彭旭陽(yáng)，陳君然，崔瀚元 ，胡立武，張子迪，朱星宇，陳存坤

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工與技術(shù)研究所，天津 300000；3.新疆優(yōu)產(chǎn)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司，新疆和田 848300；4.天津天獅學(xué)院，天津 301700）

肉蓯蓉（Cistanche deserticolaY.C.Ma.）列當(dāng)科屬高大草本植物，主要分布于中國(guó)的內(nèi)蒙古阿拉善、新疆和田、寧夏和甘肅昌馬等干燥地區(qū)[1]。肉蓯蓉是稀有而珍貴中藥材，有補(bǔ)腎陽(yáng)，益精血，潤(rùn)腸通便，大補(bǔ)壯陽(yáng)等功能，被譽(yù)為“沙漠人參”[2]。2018 年肉蓯蓉被收錄于“藥食兩用”目錄[3]，現(xiàn)代藥理學(xué)證明其富含多種生物活性物質(zhì)，具有包括抗氧化、抗衰老、緩解疲勞、增強(qiáng)記憶力、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防骨質(zhì)疏松等功效[4-5]。肉蓯蓉是一種全寄生植物根部，寄主有梭梭樹和紅柳灌木林，品質(zhì)差異較大，‘紅柳’肉蓯蓉莖深，質(zhì)地柔軟表面光滑，橫切面為暗紅色，味略苦?！笏蟆馍惾乜购敌阅茌^好，橫截面有不規(guī)則紋路，味甘甜[6-7]。

目前對(duì)肉蓯蓉的研究重點(diǎn)主要集中在種植技術(shù)[8]、抗氧化活性[9]、生物活性成分[10]等方面。然而，伴隨市場(chǎng)需求的不斷增加，肉蓯蓉產(chǎn)品的質(zhì)量參差不齊，甚至存在偽造現(xiàn)象，這給監(jiān)管部門帶來(lái)了極大的挑戰(zhàn)。目前，鑒別不同肉蓯蓉藥材仍然面臨相當(dāng)大的困難，因此需要一種高效、快速、直觀的分析鑒別方法來(lái)解決這一問題。

氣味掃描儀（電子鼻）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）是目前分析揮發(fā)性物質(zhì)常用的技術(shù)手段，但是在分析過(guò)程中需要對(duì)原材料進(jìn)行加熱、蒸餾、萃取等操作，過(guò)程繁瑣，且過(guò)長(zhǎng)的分析時(shí)間和過(guò)高的進(jìn)樣溫度容易造成不穩(wěn)定揮發(fā)性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變[11-14]。氣相離子遷移色譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy，GC-IMS）是一門新興揮發(fā)性物質(zhì)分析技術(shù)，其具有分離高效、操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、維護(hù)成本低等優(yōu)勢(shì)。GC-IMS 通過(guò)頂空進(jìn)樣分析樣品的特征成分，最大程度保留樣品的氣味，并通過(guò)譜圖中的信號(hào)積分實(shí)現(xiàn)風(fēng)味物質(zhì)的可視化，該方法具有直觀穩(wěn)定、操作便捷等優(yōu)勢(shì)。近年來(lái)被廣泛用于中藥[15-17]、果蔬[18-20]、調(diào)味品[14,21]、酒產(chǎn)品[22-24]、添加劑[25]、香精香料[26-28]等方面。而在中藥材料鑒別領(lǐng)域，郭鳳柳等[29]通過(guò)GC-IMS 對(duì)川貝母以及其他貝母進(jìn)行了鑒別，為川貝母的快速鑒別提供全新思路及技術(shù)支持。嚴(yán)愛娟等[30]通過(guò)GC-IMS 技術(shù)分析，比較了覆盆子和可能混淆的山莓之間揮發(fā)性特異氣味成分的差異，為覆盆子和山莓的鑒別提供了新的方法和手段。而對(duì)肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分相關(guān)研究較少?；诖?，本研究采用GC-IMS 對(duì)‘梭梭’和‘紅柳’寄主肉蓯蓉的揮發(fā)性成分進(jìn)行了分析，探討兩種不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分間的差異，將為新疆肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分分析及品種鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肉蓯蓉 新疆和田地區(qū)策勒縣的‘紅柳’肉蓯蓉（寄生在紅柳植物根部）和‘梭梭’肉蓯蓉（寄生藜科植物梭梭的根部），挑選外表無(wú)損傷、新鮮的肉蓯蓉用于分析（圖1）；外標(biāo)物正構(gòu)酮C4～C9 山東海能科學(xué)儀器有限公司。

