李家旭，成鈺瑩，楊 揚(yáng)，王璧瑩，蔣玉珍，陳建萍，黎 攀，杜 冰,*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642；2.香港大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，中國(guó)香港 999077）

檳榔及其制品中含有多種成分，包括碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)、粗纖維、生物堿、皂苷、酚類、氨基酸和微量元素等。其中，生物堿是檳榔及其制品中的主要活性物質(zhì)，包括檳榔堿、檳榔次堿、去甲基檳榔堿、去甲基檳榔次堿、檳榔副堿和高檳榔堿等[1-2]。其中檳榔堿含量在2.98～745.0 μg/mL[3]。

檳榔堿（Methyl-1,2,5,6-tetrahydro-1-methyl-nicotinate）是從檳榔中分離出來(lái)的一種生物堿，被認(rèn)為是檳榔中含量最多的有效成分。檳榔堿的毒性作用可歸因于其對(duì)各種生物過(guò)程的廣泛影響因素[4]，例如抑制參與生物代謝、解毒、染色體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和DNA 修復(fù)系統(tǒng)的基因表達(dá)。研究表明，檳榔堿抑制多種細(xì)胞DNA 和雙鏈核酸的合成，進(jìn)而影響細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移、增殖以及組織附著再生[5]。另外，氧化應(yīng)激在細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡[6]、基因表達(dá)[7]和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)[8]中起著關(guān)鍵作用，而檳榔堿會(huì)阻礙人體內(nèi)抗氧化劑如SOD、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）和活性氧（ROS）的中和[9]。檳榔堿可調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的免疫功能[10]來(lái)調(diào)節(jié)炎癥過(guò)程，例如檳榔堿可能通過(guò)引發(fā)前列腺素E2（PGE-2）和環(huán)氧合酶2（COX-2）的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6（IL-6）的表達(dá)來(lái)引發(fā)上皮炎癥[11-12]。檳榔堿的細(xì)胞毒作用已在口腔上皮細(xì)胞中得到證實(shí)[13-14]。

有研究表明，咀嚼檳榔與胃癌以及食管癌之間存在一定的因果關(guān)系[15]。咀嚼檳榔時(shí)，帶有檳榔活性成分的唾液可能會(huì)經(jīng)過(guò)食道、胃部以及腸道等的消化系統(tǒng)器官，所以，咀嚼檳榔還可能會(huì)導(dǎo)致這些部位發(fā)生黏膜損傷、潰瘍等病變，長(zhǎng)期刺激可能引發(fā)胃癌。利用檳榔堿或者是檳榔提取物經(jīng)過(guò)多種方式如灌胃[16]、混合到飼料中[17]，發(fā)現(xiàn)食道和胃部都具有類似癌癥的癥狀，導(dǎo)致胃黏膜上皮細(xì)胞的p53、Bax及p65 的水平升高[15]。然而，檳榔堿體內(nèi)外損傷模型的系統(tǒng)建立方法未有報(bào)道，檳榔或者是檳榔堿對(duì)消化器官，尤其是胃部的損害以及致癌途徑研究依然不完善。因此本研究采用體外培養(yǎng)人胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1 的方法，探討檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞的毒性，以期建立檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞的損傷模型，為進(jìn)一步闡明檳榔堿的細(xì)胞毒性作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GES-1 人胃黏膜上皮細(xì)胞 武漢普諾賽生命科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基、特級(jí)胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、0.25%含EDTA 胰酶（0.02%EDTA，Trypsin-EDTA）、0.25%無(wú)EDTA 胰酶（Trypsin Solution without EDTA）、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、青霉素-鏈霉素混合液（P/S） 美國(guó)Gibco 公司；檳榔堿（分析標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC≥98%，CAS：63-75-2） 上海源葉生物科技有限公司；LDH 試劑盒、SOD 試劑盒、GSH 試劑盒、ROS 檢測(cè)試劑盒、YO-PRO-1/PI 細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)公司；ATP 酶試劑盒、Na+K+-ATP 酶試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNF-α試劑盒、IL-6 試劑盒、VEGF 試劑盒、TGF-β試劑盒 江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司。

