xì)胞中Chl-a含量呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05），而對(duì)照組由于對(duì)數(shù)期藻細(xì)胞的繁殖，其Chl-a含量呈現(xiàn)略微上升趨勢(shì)；對(duì)應(yīng)實(shí)驗(yàn)組的藻細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)出與藻細(xì)胞中Chl-a含量相同的變化趨勢(shì)，即抑制活性遞增；其中，穩(wěn)定期的M026菌液對(duì)3種甲藻的抑制活性最好?；谝陨辖Y(jié)果，采用穩(wěn)定期M026菌液（發(fā)酵培養(yǎng)5d）進(jìn)行后續(xù)溶藻實(shí)驗(yàn)。

2.2.2 M026發(fā)酵濾液不同投加量對(duì)溶藻活性影響

M026無(wú)菌發(fā)酵濾液的投加量對(duì)東海原甲藻，微小原甲藻和米氏凱倫藻生長(zhǎng)的影響如圖3所示。隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，3對(duì)照組的藻生物量增加，不同添加量的M026菌液對(duì)3種甲藻表現(xiàn)出不同的抑制活性。當(dāng)菌株發(fā)酵液添加量為10%時(shí)，東海原甲藻，微小原甲藻和米氏凱倫藻細(xì)胞數(shù)量及Chl-a含量顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；當(dāng)菌株發(fā)酵液添加量為5%時(shí)，微小原甲藻細(xì)胞數(shù)量及Chl-a含量與對(duì)照組相近，而東海原甲藻和米氏凱倫藻細(xì)胞數(shù)量及Chl-a含量較對(duì)照組的低；當(dāng)菌株發(fā)酵液添加量為2%時(shí)，僅有米氏凱倫藻細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞中Chl-a含量較低；當(dāng)菌株發(fā)酵液添加量為1%時(shí)，3種甲藻細(xì)胞中Chl-a的含量與對(duì)照組的相近，即M026對(duì)3種甲藻的生長(zhǎng)影響較低或沒(méi)有。綜上，采用10%菌液投加量進(jìn)行后續(xù)溶藻機(jī)理初探實(shí)驗(yàn)。

2.2.3 藻細(xì)胞丙二醛含量和抗氧化酶活性變化

丙二醛作為機(jī)體中膜脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，可依據(jù)其含量變化來(lái)評(píng)估機(jī)體氧化損傷程度，進(jìn)而判斷機(jī)體受到自由基攻擊的情況[16]。如圖3A所示，在空白對(duì)照組中，3種供試甲藻的MDA含量始終保持在相對(duì)較低且穩(wěn)定水平，在0.147～0.201 nmol/mg prot （prot表示蛋白質(zhì)，下同）波動(dòng)；在相同濾液投加量的實(shí)驗(yàn)組中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，3種甲藻中MDA含量總體都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。共培養(yǎng)24 h時(shí)，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻中MDA含量分別為0.809，0.448和0.943 nmol/mg prot，分別為對(duì)照組的5.4倍，2.7倍和5.9倍；共培養(yǎng)48 h時(shí)，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻中MDA含量分別上升至1.196，1.112和1.900 nmol/mg prot，分別為對(duì)照組的8.1倍，5.8倍和12.8倍；共培養(yǎng)72 h時(shí)，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻中MDA含量分別上升至1.565，0.181和2.148 nmol/mg prot，分別為對(duì)照組的9.7倍，5.9倍和13.4倍；其中，微小原甲藻的MDA含量升高幅度較小，在培養(yǎng)48 h后，其增長(zhǎng)倍數(shù)變化不大。綜上，在M026無(wú)菌發(fā)酵濾液作用下，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻均會(huì)受到不同程度的損傷，并且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，膜脂過(guò)氧化損傷的程度越高。

如圖4B，對(duì)照組中SOD活性保持在較低而平穩(wěn)的水平上，即培養(yǎng)72 h內(nèi)SOD酶活在11.15～27.11 U/mg

prot；實(shí)驗(yàn)組中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種甲藻的SOD活性呈現(xiàn)出較對(duì)照組先上升后下降的趨勢(shì)；其中在共培養(yǎng)48 h后，東海原甲藻和微小原甲藻的SOD活性最高。共培養(yǎng)24 h，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻的SOD活性分別為79.373，40.476和171.438 U/mg prot，分別為對(duì)照組的5.3倍，3.6倍和13.4倍，此時(shí)米氏凱倫藻的SOD活性最高；共培養(yǎng)48 h，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻的SOD活性分別為131.438，101.059和99.037 U/mg prot，分別為對(duì)照組的7.1倍，5.5倍和4.5倍，此時(shí)東海原甲藻和微小原甲藻的SOD活性最高；共培養(yǎng)72 h，東海原甲藻、微小原甲藻和米氏凱倫藻的SOD活性分別為91.483，51.330和78.058 U/mg prot，分別為對(duì)照組的3.4倍，2.1倍和3.6倍。如圖3C，對(duì)照組中CAT活性在培養(yǎng)72 h內(nèi)均處在較低且平穩(wěn)水平，即7.440～10.592 U/mg prot；實(shí)驗(yàn)組中，東海原甲藻在培養(yǎng)24 h，48 h和72 h時(shí)CAT活性分別為44.891，63.985和30.063 U/mg prot，分別是對(duì)照組的5.2倍，6.6倍和2.8倍；微小原甲藻在培養(yǎng)24 h，48 h和72 h時(shí)CAT活性分別為34.110，50.208和20.163 U/mg prot；分別是對(duì)照組的4.0倍，5.4倍和1.9倍；米氏凱倫藻在培養(yǎng)24，48和72 h時(shí)CAT活性分別為68.629，36.366和15.823 U/mg