圖1 新疆不同寄主肉蓯蓉外觀及切面圖Fig.1 Appearance and section of different hosts of Cistanche deserticola in Xinjiang

FA1004 電子天平 上海天平儀器廠；Flavour-Spec?氣相-離子遷移譜儀 配備MXT-5 色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm），德國(guó)G.A.S 公司；20 mL頂空瓶 上海希言科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 將兩種肉蓯蓉洗凈，去除表皮并切碎成丁，用天平準(zhǔn)確稱取0.6 g，分別放入20 mL 頂空瓶中，60 ℃孵化20 min 后進(jìn)樣，每個(gè)樣品進(jìn)行3 次平行測(cè)定。

1.2.2 GC-IMS 分析 參考Zhou 等[31]的方法，并略有修改。

進(jìn)樣條件：頂空進(jìn)樣針溫度85 ℃；進(jìn)樣體積300 μL；孵化轉(zhuǎn)速500 r/min。

GC條件：色譜柱：MXT-5（15 m×0.53 mm，1.0 μm）；色譜柱溫60 ℃；分析時(shí)間20 min。

IMS 條件：IMS 溫度45 ℃，漂移氣流量75 mL/min；高純氮?dú)釴2（純度≥99.999%）作為漂移載氣。載氣流速：初始流速為2 mL/min，保持2 min 不變，2～10 min 之間逐漸增加至10 mL/min，10～20 min 內(nèi)逐漸增加至100 mL/min。

保留指數(shù)計(jì)算公式：

式中，t 為保留時(shí)間；Z 和Z+1 分別為目標(biāo)化合物（X）流出前后的正構(gòu)酮所含碳原子的數(shù)目。

1.3 數(shù)據(jù)處理

GC-IMS 儀器自帶LAV（laboratory analytical viewer）分析軟件，采用正構(gòu)酮C4～C9 作為外標(biāo)來(lái)計(jì)算揮發(fā)性物質(zhì)的保留指數(shù)，并根據(jù)保留指數(shù)和相對(duì)遷移時(shí)間，與NIST 氣相數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS 離子遷移譜數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定性分析。使用插件Gallery Plot 構(gòu)建指紋圖譜、利用Reporter 繪制二維差異譜圖、Dynamic PCA 進(jìn)行主成分分析，根據(jù)揮發(fā)性物質(zhì)峰體積使用Origin 2023 繪制聚類熱圖；香氣特征來(lái)自好香味公司（The Good Scents Company）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同寄主肉蓯蓉中揮發(fā)性物質(zhì)的差異分析

根據(jù)保留時(shí)間、相對(duì)遷移時(shí)間和離子峰強(qiáng)度，利用LAV 分析軟件中Report 插件功能，分別生成了三維圖譜（圖2）和二維差異圖譜（圖3），圖譜背景呈現(xiàn)藍(lán)色，相對(duì)遷移時(shí)間1.0 處紅色豎線為經(jīng)過(guò)歸一化處理的反應(yīng)離子峰（reaction ion peak，RIP）。RIP 右側(cè)的點(diǎn)代表肉蓯蓉所含的揮發(fā)性成分，顏色越深代表所含物質(zhì)的峰強(qiáng)度越高。由圖2 可以看出，不同寄主肉蓯蓉所含揮發(fā)性成分已被有效分離，并且揮發(fā)性成分的差異可以明顯觀察到，如黑色框中所示，不同寄主肉蓯蓉中的揮發(fā)性物質(zhì)種類存在差異，同一揮發(fā)性物質(zhì)的含量也有不同。

圖2 不同寄主肉蓯蓉中揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS 三維譜圖Fig.2 GC-IMS three-dimensional spectrum of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

圖3 不同寄主肉蓯蓉中揮發(fā)性物質(zhì)GC-IMS 二維譜圖（A）和GC-IMS 二維差異譜圖（B）Fig.3 GC-IMS two-dimensional spectra (A) and GC-IMS twodimensional difference spectrum (B) of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

