王佩欣,盧菲艷,張 露,周雯娜,彭春彥,陳明舜 ,涂宗財(cái),3
(1.江西師范大學(xué)健康學(xué)院,江西南昌 330022;2.江西師范大學(xué)國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)專業(yè)中心,生命科學(xué)學(xué)院,江西南昌 330022;3.南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西南昌 330047)
藥用覆盆子(Rubus chingiiHu)是薔薇科懸鉤子屬華東覆盆子的未成熟干燥果實(shí),因葉裂如掌又稱掌葉覆盆子。全世界大約有750 余種藥用覆盆子,大多數(shù)種植于北半球溫帶,少數(shù)種植于熱帶,藥用覆盆子在我國主要分布于江蘇、浙江、安徽、福建、江西、廣西等地[1-2]。近十年來,許多國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn),藥用覆盆子中含有酚酸、黃酮、單寧、多糖、生物堿、萜類及甾體等多種活性成分,其中水解單寧、酚酸、黃酮等酚類物質(zhì)為其主要活性成分[3-4]。藥理研究表明,覆盆子具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌、抗衰老、改善學(xué)習(xí)能力、調(diào)節(jié)性激素水平等作用[5-6]。
然而,受品種、地理位置和生長條件的影響,植物營養(yǎng)成分組成和活性可能存在較大差異。平嘉倩等[7]研究發(fā)現(xiàn)不同品種和產(chǎn)地的覆盆子總糖、糖酸比、VC和氨基酸含量差異顯著,江西覆盆子的果糖含量、糖酸比最高,福建的最低,但福建覆盆子卻含有較高的氨基酸和礦質(zhì)元素。付彩群等[8]研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地、采收期是造成藥用覆盆子酚類化合物含量差異的主要原因,浙江產(chǎn)地覆盆子中鞣花酸含量明顯高于江西,而向陽與背陽對(duì)覆盆子活性成分含量的影響較小。Park 等[9]的研究發(fā)現(xiàn)Gokseong 的覆盆子具有最高的多酚含量,Jeongeup 的覆盆子具有最高的黃酮含量,Gochang、Sunchang、Jeongeup 和Jinan等地覆盆子中花色苷的含量要略多于Gokseong 和Hoengseong。然而,很少有研究集中在來自不同產(chǎn)地的覆盆子酚類物質(zhì)組成及活性的差異。
綜上,產(chǎn)地不同會(huì)導(dǎo)致覆盆子中活性成分含量差異顯著,但國內(nèi)外對(duì)覆盆子的研究主要集中在活性成分分離鑒定及種質(zhì)資源的評(píng)價(jià)和利用方面,而關(guān)于產(chǎn)地對(duì)覆盆子酚類物質(zhì)及活性影響的研究較少。本文采用40%乙醇提取廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個(gè)不同產(chǎn)地覆盆子酚類物質(zhì),評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地覆盆子提取物中總酚、總黃酮和總水解單寧的含量以及酚類物質(zhì)的組成,并對(duì)比不同產(chǎn)地覆盆子體外抗糖尿病活性,以期獲得較優(yōu)品質(zhì)的覆盆子,為后續(xù)覆盆子的深度加工提供借鑒,促進(jìn)覆盆子資源的高值化利用。
覆盆子 2022 年5 月于廣東、廣西、安徽、浙江、江西和四川六個(gè)產(chǎn)地采集,江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院袁濤教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬,曬干后-4 ℃保存?zhèn)溆茫粺o水乙醇 天津永大化學(xué)試劑有限公司;牛血清白蛋白、葡萄糖、沒食子酸、槲皮素、維生素C(VC)標(biāo)準(zhǔn)品、三氯化鋁、碳酸鈉、碘酸鉀、福林酚 北京索萊寶科技有限公司;α-葡萄糖苷酶(100 U)、對(duì)硝基苯基-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)、阿卡波糖、2,2'-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)美國Sigma 公司;甲酸、乙腈 色譜純,阿拉?。凰袑?shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水。