prot，分別是對(duì)照組的9.2倍，3.8倍和1.5倍。如圖3D，3種供試藻種的APX活性變化趨勢(shì)與SOD、CAT活性變化趨勢(shì)相同，APX活性較對(duì)照組提升2.7～10.7倍。綜上所述，在M026無(wú)菌發(fā)酵濾液的脅迫下，3種供試藻種均開(kāi)啟了自我防御機(jī)制。

2.3 藻胞外溶解性有機(jī)物（EDOM）組成

研究指出，藻類有機(jī)物含有蛋白質(zhì)、氨基酸和腐殖酸類等物質(zhì)[17]，通過(guò)研究M026細(xì)菌發(fā)酵液與甲藻共培養(yǎng)過(guò)程中，甲藻胞外有機(jī)物組成變化如圖5～7所示，推測(cè)M026中具有潛在溶藻活性物質(zhì)。3組對(duì)照組光譜中均檢測(cè)到激發(fā)和發(fā)射中心位置為280/335 nm

（Ex/Em，下同）的類色氨酸熒光峰（FL-a），此類物質(zhì)多為含氮物質(zhì)和芳香族氨基酸等[18]；其中，米氏凱倫藻對(duì)照組中的FL-a強(qiáng)度高，即米氏凱倫藻代謝產(chǎn)物中類色氨酸豐富；此外，還檢測(cè)到類富里酸熒光峰（260/440 nm，F(xiàn)L-b）和類腐殖酸熒光峰（340/440 nm，F(xiàn)L-c），此類物質(zhì)是微生物降解有機(jī)物或藻類細(xì)胞后的代謝產(chǎn)物，不能被溶藻菌作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[19]。

與對(duì)照組相比，除檢測(cè)到FL-a、FL-b和FL-c外，還在共培養(yǎng)48和72 h的東海原甲藻處理組及72 h

米氏凱倫藻里均檢測(cè)到類蛋白熒光峰（230/330 nm，F(xiàn)L-d）[14]。隨著共培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，溶藻產(chǎn)物中類富里酸和類蛋白物質(zhì)的熒光峰強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì)。綜上，M026破壞了3種甲藻細(xì)胞的同時(shí)釋放了類富里酸和類蛋白等藻細(xì)胞內(nèi)有機(jī)物，且共培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，藻細(xì)胞破壞和降解程度越嚴(yán)重。

2.4 M026全基因組分析

基于基因組信息對(duì)菌株M026合成次級(jí)代謝產(chǎn)物及相關(guān)酶的潛力進(jìn)行預(yù)測(cè)，菌株M026基因全長(zhǎng)為3.2 Mbp，G+C含量為64.8%。經(jīng)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析，菌株M026中含有合成組氨酸的代謝途徑和相關(guān)酶活（表3）；CAZy數(shù)據(jù)庫(kù)分析，菌株M026中含有植物細(xì)胞壁降解酶系，主要降解由纖維素、木質(zhì)素、（半乳）甘露聚糖、葡聚糖等多糖組成的植物細(xì)胞壁（表4）。

3 討論

3.1 溶藻細(xì)菌與赤潮的生物防治

近年來(lái)，面對(duì)國(guó)際上赤潮暴發(fā)頻率增加、影響面積增大及發(fā)生地增多等赤潮防控領(lǐng)域亟待解決的重大問(wèn)題，迫切需要尋找一種新型高效環(huán)保的赤潮調(diào)控方法。目前，“以菌治藻”是最有潛質(zhì)生物防治手段，其基于溶藻菌易培養(yǎng)、高效裂解藻細(xì)胞及安全性能高等特點(diǎn)，深入研究其溶藻特性及作用機(jī)理，研發(fā)出經(jīng)濟(jì)高效、環(huán)境友好型生物的除藻劑。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)甲藻的研究主要集中在其生長(zhǎng)特性、藻毒素毒理效應(yīng)、群落結(jié)構(gòu)特征及赤潮消亡過(guò)程

