蘭 夢，李晶峰，李冬冰，王躍龍，劉 璐，申嘉明，張 輝,*，孫佳明,*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）

炎癥是生物體內(nèi)外環(huán)境受到刺激后，對宿主組織或細(xì)胞的損傷或感染的一種自然生理和免疫反應(yīng)[1-2]。巨噬細(xì)胞通過分泌大量促炎介質(zhì)和促炎細(xì)胞因子在許多炎癥性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用[3-5]。巨噬細(xì)胞對細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（LPS）的識(shí)別觸發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)，誘導(dǎo)多種促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等。目前，LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于與炎癥有關(guān)的體外模型研究[6-7]。

人參是五加科人參屬植物人參（Panax ginsengC.A.Mey.）的干燥根及根莖，是我國傳統(tǒng)名貴中草藥[8]，富含皂苷類、多糖類、氨基酸及多肽等多種化學(xué)成分[9]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參具有抗氧化、抗炎等保健功效[10]。生曬參、紅參和黑參為人參的主要炮制品[11]。生曬參是由人參曬干或烘干而得；鮮人參蒸制一次曬干后得紅參；黑參則是人參經(jīng)“九蒸九曬”制成[12]。目前，國內(nèi)對黑參的研究較少。有研究表明，對比生曬參和紅參，黑參的抗炎、抗腫瘤等生物活性更強(qiáng)[13]。

越來越多的文獻(xiàn)報(bào)道從食物中提取的食源性肽具有良好的抗炎活性，陳元蓉等[14]從小麥胚芽中分離得到4 條抗炎活性肽，可降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中NO 及促炎因子的分泌。于笛等[15]研究發(fā)現(xiàn)，綠豆寡肽能顯著抑制促炎因子水平的上升，并緩解巨噬細(xì)胞由LPS 引起的炎癥。人參作為藥食同源的名貴中藥，從中提取的人參多肽已被證實(shí)具有抗炎活性。田建明等[16]研究發(fā)現(xiàn)人參糖肽通過干預(yù)、抑制TNF-α、IL-2 等多種細(xì)胞因子的釋放進(jìn)而達(dá)到抗炎的作用。氨基酸是構(gòu)成肽的基本單位，肽的活性與氨基酸的組成、序列和含量有關(guān)。據(jù)報(bào)道，疏水性氨基酸可以增強(qiáng)肽與脂類的相互作用，從而更容易進(jìn)入靶細(xì)胞來發(fā)揮抗炎與免疫活性[17]。人參的抗炎活性可能會(huì)受到炮制過程中氨基酸成分和含量變化的影響。已有研究表明，人參在炮制過程中氨基酸含量明顯降低[18]。但將生曬參、紅參和黑參蛋白酶解肽的氨基酸組成及含量的變化與抗炎活性之間的關(guān)系進(jìn)行對比分析的研究還鮮有報(bào)道。

本研究篩選出黑參蛋白酶解肽、紅參蛋白酶解肽和生曬參蛋白酶解肽中對RAW264.7 細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)的活性組分，并確定了三者蛋白酶解活性肽中氨基酸的組成和含量以及細(xì)胞炎癥因子的分泌量。結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析，篩選出三者蛋白酶解活性肽中的特征差異氨基酸以及具有抗炎活性的氨基酸。初步探究了人參炮制過程中肽的氨基酸組成及含量變化與其抗炎活性的相關(guān)性，為三種原料參的利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人參 市售的五年制鮮人參（產(chǎn)地吉林）；堿性蛋白酶（200 U/mg）、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶（50 U/mg） 上海麥克林生化科技有限公司；胃蛋白酶（3000 U/mg） 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7） 上海中喬新舟生物科技有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、新生胎牛血清 美國Gibco 公司；噻唑藍(lán)（MTT） 美國Amresco公司；二甲基亞砜（DMSO） 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；一氧化氮（NO）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒 依科賽生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒 黃石研科生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

10 kDa、3 kDa、1 kDa 超濾膜包 密理博公司；HERAEUS HERAcell 150i 二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋公司；YZ-875 型超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備廠；CX 23 熒光倒置顯微鏡 日本奧林巴斯公司；Model680 型酶標(biāo)儀 日本TAKARA 公司；L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人參三種炮制品粗蛋白的制備 取新鮮人參洗凈，曬干，可得生曬參[19]；人參于蒸鍋中蒸制4 h 后曬干可得紅參[20]；人參于蒸鍋中蒸制4 h 后曬干，同樣操作反復(fù)進(jìn)行九次，可得黑參[21]。取一定量生曬參、紅參、黑參干制品，粉碎，過40 目篩，得人參不同炮制品粉末。分別稱取一定量的三種人參炮制品粉末，按1:8 倍量加入蒸餾水，在20 ℃下分別浸提三次，每次12 h，提取液于3600 r/min 離心30 min，取上清液過濾，三次濾液合并得人參三種炮制品粗蛋白溶液[22]。真空冷凍干燥得三種炮制品粗蛋白粉，于-20 ℃保存，備用。

