劉華文，鄧美晴，陳北燕

（1.廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測中心，廣西南寧 530029；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，公共衛(wèi)生學(xué)院，廣西南寧 530022；3.南寧市衛(wèi)生學(xué)校，廣西南寧 530409）

我國茶葉有著悠久的歷史，其本身具有抗氧化、抗菌、抗癌和抗炎作用，還能降低血壓，減少膽固醇和心血管疾病的患病風(fēng)險[1]。我國茶葉種植存在過量使用農(nóng)藥的情況，且使用的大多數(shù)是化學(xué)類農(nóng)藥[2]。此類農(nóng)藥作用單一無法達(dá)到大規(guī)模的病蟲治理，且使害蟲的抗藥性不斷提高，從而促使茶農(nóng)使用復(fù)配農(nóng)藥，造成農(nóng)藥殘留現(xiàn)象愈發(fā)嚴(yán)重[3-5]。此外，發(fā)達(dá)國家對進(jìn)口產(chǎn)品的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)不斷提高，而我國的茶葉因農(nóng)藥殘留不達(dá)標(biāo)而被阻止出口。茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo)已成為中國茶葉出口最主要的技術(shù)性貿(mào)易壁壘[6]。目前，各國在茶葉產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測重點(diǎn)是制定各種農(nóng)藥的最大殘留限量（Maximum residue limit，MRL）和開發(fā)準(zhǔn)確快速的定性、定量分析方法[7]。我國從2005 年起開始對茶葉產(chǎn)品中農(nóng)藥的MRL 做出強(qiáng)制性要求限制，但仍不及歐盟等發(fā)達(dá)國家的要求。

目前研究較為深入、使用最廣泛的茶葉農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)主要有氣相色譜法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法、液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8]等；前處理方法有超聲提取法[9]、均質(zhì)提取法[10]、索氏提取法、固相萃取法[11]等。大多前處理方法操作繁瑣，試劑消耗量較大。QuEChERS 方法是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種快速樣品前處理技術(shù)[12]，因其具有快速（Quick）、簡單（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effective）、可靠（Rugged）、安全（Safe）的特點(diǎn)而得名[13-16]。QuEChERS 法分為提取和凈化兩部分：使用適宜的溶劑提取待測物，并針對雜質(zhì)選用適宜的凈化劑，一般常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（Graphitizing of carbon black，GCB）等。由于茶葉基質(zhì)復(fù)雜，采用常用凈化劑進(jìn)行凈化，凈化結(jié)果不徹底，會存在基質(zhì)干擾現(xiàn)象[17-18]。多壁碳納米管（MWCNTs）[19-20]是一種新型碳納米材料，由多層石墨片卷曲而成的碳納米管，層與層之間呈無序排列，具有比表面積大、化學(xué)穩(wěn)定性好、吸附能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。通過向吸附劑中加入多壁碳納米管，改進(jìn)QuEChERS 法對茶葉的凈化能力，液質(zhì)聯(lián)用法進(jìn)行檢測的研究鮮有報道。因此，本研究將QuEChERS 技術(shù)和多壁碳納米管凈化劑相結(jié)合，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測茶葉中農(nóng)藥殘留，建立一種快速、簡便、高效的檢測茶葉中多種農(nóng)殘的方法，為茶葉農(nóng)藥的使用、監(jiān)管提供技術(shù)及數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

空白茶葉 購于本地有機(jī)茶社；待測茶葉100 份，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份，分別購自廣西各地；47 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別為毒蟲畏、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、甲基異柳磷、特丁硫磷、特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜、克百威、硫環(huán)磷、甲基硫環(huán)磷、甲胺磷、樂果、滅線磷、內(nèi)吸磷、水胺硫磷、氧樂果、乙酰甲胺磷、滅多威、辛硫磷、吡蟲啉、敵百蟲、多菌靈、甲萘威、茚蟲威、啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉、噻蟲嗪、噻嗪酮、喹螨醚、噻螨酮、乙螨唑、除蟲脲、啶氧菌酯、呋蟲胺、氟蟲脲、唑蟲酰胺、甲氨基阿維菌素甲酸鹽、醚菊酯、吡唑醚菌酯、殺蟲威、殺螟松、氟蟲腈砜、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟甲腈 純度均大于99%，德國Dr Ehrenstorfer 公司；乙腈、甲酸、甲醇 色譜純，德國默克公司；乙酸銨 色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；QuEChERS 提取鹽包 含6 g 無水硫酸鎂和1.5 g 無水乙酸鈉，美國Waters 公司；多壁碳納米管 MWCNTs，成都中科時代納能科技有限公司；N-丙基乙二胺 PSA，天津博納艾杰爾科技有限公司；十八烷基鍵合硅膠 C18，廣州沃恩生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)室用水 超純水。