SH 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 上海善志儀器設(shè)備有限公司；DGG-9070B 型鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；ANKE TDL-5-A 型離心機(jī) 上海安亭分析儀器有限責(zé)任公司；Labserv K3 型酶標(biāo)儀、BD FACSCalibur 流式細(xì)胞儀 賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；SW-CJ-I-1FD 蘇潔超凈工作臺(tái) 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；ZEISS Lab.A1 倒置生物學(xué)顯微鏡 德國(guó)蔡司公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) GES-1 細(xì)胞培養(yǎng)在含10%（體積分?jǐn)?shù)）FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在5%（體積分?jǐn)?shù)）CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活力 設(shè)置只含有新鮮培養(yǎng)液為空白孔，含有細(xì)胞且不含樣品作為對(duì)照孔，含有不同質(zhì)量濃度檳榔堿孔為實(shí)驗(yàn)孔（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL），每組樣品設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。

取出生長(zhǎng)狀態(tài)良好細(xì)胞，用胰酶消化后制成細(xì)胞懸液，以1×104個(gè)/mL 的密度將細(xì)胞接種在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)12 h 使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。

棄去細(xì)胞培養(yǎng)板的培養(yǎng)基，空白孔與對(duì)照孔加入新鮮的完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)孔按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（10、20、30、60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔100 μL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h/48 h 后棄去培養(yǎng)基，用PBS 清洗1 次后每孔加入10 μL的CCK8 試劑和90 μL 的完全培養(yǎng)基，將孔板在培養(yǎng)箱內(nèi)放置4 h，測(cè)定450 nm 處吸光值（A 值），計(jì)算細(xì)胞活力。

式中，V 指細(xì)胞活力；A 指樣品組的A 值；A0指空白組的A 值；A1指對(duì)照組的A 值。

1.2.3 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞形態(tài)的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好GES-1 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 GES-1 細(xì)胞活性氧檢測(cè) 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好GES-1 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，參考冷彥等[18]的方法進(jìn)行細(xì)胞活性氧檢測(cè)。

1.2.5 GES-1 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后，參考冼健安等[19]的方法進(jìn)行細(xì)胞線粒體膜電位的檢測(cè)。

1.2.6 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞ATP 酶的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好GES-1 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照超微量ATP 酶測(cè)試盒（Na+K+、T-ATP 酶）的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞GSH、SOD、LDH 的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好GES-1 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、超氧化物歧化酶（T-SOD）試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒中的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.8 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞炎癥因子的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好GES-1 細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL 的密度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，按分組加入含不同質(zhì)量濃度檳榔堿（60、90、120、150 μg/mL）的培養(yǎng)基，每孔2 mL，放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照TNF-α、IL-6、TGF-β、VEGF試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以Graphpad 8.0 進(jìn)行圖表處理，統(tǒng)計(jì)方法采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），并做組間比較，不同組別樣本數(shù)n=6，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞的毒性作用

2.1.1 檳榔堿對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞活力影響 不同濃度檳榔堿對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞活力的影響見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比，GES-1 細(xì)胞在經(jīng)過(guò)60 μg/mL的檳榔堿刺激24 h 后，細(xì)胞活力開(kāi)始出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01），是對(duì)照組的82.6%。

圖1 不同檳榔堿濃度刺激GES-1 細(xì)胞活力Fig.1 Cell viability of GES-1 cells stimulated by different arecoline concentrations

而在48 h 的刺激時(shí)間下，檳榔堿濃度為30 μg/mL 時(shí)細(xì)胞活力開(kāi)始出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01），是對(duì)照組的86.2%；隨著檳榔堿濃度的升高，細(xì)胞活力過(guò)低，已普遍降至30%以下，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇24 h作為刺激時(shí)間，并且選擇60～150 μg/mL 檳榔堿濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的作用濃度范圍。