1.2.2 人參三種炮制品粗蛋白分步酶解 選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶進(jìn)行酶解[23]。將三種炮制品粗蛋白粉與蒸餾水混合均勻，料液比為1:12.5（g/mL），加熱至95 ℃，保溫30 min 后冷卻，使蛋白質(zhì)完全變性。加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH 至9.5，按5000 U/g 加入一定量的堿性蛋白酶，53 ℃下酶解4 h，得到堿性溶液；使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8，按1500 U/g 加入一定量中性蛋白酶，53 ℃下酶解3 h，得到中性溶液；使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH 至3.7，按500 U/g 加入胃蛋白酶，53 ℃下酶解4 h，得到酸性溶液。沸水浴滅酶30 min，冷卻后得續(xù)濾液，分別得生曬參蛋白酶解肽水解液（SGP）、紅參蛋白酶解肽水解液（RGP）和黑參蛋白酶解肽水解液（BGP）備用。

1.2.3 超濾膜分離 選用分子截流量為10、3 和1 kDa 的超濾膜，將水解液分為大于10、3～10、1～3 kDa、小于1 kDa 四個(gè)組分。分別命名為BGP-1～4、RGP-1～4、SGP-1～4，凍干備用。

1.2.4 人參不同炮制品蛋白酶解肽對小鼠巨噬細(xì)胞增殖作用的影響

1.2.4.1 不同超濾組分對RAW264.7 細(xì)胞的增殖作用 采用MTT 法測定不同組分對細(xì)胞增殖率的影響。將凍存的RAW264.7 細(xì)胞復(fù)蘇，用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以每孔4×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后模型組與樣品組加入150 μL 的1 μg/mL LPS 構(gòu)建炎癥模型，空白對照組不造模只加150 μL含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后，棄上清?？瞻讓φ战M加入完全培養(yǎng)基150 μL，模型組加入150 μL 的1 μg/mL LPS，樣品組加入濃度為100 μg/mL 的各個(gè)組分的人參炮制品蛋白酶解肽溶液150 μL，每組5 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，4 h 后棄去上清液，加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上振蕩5 min，490 nm 波長處檢測，根據(jù)測得OD 值，計(jì)算每組細(xì)胞增殖率。獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.4.2 不同質(zhì)量濃度BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞增殖率的影響 按1.2.4.1 項(xiàng)下方法，樣品組分別加入50、100、200 μg/mL 的BGP-4、RGP-4、SGP-4 溶液150 μL，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，每孔加入5 mg/mL 的MTT 10 μL，培養(yǎng)4 h 后棄上清，加入150 μL DMSO，置于酶標(biāo)儀上振蕩5 min，490 nm 波長處檢測OD 值，計(jì)算各組細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.2.4.3 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量及炎癥因子釋放的影響 參照1.2.4.1 項(xiàng)下方法將細(xì)胞接種于96 孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；模型組和樣品組加入LPS 處理，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。樣品組加入50、100、200 μg/mL 的樣品溶液150 μL，每組5 個(gè)復(fù)孔。于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h 后，取上清液，按照NO 試劑盒說明書測定NO 分泌量。根據(jù)試劑盒說明書使用ELISA 試劑盒檢測炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)三次。

1.2.5 三種蛋白酶解肽氨基酸組成分析 取小于1 kDa 組分的黑參、紅參、生曬參蛋白酶解肽凍干粉50 mg 置于水解管中，加入15 mL 6 mol/L 的鹽酸，抽真空后110 ℃水解24 h，用氨基酸組成分析儀測定氨基酸組成及含量[24]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，SPSS 24.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。組間比較采用ANOVA 單因素方差分析，P＜0.05，兩組數(shù)據(jù)間差異顯著，數(shù)據(jù)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。利用Oringin 軟件進(jìn)行繪圖制作。通過SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least squares discriminant analysis，PLS-DA）和正交偏最小二乘法判別分析（orthogonal PLS-DA，OPLS-DA），計(jì)算預(yù)測變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）。采用灰色關(guān)聯(lián)度（grey relational degree analysis，GRA）的統(tǒng)計(jì)方法來篩選抑制巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的氨基酸。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同超濾組分對RAW264.7 細(xì)胞的增殖作用

