哺乳動(dòng)物的大腦皮層發(fā)揮著感知認(rèn)知、意識(shí)運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶等多種功能，這主要靠不同腦區(qū)復(fù)雜的神經(jīng)元連接發(fā)揮著作用，要了解其中的機(jī)制，解析大腦皮層不同腦區(qū)的細(xì)胞類型組成是最基本的研究工作。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，尤其是2020年華大基因公司發(fā)布的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的誕生[1]，使得大腦的細(xì)胞研究從化學(xué)和物理水平向生物分子水平跨越了一大步。該技術(shù)不但能檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞的分子特征，還能實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞的精準(zhǔn)定位，幫助我們更好地理解神經(jīng)元與神經(jīng)元、神經(jīng)元與膠質(zhì)細(xì)胞的分布規(guī)律及其互作方式，從而認(rèn)識(shí)不同功能的腦區(qū)是如何協(xié)調(diào)運(yùn)作的。

大腦皮層的結(jié)構(gòu)和功能

大腦作為哺乳動(dòng)物的最高級(jí)神經(jīng)中樞，它通過(guò)神經(jīng)元之間的連接，實(shí)現(xiàn)感知認(rèn)知、意識(shí)運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)記憶等多種功能。包裹在大腦最外層的區(qū)域?yàn)榇竽X皮層，也稱為新皮層，它是維持大腦正常運(yùn)作的核心區(qū)域，除了大腦皮層內(nèi)部神經(jīng)元的連接和信息的傳遞，還負(fù)責(zé)接收和傳遞皮層下腦區(qū)的信息。

高級(jí)哺乳動(dòng)物的大腦皮層在外觀上有很大不同，主要表現(xiàn)在皮層中的溝回?cái)?shù)目和深度，對(duì)于溝回的形成，有觀點(diǎn)認(rèn)為：“溝回是大腦皮層在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程擠壓出來(lái)的，是為了容納更多的神經(jīng)細(xì)胞?！贝竽X皮層可劃分為不同的區(qū)域，最早提出的是布羅德曼分區(qū)[2]；也可依據(jù)皮層所執(zhí)行的功能，進(jìn)一步劃分為9個(gè)功能區(qū)：前額葉皮層、額葉皮層、頂葉皮層、顳葉皮層、島葉皮層、枕葉皮層、聽(tīng)覺(jué)皮層、軀體感覺(jué)皮層和扣帶回皮層。不同區(qū)域的腦區(qū)一般主要參與某一部分的工作，完整的工作往往需要不同腦區(qū)中的神經(jīng)元互相協(xié)作發(fā)揮功能完成指令。如在查看學(xué)習(xí)資料的時(shí)候，枕葉中的神經(jīng)元負(fù)責(zé)接受視覺(jué)信號(hào)，讀取信息后再將其傳輸至前額葉皮層，由前額葉進(jìn)行高級(jí)的計(jì)算處理，歸納和總結(jié)所“見(jiàn)”資料，再把信號(hào)傳輸給其他負(fù)責(zé)記憶功能的腦區(qū)，才能完成整個(gè)學(xué)習(xí)過(guò)程。

新皮層作為哺乳動(dòng)物大腦進(jìn)化上最為復(fù)雜和顯著不同于其他動(dòng)物的區(qū)域，具有獨(dú)特的6個(gè)分層[4]，由外向內(nèi)依次為分子層（第Ⅰ層，含其他層神經(jīng)細(xì)胞的軸突、樹突及少量神經(jīng)元），外顆粒層（第Ⅱ?qū)樱?含小顆粒神經(jīng)元），外錐體細(xì)胞層（第Ⅲ層，含小錐體神經(jīng)元），內(nèi)顆粒層（第Ⅳ層，顆粒神經(jīng)元），內(nèi)錐體層（第Ⅴ層，含大錐體神經(jīng)元），多形層（第Ⅵ層，含少量大型錐體神經(jīng)元，一些小紡錘形錐體神經(jīng)元和多形態(tài)神經(jīng)元）。其中，第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ層的神經(jīng)元主要負(fù)責(zé)發(fā)送和接收信號(hào)，其中第Ⅲ層的細(xì)胞投射到相鄰的皮層區(qū)域，第Ⅱ?qū)蛹?xì)胞可投射到更遠(yuǎn)處的皮層區(qū)域。而第Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ層接受來(lái)自相鄰皮層神經(jīng)元細(xì)胞的信號(hào)輸入，并可再將信號(hào)發(fā)送到皮層下核團(tuán)，如丘腦。這是大腦皮層維持大腦正常運(yùn)作的基本結(jié)構(gòu)。