2.1.2 檳榔堿刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞形態(tài)影響 不同濃度檳榔堿刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞形態(tài)影響見(jiàn)圖2?？捎^察到正常生長(zhǎng)的GES-1 細(xì)胞排列有序，細(xì)胞邊界清晰，胞質(zhì)均勻。而隨著檳榔堿濃度的提升，細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，排列出現(xiàn)紊亂；部分細(xì)胞回縮變圓；部分死亡細(xì)胞脫離底部，漂浮在培養(yǎng)液中，同時(shí)也可以觀察到部分細(xì)胞碎片。說(shuō)明檳榔堿對(duì)細(xì)胞具有一定損傷作用，會(huì)引起細(xì)胞損傷甚至死亡脫落。

圖2 不同濃度檳榔堿刺激24 h 對(duì)GES-1 細(xì)胞形態(tài)影響（100×）Fig.2 Effect of different concentrations of arecoline stimulation for 24 h on the shape of GES-1 cells (100×)

2.2 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響

不同濃度檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響見(jiàn)圖3。隨著檳榔堿的濃度的提升，GES-1 細(xì)胞內(nèi)的ROS 水平也隨之升高，具有一定的濃度依賴性。與空白組相比，90 μg/mL 檳榔堿處理后，GES-1 細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度開(kāi)始出現(xiàn)極顯著上升（P＜0.01），約為對(duì)照組的7.4 倍。120 μg/mL 檳榔堿處理后平均熒光強(qiáng)度達(dá)到259.14，150 μg/mL 檳榔堿處理后平均熒光強(qiáng)度達(dá)到262.27，與對(duì)照組相比均有極顯著升高（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，檳榔堿刺激GES-1 細(xì)胞可能會(huì)引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，促使細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成，造成細(xì)胞的氧化損傷。

圖3 不同檳榔堿濃度刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平影響Fig.3 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on intracellular ROS levels in GES-1 cells

2.3 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞線粒體膜電位影響

不同濃度檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞線粒體膜電位影響見(jiàn)圖4。隨著檳榔堿濃度的提升，GES-1 細(xì)胞的線粒體膜電位呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在120 μg/mL 開(kāi)始出現(xiàn)極顯著下降（P＜0.01），當(dāng)檳榔堿濃度為150 μg/mL時(shí)，線粒體膜電位下降至對(duì)照組的10.4%（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，在檳榔堿的處理下，GES-1 細(xì)胞的線粒體發(fā)生去極化導(dǎo)致膜電位失衡，呼吸鏈電子的傳遞過(guò)程出現(xiàn)障礙，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體的功能出現(xiàn)障礙。

圖4 不同檳榔堿濃度刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞線粒體膜電位影響Fig.4 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on the mitochondrial membrane potential of GES-1 cells

2.4 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞ATP 酶影響

不同濃度檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞ATP 酶影響見(jiàn)圖5。隨著檳榔堿濃度的提升，總ATP 酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，其原因可能是因?yàn)闄壚茐A存在雙相劑量效應(yīng)（Hormesis）[20]，即在低濃度檳榔堿刺激下，促使細(xì)胞產(chǎn)生ATP 酶；而Na+K+-ATP 酶的活力則呈現(xiàn)出濃度劑量依賴式下降。在90 μg/mL濃度的檳榔堿處理下，細(xì)胞的總ATP 酶以及Na+K+-ATP 酶活力均出現(xiàn)了極顯著性下降（P＜0.01），分別下降為1.64、1.38 U/mg prot。在150 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，總ATP 酶以及Na+K+-ATP 酶活力進(jìn)一步下降至1.13、1.05 U/mg prot。說(shuō)明檳榔堿的刺激會(huì)降低GES-1 細(xì)胞的ATP 酶活力，可能進(jìn)一步對(duì)線粒體造成損傷，導(dǎo)致能量代謝失衡與ATP 的生成下降。