采用Reporter 二維差異譜圖模式，可以更清晰直觀地比較不同樣本間揮發(fā)性物質(zhì)的差異。圖3B差異譜圖是以‘紅柳’樣品為基準(zhǔn)扣除‘梭梭’樣品所形成的譜圖，扣除背景后呈現(xiàn)白色。由圖可知，‘紅柳’肉蓯蓉和‘梭梭’肉蓯蓉中大多數(shù)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)遷移時(shí)間在1.10～1.60 ms 范圍內(nèi)，‘紅柳’在1.10～1.60 ms 出現(xiàn)較強(qiáng)信號(hào)，‘梭梭’則在1.10～1.30 ms 出現(xiàn)較強(qiáng)信號(hào)，‘紅柳’在保留時(shí)間100～800 s 范圍內(nèi)，‘梭梭’則在100～400 s 范圍內(nèi)。從圖中可以看出，‘紅柳’肉蓯蓉中揮發(fā)性物質(zhì)濃度明顯高于‘梭梭’肉蓯蓉。

2.2 不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性物質(zhì)的定性分析

本研究在兩種肉蓯蓉中共檢出35 個(gè)信號(hào)峰。通過(guò)GC-IMS 中VOCal 軟件內(nèi)置的NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)和IMS 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性分析，圖4 顯示了不同寄主肉蓯蓉的揮發(fā)性物質(zhì)特征峰點(diǎn)位圖。其中共定性出27 種揮發(fā)性成分，包括8 種醛類、5 種醇類、4 種酯類和1 種酮類。由于數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)有限，目前有8 種物質(zhì)無(wú)法定性。但需要注意的是，有些化合物同時(shí)檢測(cè)出單體和二聚體（部分揮發(fā)性物質(zhì)濃度較高會(huì)形成二聚體，并出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的遷移峰），具體成分詳見表1。

表1 ‘紅柳’肉蓯蓉與‘梭梭’肉蓯蓉中揮發(fā)性成分定性分析Table 1 Qualitative analysis of volatile components in 'Red Willow' and 'Haloxylon' Cistanche deserticola

圖4 不同寄主肉蓯蓉的揮發(fā)性物質(zhì)特征峰點(diǎn)位圖Fig.4 Characteristic peak locations of volatile substances in different hosts of Cistanche deserticola

2.3 不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)聚類熱圖及指紋圖譜分析

圖5 是將兩種肉蓯蓉?fù)]發(fā)性物質(zhì)成分的峰體積繪制聚類熱圖，由圖可知，‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉各自聚為一類，兩種不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性物質(zhì)存在差異。為了進(jìn)一步方便觀察比較，利用Gallery Plot 插件繪制肉蓯蓉樣品中揮發(fā)性風(fēng)味成分指紋圖譜（圖6），圖中每一行代表一個(gè)樣品中選取的信號(hào)峰，每一列代表同一揮發(fā)性有機(jī)物在不同樣品中的信號(hào)峰。信號(hào)峰顏色越亮，含量越高。從圖6 指紋圖譜可知，紅框中揮發(fā)性物質(zhì)在‘紅柳’肉蓯蓉中信號(hào)峰強(qiáng)度較高，包括2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、3-甲基-2-丁烯醛、庚醛、乙酸甲酯、乙酸己酯等。黃框中揮發(fā)性物質(zhì)在‘梭梭’肉蓯蓉中信號(hào)峰強(qiáng)度較高，包括1-己醇、異丁醇、乙酰妥英、乙酸乙酯等。醛類化合物是肉蓯蓉中重要的香氣物質(zhì)，由于其不飽和脂肪酸的氧化產(chǎn)生的醛類物質(zhì)會(huì)帶來(lái)獨(dú)特的芳香[32]，醛類物質(zhì)含量的不同使兩者的風(fēng)味產(chǎn)生較大差異?！t柳’肉蓯蓉中的2-苯基乙醛（蜂蜜味）、苯甲醛（苦杏仁味）、（E）-2-庚烯醛（柑橘味），3-甲硫基丙醛（洋蔥味）等醛類化合物信號(hào)峰強(qiáng)度較高，且3-甲硫基丙醛會(huì)呈現(xiàn)較強(qiáng)烈洋蔥味，低濃度時(shí)則會(huì)呈現(xiàn)愉快的肉湯香味[33]，因此‘紅柳’肉蓯蓉可能比‘梭梭’肉蓯蓉有著更強(qiáng)烈的味道。而醇類和酯類物質(zhì)的香氣特征賦予肉蓯蓉花草香氣和果香[34]。‘梭梭’肉蓯蓉中信號(hào)峰強(qiáng)度較高的1-己醇（花香和果香）、乙酰妥英（甜甜的奶香味）、異丁醇（清新的香草味）、乙酸乙酯（令人愉快的水果香）會(huì)給果實(shí)帶來(lái)青香，這可能是‘梭梭’肉蓯蓉聞起來(lái)更加清新的原因。