由表1 中測得A 值可以看出，與空白組相比，LPS 模型組能顯著抑制RAW264.7 細(xì)胞增殖（P＜0.05），證明LPS 模型造模成功；由各組細(xì)胞增殖率可以看出，與LPS 模型組相比，各給藥組均不同程度地促進(jìn)受損傷的RAW264.7 細(xì)胞增殖，其中BGP-4、RGP-4、SGP-4 組分活性最強(qiáng)，增殖率分別為58.78%、35.14%、33.19%。因此選擇BGP-4、RGP-4、SGP-4組分做進(jìn)一步研究。

表1 不同超濾組分的BGP、RGP、SGP 對RAW264.7 細(xì)胞的增殖作用Table 1 Proliferative effects of different ultrafiltration fractions of BGP,RGP and SGP on RAW264.7 cells

2.2 不同質(zhì)量濃度BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響

由表2 中測得A 值可知，LPS 能夠顯著抑制RAW264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.05）；在50～200 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞的增殖率呈濃度依賴性，細(xì)胞增殖率隨著濃度升高而增加。在50～200 μg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，BGP-4 促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)（P＜0.05），其次為RGP-4、SGP-4（P＜0.05）。

表2 不同質(zhì)量濃度BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7細(xì)胞增殖率的影響Table 2 Effect of different mass concentrations of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 on the proliferation rate of RAW264.7 cells

2.3 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量及炎癥因子釋放的影響

2.3.1 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量的影響 一氧化氮（NO）是在細(xì)胞存活和死亡中起到關(guān)鍵作用的信號(hào)傳導(dǎo)分子，并且對巨噬細(xì)胞顯示出各種促炎作用。組織損傷的發(fā)病機(jī)制與炎性介質(zhì)的釋放密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞通過分泌過量NO，進(jìn)而介導(dǎo)對損傷的急性期反應(yīng)。因此，NO 抑制劑在治療炎癥疾病中具有極大潛力[25]。本研究采用LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型，檢測人參三種炮制品蛋白酶解肽對LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NO 分泌量的影響，分析三種蛋白酶解肽的抗炎活性。結(jié)果由圖1 可知，與空白組相比，LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 分泌量顯著升高（P＜0.05），表明該模型成功。各組樣品隨著質(zhì)量濃度的增加，NO 分泌量呈逐漸下降的趨勢。其中，BGP-4 抑制RAW264.7 細(xì)胞釋放NO 的能力顯著最強(qiáng)（P＜0.05），其次為RGP-4，SGP-4 的抑制能力最弱。

圖1 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量的影響Fig.1 Effect of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 on NO secretion in RAW264.7 cells

2.3.2 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞釋放TNF-α水平的影響 TNF-α是由活化的單核-巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有廣泛生物學(xué)作用的炎癥介質(zhì)[26]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)TNF-α的濃度較低時(shí)，可調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，具有抗腫瘤、抗感染等多種生物功能。當(dāng)TNF-α濃度過高時(shí)，作為重要的炎癥遞質(zhì)，反而會(huì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的病理生理過程[27]。圖2 表明與空白組相比，1 μg/mL LPS 誘導(dǎo)后RAW264.7 細(xì)胞內(nèi)TNF-α水平顯著增加（P＜0.05）；給藥后各組細(xì)胞上清液中TNF-α濃度隨著樣品質(zhì)量濃度的增加而下降。與RGP-4 和SGP-4 相比，BGP-4 對LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞釋放TNF-α的量抑制作用顯著最強(qiáng)（P＜0.05）。

圖2 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞TNF-α分泌量的影響Fig.2 Effect of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 on TNF-α secretion in RAW264.7 cells

2.3.3 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞釋放IL-6 水平的影響 IL-6 作為一種促炎因子，是細(xì)胞因子家族中的核心成員，是由T 細(xì)胞活化后分泌的一種重要免疫調(diào)節(jié)因子，可與TNF-α共同參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。抑制IL-6 的過度表達(dá)是減輕炎癥的重要手段[28]。由圖3 可知，LPS 模型組可顯著誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞分泌IL-6（P＜0.05）；與模型組相比，各給藥組上清液中IL-6 的分泌量均有所降低且呈濃度依賴性。當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，IL-6 的分泌量達(dá)到最低，顯著低于其他濃度下的樣品組（P＜0.05）。三種蛋白酶解肽對細(xì)胞上清液中IL-6 分泌的抑制順序?yàn)锽GP-4＞RGP-4＞SGP-4。