圖5 不同檳榔堿濃度刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞ATP 酶活力影響Fig.5 Effect of stimulation with different arecoline concentrations on ATPase activity in GES-1 cells

2.5 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞GSH、SOD、LDH 的影響

不同濃度的檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD、LDH 的影響見(jiàn)圖6。在120 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，GES-1 細(xì)胞的GSH 含量為79.6 μmol/g prot，與對(duì)照組相比出現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05）。在90 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，SOD 的酶活力開(kāi)始出現(xiàn)極顯著性降低（P＜0.01），降低到了4.74 U/g prot。在120 μg/mL 濃度的檳榔堿刺激下，LDH 出現(xiàn)極顯著性升高（P＜0.01），說(shuō)明檳榔堿的刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞具有毒性作用，GES-1 細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)遭到了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)氧化損傷。

圖6 不同檳榔堿濃度對(duì)GES-1 細(xì)胞GSH、SOD、LDH 的影響Fig.6 Effect of different arecoline concentrations on GSH,SOD and LDH in GES-1 cells

2.6 檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞炎癥因子的影響

不同濃度的檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的影響見(jiàn)圖7。在不同濃度檳榔堿的刺激下，各炎癥因子均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，在150 μg/mL 檳榔堿的刺激下，與對(duì)照組相比TNF-α含量極顯著上升至82.21 pg/mL（P＜0.01），IL-6 含量上升至6.95 pg/mL（P＜0.01），VEGF 含量上升至2145.41 pg/mL（P＜0.01），TGF-β含量上升至43.02 pg/mL（P＜0.01）。說(shuō)明檳榔堿能夠提高細(xì)胞內(nèi)促炎因子與促纖維化因子水平，破壞胃黏膜正常的保護(hù)功能，進(jìn)一步誘發(fā)胃黏膜的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

圖7 不同濃度檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞炎癥因子的影響Fig.7 Effect of different concentrations of arecoline on inflammatory factors in GES-1 cells

3 討論與結(jié)論

GES-1 細(xì)胞是人胃黏膜中正常的胃黏膜上皮細(xì)胞，是研究胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃炎、幽門螺旋桿菌感染、胃癌等疾病的重要細(xì)胞模型系統(tǒng)[21]。有研究表明，檳榔堿在經(jīng)過(guò)人體消化系統(tǒng)時(shí)會(huì)對(duì)消化系統(tǒng)造成損傷，其中包括胃部黏膜的損傷[15]。Kong 等[22]的體外模擬消化研究表明，攝入121.22 μg/mL 的檳榔堿1 h 后，在胃部消化階段仍能檢測(cè)到72.41 μg/mL的檳榔堿殘留，有可能對(duì)胃部造成損傷。因此本研究利用檳榔堿刺激GES-1 細(xì)胞，探究檳榔堿對(duì)人胃黏膜的毒性作用，結(jié)果顯示：60 μg/mL 檳榔堿刺激GES-1 細(xì)胞24 h 后細(xì)胞活力開(kāi)始出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01）；30 μg/mL 檳榔堿刺激GES-1 細(xì)胞48 h 后細(xì)胞活力開(kāi)始出現(xiàn)極顯著降低（P＜0.01）。此外，不同濃度檳榔堿刺激后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，檳榔堿濃度越高，細(xì)胞形態(tài)變化程度越大。檳榔堿刺激降低了細(xì)胞內(nèi) SOD 與 GSH 的活力，促進(jìn) LDH 與 ROS 的含量升高，引發(fā)細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)積蓄的ROS攻擊線粒體，進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體膜電位失衡與功能障礙，ATP 酶活力降低，細(xì)胞供能受損，促炎因子與促纖維化因子水平升高，最終對(duì)GES-1 細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