1290 超高效液相色譜儀 美國Agilent 公司；TRIPLE QUAD 5500 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（配備AB SCIEX 數(shù)據(jù)處理軟件、電噴霧源） 美國AB SCIEX 公司；MS303TS 型電子天平 梅特勒－托利多儀器（上海）公司；Multi Reax 渦旋儀 德國Heidolph 公司；Shaker SA320 振蕩器 日本YAMATO公司；X3R 高速冷凍離心機(jī) 美國熱電Thermo 公司；Gradient A10 Milli-Q 超純水機(jī) 美國Millipore 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 提?。壕芊Q取粉碎茶葉樣品2.000 g（精確至0.001 g）于50 mL 離心管中，加入5 mL 水浸泡30 min，接著加入15 mL 1% 乙酸乙腈溶液，在渦漩儀上渦漩振蕩提取25 min（450 次/min），然后加入QuEChERS 鹽析劑（1.5 g 乙酸鈉，6 g 無水硫酸鎂），立即搖勻，置于振蕩器上劇烈振蕩3 min（450 次/min），以10000 r/min 離心5 min，上清液待凈化。

凈化：取上清液8 mL，轉(zhuǎn)移到含有1200 mg 無水硫酸鎂、50 mg MWCNTs、100 mg PSA 和100 mg C18的凈化管中，渦漩2 min（450 次/min），以10000 r/min 離心5 min，精密吸取上清液2 mL，氮吹至近干，甲醇定容1 mL，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，供UPLC-MS/MS 分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的溶解性選用甲醇或乙腈分別配制成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存。分別適量移取一定體積的各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于同一10 mL 容量瓶中，乙腈定容至刻度，得到10 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再精密量取1 mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液于100 mL 容量瓶中，乙腈稀釋定容至刻度得到0.1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

稱取空白基質(zhì)樣品，按“1.2.1”處理后，得到空白基質(zhì)溶液。分別精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.02、0.05、0.1、0.5、1.0 mL，用空白基質(zhì)溶液配制成濃度為0、2、5、10、50、100 ng/mL 系列基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。

1.2.3 超高效液相色譜條件 色譜柱：InertsilTMODS-3 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相：A 為0.1%甲酸水，B 為甲醇。梯度洗脫程序：0～1.5 min，97%A；1.5～2.5 min，85%A；2.5～9 min，50%A；9～11 min，30%A；11～13 min，2%A；13～13.1 min，97% A；13.1～15 min，97% A；流速：300 μL/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2.0 μL。

1.2.4 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正、負(fù)離子同時掃描；檢測模式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple reaction monitoring，MRM）；電噴霧電壓：5500 V 和-4500 V，霧化氣（氮?dú)猓毫Γ?5 psi；輔助氣壓力：60 psi；氣簾氣（氮?dú)猓毫Γ?0 psi；碰撞氣（氮?dú)猓毫Γ? psi；離子源溫度：550 ℃；掃描時間：60 ms；碰撞室入口電壓：7 V；碰撞室出口電壓：12 V；各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 47 種農(nóng)藥的多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MRM mass spectrometric parameters of 47 kinds of pesticides

1.3 數(shù)據(jù)處理

分別利用Analyst Software 和MutiQuant 3.0.2軟件（AB SCIEX）進(jìn)行數(shù)據(jù)采集及處理，Excel 2013進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取液的優(yōu)化