KH-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國IKA有限公司;Synergy H1 型酶標(biāo)儀 美國Biotek 儀器有限公司;F-7000 型熒光分光光度計(jì) 日本日立有限公司;ESJ200-4 型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司;5430R 型離心機(jī) 艾本德中國有限公司;Triple TOF 5600+液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 AB SCIEX 儀器有限公司。
1.2.1 覆盆子提取物的制備 參照前期優(yōu)化的方法提取覆盆子中的酚類物質(zhì)[5],將六個(gè)產(chǎn)地的藥用覆盆子粉碎成粉末后,按1:10 的料液比(g/mL)加入40%乙醇,混勻后于KH-500DE 數(shù)控超聲波清洗器中400 W,50 ℃超聲提取1 h,抽濾,收集上清液,殘?jiān)僭谙嗤瑮l件下提取一次,合并所有上清液,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥至粉末狀,制得覆盆子提取物樣品,于4 ℃冷藏備用。
1.2.2 總酚含量的測(cè)定 參照文獻(xiàn)步驟,采用福林酚法檢測(cè)樣品的總酚含量[10]。取200 μL 0.25 mg/mL樣品與0.1 mL 福林酚試劑于試管中室溫反應(yīng)5 min,加入0.3 mL 20%的碳酸鈉溶液和1.0 mL 雙蒸水,避光反應(yīng)25 min 后,采用酶標(biāo)儀測(cè)定反應(yīng)體系在765 nm 處的吸光值??瞻捉M以雙蒸水代替碳酸鈉溶液,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量(μg GAE/mg E)表示。
1.2.3 總黃酮含量的測(cè)定 采用三氯化鋁比色法測(cè)定樣品中總黃酮的含量[11]。取100 μL 1.0 mg/mL 的樣品與100 μL 10%三氯化鋁于酶標(biāo)板中混勻,室溫反應(yīng)15 min 后,采用Synergy H1 酶標(biāo)儀測(cè)反應(yīng)體系在430 nm 處的吸光值。乙醇代替三氯化鋁溶液的反應(yīng)體系為空白組,以槲皮素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以槲皮素當(dāng)量(μg QUE/mg E)表示。
1.2.4 總水解單寧含量的測(cè)定 采用碘酸鉀法測(cè)定樣品中水解單寧的含量[10]。取100 μL 1.0 mg/mL 樣品與150 μL 5%碘酸鉀溶液于酶標(biāo)板中混勻,室溫反應(yīng)15 min 后,測(cè)其在550 nm 的吸光值。以乙醇代替碘酸鉀溶液的反應(yīng)體系為空白組,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示(mg GAE/g E)。
1.2.5 不同產(chǎn)地覆盆子提取物HPLC-MS/MS 分析將不同產(chǎn)地覆盆子提取物粉末溶解在甲醇中,配制成2 mg/mL 的溶液,經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾后采用AB Exion LC 高效液相色譜-TripleTOF 5600+高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(AB Sciex)測(cè)定提取物中酚類物質(zhì)。利用PeakView 對(duì)樣品進(jìn)行MS/MS 數(shù)據(jù)分析,通過將獲得的數(shù)據(jù)與參考文獻(xiàn)和Scifinder、Metlin 數(shù)據(jù)庫中記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配,對(duì)化合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步鑒定,并通過峰面積對(duì)化合物進(jìn)行定量分析。
高效液相色譜參數(shù):色譜柱為SHIM-PACK GIST C18(75 mm×2.1 mm);流動(dòng)相A 為0.1%甲酸水溶液,流動(dòng)相B 為乙腈溶液;梯度洗脫程序條件為0~6 min 4% B,6~32 min 4%~16.5% B,32~45 min 16.5% B;檢測(cè)波長為254 nm;柱溫為35 ℃;流速為0.3 mL/min;進(jìn)樣量為5 μL。
質(zhì)譜參數(shù):電噴霧離子源為負(fù)離子模式,550 ℃ESI 離子源;質(zhì)量掃描范圍為50~2000 Da,離子源霧化氣為50 psi,離子源加熱輔助氣為35 psi;一級(jí)質(zhì)譜去簇電壓為-80 V,碰撞能為-10 eV;二級(jí)質(zhì)譜去簇電壓為-80 V,CE 為-40±20 eV。