細(xì)胞在氧化脅迫中會(huì)誘導(dǎo)線粒體功能出現(xiàn)障礙，產(chǎn)生大量的自由基，破壞細(xì)胞內(nèi)的平衡狀態(tài)，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡。其中ROS 是機(jī)體正常代謝的產(chǎn)物，能參與到多種信號(hào)通路中，激活細(xì)胞信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死等[8]。有研究表明檳榔堿可以提升細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平，引發(fā)氧化應(yīng)激，打破細(xì)胞內(nèi)的平衡環(huán)境，誘導(dǎo)線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致病變甚至癌變[23-24]。Hung等[25]證明了檳榔提取物誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的ROS 水平上升，并且進(jìn)一步通過(guò)MAPK（JNK 和p38）通路上調(diào)HO-1 的表達(dá)，引發(fā)氧化應(yīng)激。同樣Ji 等[26]研究表明檳榔堿能誘導(dǎo)口腔鱗狀細(xì)胞中ROS 上升，引起DNA 損傷，導(dǎo)致DNA 復(fù)制錯(cuò)誤。本研究中，在90 μg/mL 檳榔堿處理下ROS 呈現(xiàn)出極顯著性升高（P＜0.01），表明檳榔堿刺激導(dǎo)致GES-1 細(xì)胞產(chǎn)生大量活性氧，對(duì)細(xì)胞造成損害。

細(xì)胞內(nèi)自由基的清除需要依靠抗氧化酶，其中GSH 在機(jī)體內(nèi)可以維護(hù)正常的免疫系統(tǒng)功能，可以幫助機(jī)體清除自由基，保護(hù)機(jī)體內(nèi)多種酶不被氧化并且正常地發(fā)揮其生理功能，具有抗氧化、解毒的功效，可以作為細(xì)胞內(nèi)衡量抗氧化能力的關(guān)鍵指標(biāo)[27]；SOD 是一種抗氧化金屬酶，能夠清除細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子，參與細(xì)胞內(nèi)的抗氧化進(jìn)程并起關(guān)鍵作用，SOD活力可以反映組織內(nèi)細(xì)胞的氧化受損情況[28]；LDH穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)部，當(dāng)細(xì)胞受損傷后能迅速釋放到細(xì)胞外，因此，細(xì)胞外液中的LDH 活性是衡量細(xì)胞發(fā)生應(yīng)激損傷的指標(biāo)物[28]。有研究表明，小鼠膠質(zhì)細(xì)胞中GSH 的耗竭引起的過(guò)氧化導(dǎo)致細(xì)胞壞死[29]；Run等[30]發(fā)現(xiàn)檳榔堿能夠抑制細(xì)胞內(nèi)SOD 的酶活性，進(jìn)一步破壞氧化應(yīng)激抗氧化酶系統(tǒng)。在本研究中，隨著檳榔堿濃度的升高，GSH、SOD 活力出現(xiàn)下降，LDH含量升高，說(shuō)明檳榔堿的刺激對(duì)GES-1 細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)造成了破壞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基積蓄，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

線粒體膜電位是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子以及其他離子的濃度不對(duì)稱分布而形成的，對(duì)穩(wěn)定細(xì)胞的正常生理功能有重要作用[19]。ATP 作為機(jī)體內(nèi)重要的能量產(chǎn)物，能夠維系生物功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，ATP 酶廣泛分布在細(xì)胞的生物膜系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)保護(hù)細(xì)胞的正常生理功能具有重要意義。線粒體受到氧化劑的攻擊后，線粒體膜電位的失衡會(huì)導(dǎo)致能量異常代謝，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期的失調(diào)、細(xì)胞壞死[31]以及細(xì)胞凋亡[32]等。已有研究表明過(guò)氧化氫處理人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位顯著下降，誘導(dǎo)HUVECs 發(fā)生程序性壞死[33]；香煙煙霧提取物會(huì)導(dǎo)致人肺上皮細(xì)胞（BEAS-2B）ATP 酶水平明顯下降，進(jìn)一步誘導(dǎo)BEAS-2B 發(fā)生程序性壞死[34]；H2S 通過(guò)下調(diào)ATP 酶的活性引起能量代謝紊亂，誘導(dǎo)雞的脾臟細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[35]。在本研究中，60～150 μg/mL 的檳榔堿處理組線粒體膜電位以及ATP 酶活力出現(xiàn)下降，能夠說(shuō)明氧化應(yīng)激進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體功能破壞，正常的膜電位失衡引起能量代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)損傷。