圖3 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞IL-6分泌量的影響Fig.3 Effect of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 on IL-6 secretion in RAW264.7 cells

2.3.4 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞釋放IL-1β水平的影響 當(dāng)炎癥爆發(fā)時(shí)，細(xì)胞中的炎癥信號(hào)通路被激活并釋放多種促炎因子。IL-1β是促炎因子中重要的代表，它的分泌水平可以反映炎癥反應(yīng)的程度[29]。由圖4 可知，各給藥組對RAW264.7細(xì)胞IL-1β分泌量的刺激作用與劑量有關(guān)。隨著質(zhì)量濃度的增加，IL-1β釋放量不斷降低。在200 μg/mL的質(zhì)量濃度下，IL-1β的分泌量達(dá)到最低，抑制作用最強(qiáng)。其中，BGP-4 抑制RAW264.7 細(xì)胞釋放IL-1β的能力最強(qiáng)（P＜0.05），其次為RGP-4，SGP-4 最弱。

圖4 BGP-4、RGP-4、SGP-4 對RAW264.7 細(xì)胞IL-1β分泌量的影響Fig.4 Effect of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 on IL-1β secretion in RAW264.7 cells

結(jié)果表明，與紅參蛋白酶解肽和生曬參蛋白酶解肽相比，黑參蛋白酶解肽對RAW264.7 細(xì)胞NO分泌量及炎癥因子釋放的抑制作用更強(qiáng)，具有顯著性差異（P＜0.05）。這是由于炮制可提高中藥療效，改變藥物的功能和臨床療效[30]。在加工過程中可能會(huì)導(dǎo)致人參中的有效成分如肽類物質(zhì)發(fā)生一系列轉(zhuǎn)化，使得人參三種炮制品生物活性的差異性[31]。黑參由于蒸制時(shí)間最長，在加熱過程中可能產(chǎn)生更多種類的小分子活性肽，使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其抗炎活性增加。

2.4 三種蛋白酶解肽氨基酸組成分析

氨基酸的組成及含量可以影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，一定程度上決定蛋白酶解肽的生理活性[32]。由表3 可知，三種蛋白酶解肽的氨基酸組成基本一致，均含有17 種氨基酸，但含量有所差異。BGP-4、RGP-4、SGP-4 氨基酸總含量為52.619、56.754、64.042 g/100 g。其中，苯丙氨酸的含量是BGP-4、RGP-4、SGP-4 氨基酸總含量中占比最高的，分別為17.073、15.384、14.704 g/100 g，且黑參蛋白酶解肽的苯丙氨酸含量高于紅參蛋白酶解肽和生曬參蛋白酶解肽。研究表明，疏水性氨基酸更容易進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用，有利于提高活性肽的抗炎活性[33]。由此推測，苯丙氨酸作為疏水性氨基酸，其含量的高低與人參不同炮制品蛋白酶解肽的抗炎效果有著一定聯(lián)系。

表3 BGP-4、RGP-4、SGP-4 的氨基酸組成及含量Table 3 Amino acid composition and content of BGP-4,RGP-4 and SGP-4

2.5 BGP-4、RGP-4、SGP-4 的氨基酸多元統(tǒng)計(jì)分析

通過PCA（無監(jiān)督）模式識(shí)別化學(xué)計(jì)量學(xué)對三種炮制品蛋白酶解肽所含氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見圖5A。從圖中可以看出，通過PCA 法可以將三種炮制品蛋白酶解肽分開，三者間存在一定差異，推測可能是人參炮制過程中，由于蒸制時(shí)間不同會(huì)發(fā)生一系列較為復(fù)雜的化學(xué)成分轉(zhuǎn)化，造成了氨基酸含量的變化。其次，進(jìn)行了監(jiān)督的OPLS-DA 分析散點(diǎn)圖（圖5B）來發(fā)現(xiàn)三種炮制品蛋白酶解肽之間的差異氨基酸。此外還進(jìn)行了置換檢驗(yàn)（n=200），來評(píng)估判別模型是否對數(shù)據(jù)過度擬合。如圖6 所示，PLS-DA 模型排列實(shí)驗(yàn)中左側(cè)任意一次隨機(jī)變量y 變量所產(chǎn)生的R2值和Q2值均小于右側(cè)的原始點(diǎn)，且Q2點(diǎn)的回歸線與垂直軸（左側(cè)）截距為負(fù)數(shù)（R2=0.255，Q2=-0.362），說明該模型沒有過度擬合，表明模型有效[34]。分析得到的VIP 值見表4，選取VIP＞1，表示其差異性貢獻(xiàn)率大于其他組分，得到三種炮制品蛋白酶解肽所含的差異氨基酸分別是His、Trp、Arg、Phe、Glu、Leu、Ala、Gly、Ile、Thr 和Met。