1.2.6 自由基清除能力測(cè)定 采用DPPH 和ABTS法比較樣品的自由基清除能力[11]。取50 μL 適宜濃度的樣品與150 μL 新鮮配制的DPPH·溶液(0.15 mmol/L)或ABTS+·溶液于酶標(biāo)板中混勻并進(jìn)行稀釋,室溫避光孵育30 min(DPPH·溶液)或6 min(ABTS+·溶液)后,分別于517 nm 和734 nm 處測(cè)定吸光值。乙醇代替自由基溶液的反應(yīng)體系為樣品空白組,以VC作陽性對(duì)照。采用Origin 2018 計(jì)算樣品清除DPPH 和ABTS+自由基半抑制濃度,結(jié)果用IC50值(μg/mL)表示。
1.2.7α-葡萄糖苷酶抑制能力測(cè)定 參考Tan 等[5]方法測(cè)定樣品的α-葡萄糖苷酶抑制能力。取50 μL 適宜濃度樣品與100 μL 0.1 U/mLα-葡萄糖苷酶于酶標(biāo)板中倍稀,室溫反應(yīng)6 min 后加入50 μL 5.0 mmol/L pNPG 反應(yīng)10 min,最后加入100 μL 0.2 mol/L 碳酸鈉終止反應(yīng),并于405 nm 處測(cè)定吸光值(Ai),以不加酶和樣品的反應(yīng)體系為空白組(Aj),不加樣品的反應(yīng)體系為控制組(Ac),阿卡波糖為陽性對(duì)照。按照公式(1)計(jì)算樣品中α-葡萄糖苷酶抑制能力,結(jié)果用IC50值(mg/mL)表示。
1.2.8 晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)抑制能力測(cè)定采用牛血清白蛋白(BSA)-葡萄糖反應(yīng)體系評(píng)價(jià)樣品抑制AGEs 形成能力[12]。將200 μL 提取物(1 mg/mL)與1.0 mL BSA(20 mg/mL)、1.0 mL 葡萄糖溶液(500 mmol/L)于10 mL 棕色帶蓋玻璃瓶中混勻,恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃孵育4 周后取出,冰水浴終止反應(yīng)。最后用0.1 mol/L pH7.4 的磷酸鹽緩沖溶液稀釋10 倍后,采用F-7000 熒光分光光度計(jì)測(cè)定稀釋液在激發(fā)波長340 nm,發(fā)射波長420 nm 處的熒光值。以氨基胍為陽性對(duì)照,按照公式(2)計(jì)算樣品對(duì)AGEs 的抑制率。
式中:FIs表示含有樣品、蛋白和糖的反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度;FIc表示不含樣品的反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度;FIb表示不含樣品和蛋白的反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度;FInb表示不含蛋白的反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度。
所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,采用SPSS 13.0 中的單因素方差分析和t-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05 認(rèn)為具有顯著性差異,所有圖形用Origin 8.0 繪制。
六個(gè)產(chǎn)地藥用覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量如表1 所示。廣東和安徽產(chǎn)的覆盆子提取物中的總酚含量最高,為349.77 和345.16 μg GAE/mg E,廣西和四川覆盆子提取物的總酚含量最低,為294.47 和285.16 μg GAE/mg E,且兩者之間不存在顯著性差異(P>0.05)。浙江覆盆子提取物中的總黃酮含量最高,達(dá)202.55 μg QUE/mg E,其次為廣西、江西和廣東覆盆子提取物,含量為156.92~153.51 μg QUE/mg E,且三者之間不存在顯著性差異(P>0.05),四川覆盆子提取物的總黃酮含量最低,僅112.77 μg QUE/mg E。四川覆盆子提取物中的可水解單寧含量最高,為125.07 mg GAE/g E,其次為廣西和浙江覆盆子提取物,廣東和安徽覆盆子提取物中的水解單寧含量最低,為62.07 mg GAE/g E 和64.87 mg GAE/g E,且兩者之間不存在顯著性差異(P>0.05)。
表1 六個(gè)產(chǎn)地覆盆子提取物的總酚、水解單寧、總黃酮含量Table 1 Total phenols,hydrolyzed tannins and total flavonoids content of raspberry extracts from six producing areas
為了比較六個(gè)產(chǎn)地覆盆子之間的差異,本文檢測(cè)了六個(gè)產(chǎn)地覆盆子提取物中酚類物質(zhì),色譜圖如圖1 所示。從覆盆子提取物鑒定出34 個(gè)酚類化合物,主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質(zhì)(表2)。