TNF-α作為多肽類細(xì)胞因子具有多種生物功能，參與細(xì)胞的增殖與分化、侵襲與轉(zhuǎn)移、細(xì)胞凋亡、機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)和炎癥反應(yīng)[36]。IL-6 是典型的細(xì)胞炎癥因子，在炎癥與腫瘤的形成中有著重要作用[37]。TGF-β是一種具有多種生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，與細(xì)胞的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[38-39]。有研究表明，檳榔堿能夠促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)與釋放[40-41]，Jeng 等[42]發(fā)現(xiàn)檳榔提取物能夠促進(jìn)TNF-α和IL-6 的產(chǎn)生，引發(fā)口腔癌。Li 等[43]認(rèn)為在成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中，檳榔提取物或檳榔堿誘導(dǎo)腫瘤促進(jìn)介質(zhì)或致癌信號(hào)通路，包括IL-6、TGF-β[44]。此外，檳榔提取物能夠引發(fā)口腔癌細(xì)胞中VEGF 的表達(dá)，具有促進(jìn)癌癥轉(zhuǎn)移的潛在作用[43]。檳榔堿可能通過(guò)多種分子調(diào)節(jié)因子促進(jìn)細(xì)胞炎癥，最終引發(fā)細(xì)胞死亡。這與本研究結(jié)果一致，隨檳榔堿濃度的升高，促炎因子與促纖維化因子均出現(xiàn)上升趨勢(shì)，導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)損傷部位炎癥的轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致GES-1 細(xì)胞的毒性損傷。

細(xì)胞的死亡方式多種多樣，大致可以分為程序性與非程序性死亡，程序性死亡的方式主要為程序性壞死、細(xì)胞凋亡、焦亡、鐵死亡和自噬等。其中程序性壞死具有一些特征：細(xì)胞膜在外界的刺激下被破壞，產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致線粒體的膜電位喪失，發(fā)生線粒體功能障礙與能量失衡[45]。很多研究表明ROS的產(chǎn)生是引發(fā)程序性壞死的關(guān)鍵因子[46]，此外線粒體膜電位在程序性壞死中起到關(guān)鍵作用，線粒體膜電位失衡導(dǎo)致能量供應(yīng)失調(diào)，最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生程序性壞死[33-35]。目前對(duì)于檳榔堿導(dǎo)致細(xì)胞毒性的機(jī)制研究仍不明確，根據(jù)本研究結(jié)果顯示，線粒體膜電位以及ATP 酶活力隨檳榔堿的濃度提升而降低，引發(fā)線粒體功能障礙，推測(cè)檳榔堿可能引發(fā)GES-1 細(xì)胞程序性壞死發(fā)揮毒性作用。

綜上所述，檳榔堿引發(fā)氧化應(yīng)激失衡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的ROS 積蓄，進(jìn)而導(dǎo)致線粒體功能障礙，細(xì)胞供能受損，最終引發(fā)GES-1 細(xì)胞死亡。對(duì)GES-1 細(xì)胞毒性作用的潛在機(jī)制可能是氧化應(yīng)激導(dǎo)致的線粒體功能障礙，誘發(fā)炎癥因子的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致GES-1 程序性壞死，但有待進(jìn)一步研究確定。本研究發(fā)現(xiàn)檳榔堿對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞具有損傷作用，并為檳榔堿對(duì)GES-1 細(xì)胞的損傷模型的建立提供了實(shí)驗(yàn)劑量的參考依據(jù)，研究結(jié)果提示食用檳榔可能會(huì)導(dǎo)致胃部損傷，因此建議人們應(yīng)減少檳榔的食用以保護(hù)自身消化系統(tǒng)的健康。

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