圖5 不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分聚類熱圖Fig.5 Clustering heat map of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

圖6 不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分指紋圖譜Fig.6 Fingerprints of volatile components of Cistanche deserticola in different hosts

2.4 不同寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性成分主成分分析

主成分分析（PCA）是一種有效的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法。在充分利用大部分原始變量信息的基礎(chǔ)上，該方法能將多個(gè)指標(biāo)簡(jiǎn)化為多個(gè)綜合指標(biāo)，進(jìn)一步簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)并揭示變量之間的關(guān)系[35]。通過(guò)GC-IMS 獲取的肉蓯蓉關(guān)于揮發(fā)性成分的基礎(chǔ)上，利用PCA 統(tǒng)計(jì)學(xué)對(duì)兩種肉蓯蓉進(jìn)行分析，Dynamic PCA 插件分析結(jié)果見圖7。由圖7 可知PC-1 貢獻(xiàn)率為83%，PC-2貢獻(xiàn)率為8%，所累計(jì)貢獻(xiàn)率為91%，遠(yuǎn)大于可信值60%以上，因此PC-1 和PC-2 主成分足以反映肉蓯蓉樣品香氣特征信息。另外由圖7 可以直觀看出不同寄主肉蓯蓉之間有明顯區(qū)分度，且平行樣品之間相互聚集，因此，可以根據(jù)特征揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)區(qū)分不同寄主肉蓯蓉。

圖7 不同寄主肉蓯蓉的主成分分析（PCA）圖Fig.7 Principal component analysis (PCA) graph of different hosts of Cistanche deserticola

此外，本實(shí)驗(yàn)采用VOCs 軟件分析方法—“最近鄰”指紋相似度進(jìn)行了分析，該功能可對(duì)樣本進(jìn)行快速比較，通過(guò)計(jì)算樣本的之間的歐式距離，從而可以通過(guò)檢索最小距離來(lái)找到“最近鄰”。此功能可根據(jù)所選評(píng)估區(qū)域中化合物的強(qiáng)度對(duì)A、B 兩種不同寄主的肉蓯蓉樣品進(jìn)行快速比較。從圖8 可以看出A‘紅柳’肉蓯蓉和B‘梭梭’肉蓯蓉中揮發(fā)性物質(zhì)差異明顯。

圖8 不同寄主肉蓯蓉的“最近鄰”指紋分析Fig.8 "Nearest neighbor finger" fingerprint analysis of different hosts of Cistanche deserticola

3 結(jié)論

本研究采用GC-IMS 分析可知，‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉中共檢測(cè)出35 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)（包括單體、二聚體），由于內(nèi)置NIST 數(shù)據(jù)庫(kù)不夠完善，目前只定性出其中的27 種揮發(fā)性物質(zhì)，包括醛類、醇類、酯類、酮類化合物等，以醛類、醇類為主。‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉主要差異物質(zhì)為2-苯基乙醛、苯甲醛、（E）-2-庚烯醛、3-甲硫基丙醛、1-己醛、庚醛、3-甲基-2-丁烯醛、乙酸甲酯、乙酸己酯、1-己醇、乙酰妥英、異丁醇、乙酸乙酯。然而本文僅僅只對(duì)兩種不同寄主肉蓯蓉的揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性分析，雖然通過(guò)指紋圖譜和聚類熱圖能夠直觀地分辨出不同寄主肉蓯蓉之間的揮發(fā)性物質(zhì)的差異，但是并不能代表肉蓯蓉所有的揮發(fā)性物質(zhì)，后續(xù)可增加更多品種肉蓯蓉的分析以及GC-MS 對(duì)其揮發(fā)性物質(zhì)的定量分析，探討其他寄主肉蓯蓉?fù)]發(fā)性物質(zhì)之間的區(qū)別與聯(lián)系。

總之，通過(guò)構(gòu)建肉蓯蓉GC-IMS 揮發(fā)性物質(zhì)聚類熱圖、指紋圖譜以及PCA 主成分分析，能夠很好地分辨出兩種不同寄主肉蓯蓉的揮發(fā)性物質(zhì)的差異，可為‘梭梭’和‘紅柳’肉蓯蓉的快速鑒定和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)研究提供理論參考。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).