圖1 六個(gè)產(chǎn)地覆盆子提取物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of raspberry extracts from six producing areas
表2 六個(gè)產(chǎn)地覆盆子提取物的定性定量分析Table 2 Qualitative and quantitative analysis of raspberry extracts from six producing areas
鞣花單寧是懸鉤子屬植物中的一類主要活性成分。通過對(duì)比母離子、離子碎片可以推斷化合物的初步結(jié)構(gòu)。鞣花單寧在負(fù)離子模式下的特征碎片離子包括:沒食子酰基(m/z 151),hexahydroxydiphenoyl(HHDP)基團(tuán)(m/z 301),HHDP-葡萄糖部分(m/z 463、301 和161)和沒食子酰葡萄糖基(m/z 331)。六個(gè)產(chǎn)地都含有豐富的鞣花單寧,共鑒定出12 種鞣花單寧,主要包括鞣花酸、木麻黃鞣寧、花梗鞣素、galloyl-HHDP-glucose、鞣花酸己糖醛酸等,其中四川產(chǎn)地含量占比最高,占其總酚類化合物的56%。盧遇[13]通過HPLC-QTOF-MS/MS 技術(shù)從覆盆子中鑒定了26 個(gè)酚類物質(zhì)成分,其中鞣花單寧是覆盆子中主要活性成分,這與本文結(jié)果相一致。
黃酮類化合物也是覆盆子中的主要酚類物質(zhì),共鑒定出19 種黃酮類化合物,主要以黃酮苷形式存在。包括原花青素二聚體、表兒茶素、報(bào)春黃甙、柚皮素己糖苷、蘆丁、槲皮素-3-O-半乳糖苷、異葒草素阿拉伯糖苷、山奈酚-3-O-洋槐糖苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷、芹菜素鼠李糖苷等。除了四川產(chǎn)地,其他五個(gè)產(chǎn)地的黃酮類化合物含量的都相對(duì)較高,占其總酚類化合物的38%以上。其中浙江產(chǎn)地的含量最高,達(dá)55%左右。覆盆子中酚酸含量較少,共鑒定出3 種酚酸,分別為白屈菜酸、沒食子酸和短葉蘇木酚酸。
活性氧自由基(ROS)是人體的正常代謝物,但是過多的ROS 在體內(nèi)積累會(huì)造成器官的氧化損傷,從而誘發(fā)各種慢性疾病,如炎癥、癌癥、糖尿病、高血壓等[14]。膳食中的多酚、黃酮類物質(zhì)都是良好的天然自由基清除劑[15]。常用的體外自由基清除能力評(píng)價(jià)方法包括測(cè)定O2-·、·OH、DPPH·、ABTS+·等,本研究采用最常用的DPPH 和ABTS 法探究了不同產(chǎn)地覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力[16-17]。六個(gè)產(chǎn)地藥用覆盆子提取物對(duì)DPPH·和ABTS+·清除能力如圖2 所示,IC50值越小,表示達(dá)到半數(shù)清除率時(shí)所需濃度越小,自由基清除能力越強(qiáng),該產(chǎn)地覆盆子自由基清除能力越強(qiáng)。和陽性對(duì)照VC相比,不同產(chǎn)地覆盆子DPPH·和ABTS+·清除能力差異較大,四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力最強(qiáng),IC50值分別為63.069 和29.977 μg/mL,廣東、廣西、安徽和浙江覆盆子提取物的DPPH·清除能力相差較小,江西覆盆子提取物的DPPH·和ABTS+·清除能力最弱,IC50值分別為109.750 和52.230 μg/mL。張露等[10]研究發(fā)現(xiàn)江西德興所產(chǎn)覆盆子醇溶多酚提取物的DPPH·的IC50值約為80 μg/mL,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。吳峰華等[18]報(bào)道表明浙江覆盆子醇溶提取物的DPPH·的IC50值約為0.177±0.0078 mg/mL,與本實(shí)驗(yàn)不盡相同,也許是由于采摘的時(shí)間不同。
Mansouri 等[19]證明懸鉤子果實(shí)的自由基清除能力可能與其酚類、黃酮類、單寧和花青素含量有關(guān),Muniyandi 等[20]證明覆盆子的自由基清除能力與其所含酚類、黃酮類、單寧類化合物含量相關(guān),曾小艷等[21]、謝欣梅等[22-23]證明原花青素、覆盆子酮、覆盆子提取物可以有效降低大鼠血糖,因此產(chǎn)地的不同影響了覆盆子中酚類、黃酮類、單寧類等化合物的含量,進(jìn)而導(dǎo)致覆盆子間自由基清除能力的差異。覆盆子活性功能由其含有的活性成分決定,已有研究發(fā)現(xiàn)藥用覆盆子中的主要活性物質(zhì)為水解單寧[13],四川產(chǎn)地覆盆子提取物中水解單寧含量最高,這可能是四川產(chǎn)地覆盆子提取物具有最高自由基清除能力的原因。