進(jìn)化比較研究發(fā)現(xiàn)，靈長(zhǎng)類動(dòng)物腦區(qū)體積的增大，伴隨著神經(jīng)元數(shù)量和大腦溝回?cái)?shù)目的增加，同時(shí)也伴隨著新皮層的巨大擴(kuò)張，新皮層中所包含的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目遠(yuǎn)超大腦其他區(qū)域，這也是當(dāng)前認(rèn)為人類和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物相比較嚙齒類動(dòng)物，可以形成更高級(jí)認(rèn)知功能的一個(gè)重要原因[5]。在腦的進(jìn)化過(guò)程中，無(wú)論是大腦皮層中復(fù)雜結(jié)構(gòu)的形成，還是高級(jí)動(dòng)物獨(dú)有的6層分層結(jié)構(gòu)，都說(shuō)明理解大腦運(yùn)作方式的必要條件是解析大腦皮層中的細(xì)胞組成，包括不同腦區(qū)下不同分層中的神經(jīng)元組成。

大腦皮層中神經(jīng)細(xì)胞的鑒定

神經(jīng)科學(xué)研究的初期，主要通過(guò)解剖學(xué)以及后來(lái)發(fā)展起來(lái)的免疫組織化學(xué)技術(shù)，根據(jù)形態(tài)特征將細(xì)胞分類為神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和非神經(jīng)元。通過(guò)電生理技術(shù)記錄神經(jīng)元的電信號(hào)，來(lái)分析這些神經(jīng)元的功能。其中，負(fù)責(zé)激活下游神經(jīng)元活性的細(xì)胞為興奮性神經(jīng)元，反之抑制下游神經(jīng)元活性的為抑制性神經(jīng)元。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種高通量測(cè)序技術(shù)，可用于檢測(cè)組織或細(xì)胞的基因表達(dá)水平。隨著轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)展到單細(xì)胞、單核水平，大量研究開始基于RNA分子水平的特征來(lái)解析和比較不同腦區(qū)的細(xì)胞組成，對(duì)基因表達(dá)相似的神經(jīng)元和非神經(jīng)元進(jìn)行分群，并定義出不同的細(xì)胞群，研究不同腦區(qū)的功能與其細(xì)胞組成或特定群神經(jīng)元的聯(lián)系，識(shí)別神經(jīng)性或精神疾病相關(guān)的細(xì)胞類型和基因，進(jìn)一步研究它們與腦的認(rèn)知、記憶等功能和腦疾病的關(guān)系。

當(dāng)前對(duì)大腦皮層的細(xì)胞組成和分子特征的研究策略，包括：從關(guān)注特定功能的單個(gè)腦區(qū)到多個(gè)腦區(qū)的比較，進(jìn)而對(duì)全腦進(jìn)行解析，繪制全腦單細(xì)胞類型圖譜；從單物種到跨物種比較，在進(jìn)化水平上理解人類具備更高級(jí)認(rèn)知能力的原因。技術(shù)上的革新也逐漸從組織水平發(fā)展到單細(xì)胞水平的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，再跨越到分辨率更高、具有細(xì)胞定位的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)。

2023年7月，中國(guó)科學(xué)院神經(jīng)科學(xué)研究所與華大基因公司合作，使用空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（Stereo-seq）和單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（snRNA-seq），捕獲了近150萬(wàn)個(gè)單細(xì)胞核，收集了161張獼猴腦切片，基本覆蓋了獼猴大腦全皮層，獲得了世界首套單細(xì)胞分辨率獼猴大腦皮層細(xì)胞空間分布圖譜。該研究獲得了264個(gè)細(xì)胞類型的空間分布，發(fā)現(xiàn)大腦皮層不同區(qū)域的細(xì)胞組成與傳統(tǒng)的功能分區(qū)、皮層的層次結(jié)構(gòu)（hierarchy）顯著相關(guān)；大量興奮性神經(jīng)元、抑制性神經(jīng)元和非神經(jīng)元在大腦皮層的分布，呈現(xiàn)明顯的腦區(qū)或者層次的特異性；通過(guò)與已知的人腦和鼠腦單細(xì)胞數(shù)據(jù)的跨物種比較，發(fā)現(xiàn)了靈長(zhǎng)類特有的分布于第四層的興奮性神經(jīng)元，這些細(xì)胞高表達(dá)與人類疾病相關(guān)的基因，包括FOXP2、DCC和EPHA3等[6]。