圖5 BGP-4、RGP-4、SGP-4 的PCA 分析散點(diǎn)圖（A）和OPLS-DA 分析散點(diǎn)圖（B）Fig.5 PCA analysis scatterplot (A) and OPLS-DA analysis scatterplot (B) for BGP-4,RGP-4 and SGP-4

圖6 BGP-4、RGP-4、SGP-4 的PLS-DA 模型圖Fig.6 PLS-DA model diagram for BGP-4,RGP-4 and SGP-4

表4 BGP-4、RGP-4、SGP-4 基于OPLS-DA 分析的VIP 值Table 4 VIP values of BGP-4,RGP-4,SGP-4 based on OPLS-DA analysis

通過PCA 分析得到三種人參炮制品蛋白酶解肽中的特征差異氨基酸，但未能篩選出促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞活性的氨基酸。故本研究以NO 和細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）釋放量為活性指標(biāo)，應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）篩選出抑制RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞炎癥因子的氨基酸。使用EXCEL 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，將BGP-4、RGP-4、SGP-4 的氨基酸含量Xi（自變量）設(shè)為比較數(shù)列（子序列）；RAW264.7 分泌炎癥因子的含量X0 設(shè)為參考序列[35]，將對應(yīng)的數(shù)據(jù)輸入到EXCEL 表中，進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)分析。當(dāng)關(guān)聯(lián)度＞0.7 時(shí)，認(rèn)為子序列與母序列之間存在一定關(guān)聯(lián)性。結(jié)果表明（見表5），Asp、Ser、Val、Phe、Lys 與抑制炎癥因子含量水平相關(guān)。

表5 BGP-4、RGP-4、SGP-4 的氨基酸含量與抗炎指標(biāo)的關(guān)聯(lián)序和關(guān)聯(lián)度Table 5 Sequence and correlation of amino acid content of BGP-4,RGP-4 and SGP-4 with anti-inflammatory indexes

綜合多元統(tǒng)計(jì)分析VIP＞1 和灰色關(guān)聯(lián)度＞0.7，篩選出三種人參炮制品蛋白酶解肽的特征性氨基酸為Phe。

苯丙氨酸在體內(nèi)大部分經(jīng)苯丙氨酸羥化酶催化作用氧化成酪氨酸，并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素，參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝[36]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苯丙氨酸在兩親性α螺旋肽發(fā)揮抗菌、抗炎作用中具有非常重要的作用，可抑制炎癥因子過度表達(dá)[37]。由此推測，苯丙氨酸含量的高低與人參炮制品蛋白酶解肽的抗炎作用有一定關(guān)系，這可能是三種炮制品蛋白酶解肽中黑參蛋白酶解肽體外抗炎活性最佳的原因之一。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用酶解法、超濾分離從人參三種炮制品中提取蛋白酶解肽。通過LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥模型對三種蛋白酶解肽的抗炎活性進(jìn)行對比分析發(fā)現(xiàn)，黑參蛋白酶解肽的抗炎活性強(qiáng)于紅參蛋白酶解肽和生曬參蛋白酶解肽，能夠顯著抑制NO 及炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的分泌（（P＜0.05）。黑參蛋白酶解肽質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時(shí)，促進(jìn)RAW264.7 細(xì)胞增殖的能力最強(qiáng)（P＜0.05），增殖率為72.89%。綜合多元統(tǒng)計(jì)分析（VIP＞1）和灰色關(guān)聯(lián)度分析（關(guān)聯(lián)度＞0.7）結(jié)果篩選出Phe 為三種人參炮制品蛋白酶解肽的特征差異性成分。三種蛋白酶解肽的Phe 含量順序?yàn)椋汉趨⒌鞍酌附怆模?7.07%）＞紅參蛋白酶解肽（15.38%）＞生曬參蛋白酶解肽（14.70%）。黑參蛋白酶解肽所含Phe 含量最高，這可能是在相同濃度下黑參蛋白酶解肽抗炎效果最好的原因之一。但黑參蛋白酶解肽中苯丙氨酸含量的增加與其抑制巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子能力增強(qiáng)的內(nèi)在關(guān)系并不清楚，以及黑參中活性肽的抗炎機(jī)制還有待研究。未來黑參多肽的深入研究將是人參炮制品高效利用和科學(xué)開發(fā)的新領(lǐng)域。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).