II 型糖尿病的產(chǎn)生被認(rèn)為與促胰島素分泌和影響胰島素敏感性的關(guān)鍵酶有關(guān),如α-葡萄糖苷酶、蛋白酪氨酸磷酸酶、AGEs 等[24-25]。α-葡萄糖苷酶可以水解多糖中的α-(1→4)-糖苷鍵,釋放葡萄糖,而α-葡萄糖苷酶抑制劑則能抑制其活性,從而使機(jī)體葡萄糖釋放速率下降,有效地降低血糖濃度[13]。不同產(chǎn)地藥用覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶抑制能力如圖3A所示。和陽性對(duì)照阿卡波糖(IC50=1.547 mg/mL)相比,六個(gè)產(chǎn)地覆盆子對(duì)α-葡萄糖苷酶均具有較強(qiáng)的抑制作用。四川和安徽覆盆子對(duì)α-葡萄糖苷酶具有最強(qiáng)抑制效果,IC50值分別為0.086 和0.109 mg/mL。廣東、廣西和浙江覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力次之,IC50達(dá)0.125~0.142 mg/mL。江西覆盆子的α-葡萄糖苷酶抑制能力最弱,IC50值為0.182 mg/mL。Chen 等[26]發(fā)現(xiàn)河北產(chǎn)地的覆盆子提取物具有很好的α-葡萄糖苷酶的抑制能力,是降糖藥阿卡波糖的9 倍,與本文報(bào)道的江西覆盆子類似(8.5 倍)。該結(jié)果為覆盆子作為α-葡萄糖苷酶抑制劑資源和降血糖功能食品的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù),但其具體降血糖成分和作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。
圖3 六個(gè)產(chǎn)地覆盆子提取物的α-葡萄糖苷酶(A)和AGEs(B)抑制能力Fig.3 Inhibition capacities on α-glucosidase (A) and AGEs (B)of raspberry extracts from six producing areas
AGEs 是由還原糖及其衍生物(如甘油醛,乙醇醛,甲基乙二醛和乙醛)與蛋白質(zhì)或脂質(zhì)發(fā)生非酶糖基化生成的終末期產(chǎn)物,機(jī)體內(nèi)AGEs 的積累會(huì)與蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián),引發(fā)糖尿病的一系列并發(fā)癥,延緩衰老和緩解糖尿病并發(fā)癥的有效方法之一便是抑制AGEs 的累積[27]。本研究以不同產(chǎn)地覆盆子對(duì)AGEs的抑制活性作為其抑制糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)。以抑制AGEs 生成為指標(biāo),對(duì)不同產(chǎn)地的覆盆子提取物進(jìn)行抑制糖基化活性檢測(cè),結(jié)果如圖3B 所示,不同產(chǎn)地藥用覆盆子提取物對(duì)AGEs 的形成具有很強(qiáng)的抑制效果,當(dāng)提取物為1 mg/mL 時(shí),其對(duì)AGEs 形成的抑制率達(dá)到了73.92%~81.91%。安徽覆盆子的AGEs 抑制率最高,達(dá)到81.91%,與陽性對(duì)照氨基胍無顯著差異(P>0.05)。廣東和廣西覆盆子的AGEs 抑制率次之(78.54%~78.85%),江西、四川和浙江覆盆子的AGEs 抑制率最低(74.94%~73.92%)。
不同產(chǎn)地覆盆子間總酚、總黃酮和總水解單寧含量存在差異,其中廣東和安徽覆盆子提取物總酚含量最高,廣西和四川產(chǎn)地的最低;浙江覆盆子提取物總黃酮含量最高,廣西、江西和廣東產(chǎn)地次之,四川產(chǎn)地的最低;四川覆盆子提取物總水解單寧含量最高,廣西和浙江產(chǎn)地次之,廣東和安徽產(chǎn)地的最低。從六個(gè)產(chǎn)地的覆盆子提取物中鑒定出34 種酚類物質(zhì),主要是鞣花單寧、黃酮和酚酸類物質(zhì),四川覆盆子提取物含有最豐富的鞣花單寧。不同產(chǎn)地覆盆子提取物都具有一定自由基清除能力、α-葡萄糖苷酶抑制活性以及AGEs 抑制能力,其中四川覆盆子的DPPH·和ABTS+·清除能力和α-葡萄糖苷酶抑制活性遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地,而安徽覆盆子提取物的AGEs抑制能力略高于其他產(chǎn)地。本文僅對(duì)部分產(chǎn)地覆盆子酚類物質(zhì)及其抗糖尿病活性進(jìn)行了初步研究,對(duì)于不同產(chǎn)地體內(nèi)抗糖尿病活性及機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。
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