2023年12月，腦科學(xué)計(jì)劃-細(xì)胞普查聯(lián)盟基于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)、單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)和表觀基因組測(cè)序技術(shù)，報(bào)告了迄今為止最為全面和詳細(xì)的小鼠大腦細(xì)胞類型圖譜。這些成果表明，通過(guò)大規(guī)模高通量測(cè)序技術(shù)可幫助科學(xué)家進(jìn)一步在分子水平上研究哺乳動(dòng)物大腦的發(fā)育和進(jìn)化，以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)的細(xì)胞類型和分子機(jī)制的鑒定。

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)結(jié)合了顯微成像和常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，在獲取細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的同時(shí)，也獲取了該細(xì)胞的空間位置信息。常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能通過(guò)捕獲細(xì)胞所釋放的mRNA分子，完成對(duì)基因表達(dá)的定量，實(shí)現(xiàn)在分子水平上對(duì)細(xì)胞的分群和注釋。然而，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)所捕獲mRNA分子的原位定量，即可定位細(xì)胞的空間位置。大腦皮層中復(fù)雜的神經(jīng)細(xì)胞組成和突觸連接是大腦正常工作的基礎(chǔ)，空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序更利于解析大腦這種復(fù)雜組織的異質(zhì)性，在分子水平幫助解析大腦發(fā)育過(guò)程中不同細(xì)胞狀態(tài)的時(shí)空性，以及與神經(jīng)性疾病發(fā)生的潛在機(jī)制。

根據(jù)其細(xì)胞定位方式、RNA捕獲和定量方法、引物序列設(shè)計(jì)等方面，空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)包含了4種主要技術(shù)類型[7]。

（1）基于顯微解剖的基因表達(dá)技術(shù)：其特點(diǎn)是手工操作的成本高、細(xì)胞通量低，如激光捕獲顯微切割技術(shù)，通過(guò)固定腦組織切片、顯微鏡定位、激光束切割目標(biāo)區(qū)域，再提取切割的組織或細(xì)胞的RNA進(jìn)行建庫(kù)測(cè)序。

（2）原位雜交技術(shù)：其原理是通過(guò)與mRNA雜交互補(bǔ)的單鏈RNA分子探針捕獲靶基因序列，并通過(guò)探針?biāo)鶖y帶的熒光基團(tuán)或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記進(jìn)行成像檢測(cè)，使原位的基因表達(dá)可視化，其特點(diǎn)是僅限于已知基因的檢測(cè)，同時(shí)讓多個(gè)基因的表達(dá)可視化有一定難度。如單分子RNA熒光原位雜交技術(shù)，使用熒光團(tuán)標(biāo)記的40個(gè)探針（每個(gè)探針由20個(gè)堿基組成），具有高靈敏度和亞細(xì)胞空間分辨率，但由于光譜重疊的局限性，只能靶向幾個(gè)基因。莊小威團(tuán)隊(duì)開發(fā)的多重?zé)晒庠浑s交技術(shù)的靈敏度更高，彌補(bǔ)了單分子RNA熒光原位雜交技術(shù)通量低的缺陷，當(dāng)前可在單細(xì)胞中同時(shí)完成1萬(wàn)多個(gè)基因的表達(dá)定量，分辨率小于100納米，可在亞細(xì)胞水平定量轉(zhuǎn)錄本（即由一個(gè)基因轉(zhuǎn)錄形成的一種或多種可編碼蛋白質(zhì)的成熟mRNA）。另外，一種用于檢測(cè)位于完整細(xì)胞中目標(biāo)RNA的定量原位雜交技術(shù)——RNAscope，通過(guò)獨(dú)特的探針（雙Z探針）設(shè)計(jì)，可有效防止探針的非特異性結(jié)合，從而具有較強(qiáng)的特異性和靈敏度，針對(duì)無(wú)抗體或無(wú)法通過(guò)抗體檢測(cè)靶標(biāo)的基因，可以使用RNAscope完成在組織水平或單個(gè)神經(jīng)元中的基因表達(dá)定量定位研究。

（3）原位測(cè)序技術(shù)：基于掛鎖探針和熒光原位測(cè)序的兩種技術(shù)，借助酶進(jìn)行擴(kuò)增，但效率有待提高?？臻g解析轉(zhuǎn)錄子擴(kuò)增子讀數(shù)映射（spatially resolved transcript amplication readout mapping， STARmap）是一種結(jié)合了水凝膠組織化學(xué)的原位測(cè)序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)亞細(xì)胞分辨率水平的基因表達(dá)定量，能同時(shí)檢測(cè)1000多個(gè)基因。