等[20-22]，對(duì)溶藻菌的相關(guān)研究仍處于初步階段。已報(bào)道的甲藻溶藻菌主要有海桿菌屬（Marinobacter），弧菌屬（Vibrio），交替假單胞菌屬（Pseudoalteromonas），芽孢桿菌屬（Bacillus），Muricauda屬等[23-26]。本研究從廣西潿洲島海域海水中分離出的1株對(duì)3種有害甲藻具有很強(qiáng)溶藻能力的菌株M026，隸屬于α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）中的短小盒菌屬（Parvularcula），這不僅豐富了甲藻溶藻菌資源庫(kù)信息，還為開(kāi)發(fā)新型生物除藻劑提供依據(jù)。

3.2 溶藻物質(zhì)對(duì)藻細(xì)胞生理活性的影響

膜脂過(guò)氧化終產(chǎn)物丙二醛可作為反映機(jī)體非酶類抗氧化能力的指標(biāo)[27]，即可用于判斷細(xì)胞膜完整性指標(biāo)。在M026發(fā)酵無(wú)菌濾液脅迫下，甲藻中MDA含量增加，藻細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化加劇，細(xì)胞膜的完整性破壞，進(jìn)而導(dǎo)致藻細(xì)胞死亡。此外，當(dāng)藻際環(huán)境不友好時(shí)，藻細(xì)胞會(huì)主動(dòng)產(chǎn)生大量活性氧（ROS），ROS的過(guò)度積累會(huì)使細(xì)胞中脂質(zhì)降解，蛋白質(zhì)變性，DNA異構(gòu)化，氧化損傷嚴(yán)重，進(jìn)而致使藻細(xì)胞死亡。藻細(xì)胞會(huì)通過(guò)分泌SOD、CAT和APX等抗氧化酶來(lái)避免ROS過(guò)度積累引起的傷害，其中SOD催化超氧陰離子發(fā)生歧化變?yōu)檫^(guò)氧化氫[28]，CAT和APX再將過(guò)氧化氫降解為水，從而維持藻細(xì)胞內(nèi)ROS含量處于較低水平以減少藻細(xì)胞損傷[29]。在溶藻物質(zhì)作用下，本研究中3種抗氧化酶活性整體先呈上升趨勢(shì)，表明藻細(xì)胞出現(xiàn)損傷，機(jī)體自身的防御機(jī)制開(kāi)啟。隨著作用時(shí)間增加，SOD、CAT和APX活性均不足以清除大量的ROS或抵制其帶來(lái)的氧化損傷，最終藻細(xì)胞仍然遭受不可逆轉(zhuǎn)的氧化損傷，酶活性喪失，藻細(xì)胞死亡。綜上，推測(cè)菌株M026在脅迫藻細(xì)胞過(guò)程中，溶藻物質(zhì)刺激藻細(xì)胞在短時(shí)間產(chǎn)生大量有害自由基，或是溶藻物質(zhì)具有強(qiáng)氧化性可產(chǎn)生大量有害自由基，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)失衡，藻細(xì)胞膜完整性被破壞，膜通透性增加，大量溶藻物質(zhì)進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)，最終細(xì)胞破裂死亡。

3.3 菌株M026中溶藻物質(zhì)的挖掘

初步確定了M026對(duì)藻細(xì)胞生理活性的影響，但對(duì)其溶藻機(jī)理的深入研究仍需繼續(xù)。據(jù)報(bào)道，溶藻活性物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、含氮化合物、抗生素、生物堿和色素等[30]。為了明確其作用機(jī)制，往往需要對(duì)菌株中活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)解析等，這會(huì)花費(fèi)大量時(shí)間、精力和費(fèi)用[31]，

且分離到的化合物種類和數(shù)量較理論的低[32]。因此，本文采用分子生物學(xué)手段對(duì)菌株M026進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析，挖掘菌株M026中潛在的溶藻活性物質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株M026中具有合成組氨酸完整的代謝通路。此外，菌株M026中含有植物細(xì)胞壁降解酶系，可降解由纖維素、木質(zhì)素、（半乳）甘露聚糖、葡聚糖等聚合物組成的植物細(xì)胞壁。后續(xù)對(duì)溶藻物質(zhì)進(jìn)行分離、檢驗(yàn)和分析，可進(jìn)一步確定溶藻的作用機(jī)制。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)菌株P(guān)arvularcula maris M026通過(guò)胞外分泌溶藻物質(zhì)經(jīng)間接溶藻作用而導(dǎo)致3種甲藻的裂解，溶藻效果受到菌液發(fā)酵時(shí)間、投加量等因素的影響；溶藻物質(zhì)通過(guò)脅迫藻細(xì)胞動(dòng)態(tài)氧化平衡失衡，影響藻細(xì)胞正常生理狀態(tài)，藻細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化破壞了結(jié)構(gòu)完整性，細(xì)胞膜通透性增加，大量胞外物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)葉綠素a合成受阻，抑制細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝，最終細(xì)胞停止分裂，藻體死亡；預(yù)測(cè)菌株代謝的溶藻物質(zhì)為組氨酸和降解植物細(xì)胞壁的酶等。

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