（4）原位捕獲技術(shù)：該技術(shù)顯著不同于常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的地方是，用于捕獲細(xì)胞釋放的mRNA引物序列包含了代表空間坐標(biāo)的條形碼。其基本步驟是：將組織切片貼到裝載這種特異引物序列的載玻片上，組織中釋放出的mRNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增、文庫(kù)構(gòu)建和測(cè)序；同時(shí)比較原位雜交技術(shù)和原位測(cè)序技術(shù)對(duì)RNA分子進(jìn)行的原位可視化結(jié)果。原位捕獲技術(shù)是先捕獲轉(zhuǎn)錄本，再進(jìn)行非原位測(cè)序，可實(shí)現(xiàn)全轉(zhuǎn)錄本范圍內(nèi)的RNA捕獲。這種特異引物序列的設(shè)計(jì)，是該技術(shù)成本昂貴的主要原因。

該方法在2016年發(fā)表的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)中被首次提及。其技術(shù)要點(diǎn)是在載玻片上預(yù)置帶空間坐標(biāo)條形碼的引物探針，每個(gè)探針區(qū)域的空間點(diǎn)（spot）直徑為100微米，后續(xù)該技術(shù)分辨率提高到55微米。此外，有團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步提出Slide-seq技術(shù)，即先將帶空間坐標(biāo)條形碼的RT引物探針附著在磁珠上，再將磁珠固定到載玻片上，以獲取所捕獲RNA的位置信息，分辨率達(dá)10微米，后續(xù)又進(jìn)一步優(yōu)化，大大提高了RNA捕獲效率，可達(dá)到普通單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)水平。后又有人使用更小的攜帶空間坐標(biāo)條形碼的磁珠，分辨率達(dá)2微米。2022年，華大基因公司結(jié)合DNA納米球模式陣列和原位RNA捕獲技術(shù)，建立了Stereo-seq技術(shù)，相比較其他空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，它支持更大的捕獲面積（芯片大?。?、更靈敏的基因捕獲能力和更高的細(xì)胞分辨率。

挑戰(zhàn)和前景

當(dāng)前基于原位捕獲技術(shù)原理的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，使用范圍相對(duì)比較廣泛，可通過(guò)芯片捕獲RNA分子，同時(shí)標(biāo)記其空間位置信息，但這類芯片的制作難度大、成本高，當(dāng)前還無(wú)法大規(guī)模推行。高質(zhì)量的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，需要同時(shí)實(shí)現(xiàn)高的單細(xì)胞分辨率、足夠的測(cè)序深度和基因捕獲量、普適不同大小的組織切片等功能。

空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)除在技術(shù)上有突破和加強(qiáng)外，在應(yīng)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)的分析上也發(fā)展出多種算法和工具[8]。

針對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的細(xì)胞分群和類型推斷方法，根據(jù)是否使用參考數(shù)據(jù)集，可分為兩種：一是整合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，通過(guò)映射方式輔助完成細(xì)胞類型的空間定位，包括Spatial-ID、 Cell2location、Seurat、RCTD、Tangram等技術(shù)；二是整合空間轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)提供的基因表達(dá)和空間位置或免疫組化的成像數(shù)據(jù)，通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類和注釋的方式，識(shí)別細(xì)胞類型和類型特異的基因，包括SpaGCN、STAGATE、DestVI等方式。

在基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的細(xì)胞分割方面，主要有三大類方法：一是手動(dòng)操作，基于細(xì)胞膜內(nèi)外的熒光染色強(qiáng)度來(lái)識(shí)別細(xì)胞邊界，進(jìn)行細(xì)胞分割，該方法工作量大，且結(jié)果易受質(zhì)疑；二是監(jiān)督圖像分割，這需借助一個(gè)手動(dòng)注釋的數(shù)據(jù)集，再通過(guò)機(jī)器學(xué)習(xí)或深度學(xué)習(xí)的手段建立學(xué)習(xí)模型，完成細(xì)胞的分割；三是采用無(wú)監(jiān)督方法，完全依賴熒光染色和轉(zhuǎn)錄信號(hào)完成對(duì)細(xì)胞的分割，如Baysor、SCS等技術(shù)。

技術(shù)的發(fā)展在生物醫(yī)學(xué)研究中是非常必要的。空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，為認(rèn)識(shí)大腦的細(xì)胞組成和分子特征奠定了基礎(chǔ)，為腦科學(xué)的研究帶來(lái)了更多的可能性。目前，結(jié)合空間轉(zhuǎn)錄組的多組學(xué)研究在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中的應(yīng)用也越來(lái)越多，從而可以更加系統(tǒng)全面地解析細(xì)胞分子特征和疾病發(fā)生機(jī)制。

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關(guān)鍵詞：大腦 新皮層 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù) ■