目前，農(nóng)藥殘留的提取溶劑主要有乙腈、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、甲苯、正己烷和石油醚[21-24]等。茶葉基質(zhì)比較復(fù)雜，使用乙酸乙酯、丙酮、甲醇等作為提取溶劑時，提取液顏色很較深，提取物也更多，不利于后續(xù)凈化。而乙腈作為提取溶劑，因其極性較強(qiáng)，對于油性物質(zhì)如蠟、脂肪、油性色素等不易提取出，可減小雜質(zhì)的干擾，最適于提取各種極性的農(nóng)藥殘留，且僅加入鹽便可實(shí)現(xiàn)與水相的分離[25]。在乙腈中加入少量有機(jī)酸，可防止部分農(nóng)藥分解及調(diào)節(jié)pH，因此加入1%乙酸[26]。對于含水量低的樣品，通過先向樣品中添加一定量的水，可弱化分析物與樣品基質(zhì)之間的相互作用，使待分析物更易在萃取分配過程中被充分提取。通過UPLC-MS/MS 全掃描得到的總離子流圖顯示，乙酸乙腈提取的共萃物少（圖1）。因此，本研究采用加入5 mL 超純水潤濕茶葉后加入15 mL 1%乙酸乙腈作為提取溶劑。

圖1 1%乙酸乙腈作為提取溶劑的總離子流圖Fig.1 TIC of 1% acetic acid acetonitrile as solvents for extraction

2.2 凈化條件的優(yōu)化

茶葉基質(zhì)復(fù)雜，富含色素、茶多酚、生物堿、咖啡堿和脂肪酸等物質(zhì)，水分含量極低[27]。茶葉樣品經(jīng)過有機(jī)溶劑提取后，樣液多呈深紅色，若不采取方法對提取液進(jìn)行凈化，直接進(jìn)儀器分析，既污染色譜柱和離子源，又影響儀器的響應(yīng)，干擾檢測的靈敏度和準(zhǔn)確性[28]。常見的凈化劑有無水硫酸鎂、MWCNTs、GCB、C18、PSA 等。提取時加入無水硫酸鎂能除去茶葉中的水分，保證其他凈化填料的吸附效果[29]，同時避免水分損害儀器和毛細(xì)柱，降低柱效。PSA 的表面鍵合極性官能團(tuán)，具有極性吸附作用和弱陰離子交換功能，對樣品基質(zhì)中的有機(jī)酸、極性色素、糖類等雜質(zhì)吸附能力較強(qiáng)[30-31]。相反，C18可去除酯類和脂肪等非極性干擾物的影響。GCB 具有片狀結(jié)構(gòu)，是一種非極性吸附劑，對含苯環(huán)官能團(tuán)的化合物有較強(qiáng)的吸附作用，可有效去除具有平面結(jié)構(gòu)的甾醇和色素雜質(zhì)，但也會對平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)氯農(nóng)藥進(jìn)行吸附，導(dǎo)致有機(jī)氯農(nóng)藥回收率降低。相比于GCB，MWCNTs的空心柱狀結(jié)構(gòu)對農(nóng)藥吸附作用很小，對色素的吸附能力更強(qiáng)，更易獲得較高的回收率。因此本實(shí)驗(yàn)選取無水硫酸鎂、PSA、C18、MWCNTs 作凈化劑，比較不同配比的凈化效果。取8 mL 提取液，固定加入1200 mg 無水硫酸鎂，分別考察PSA 添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在PSA 添加量為100 mg 時，各農(nóng)藥的平均回收率為73.2%～110.1%；固定1200 mg 無水硫酸鎂、100 mg PSA 用量，比較MWCNTs 添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在MWCNTs 添加量為50 mg時，各農(nóng)藥的平均回收率為68.0%～111.7%；固定1200 mg 無水硫酸鎂、100 mg PSA、50 mg MWCNTs用量，比較C18添加量為50、100、200、300、400、600 mg 的回收率，在C18添加量為100 mg 時，各農(nóng)藥回收率為73.4%～114.3%。最終凈化配比為無水硫酸鎂1200 mg、MWCNTs 50 mg、PSA 100 mg、C18100 mg（圖2）。

圖2 不同凈化條件的回收率Fig.2 Recovery rate of different purification conditions

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

將各農(nóng)藥配制成0.05 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用蠕動泵直接注入質(zhì)譜儀，采用正、負(fù)離子掃描模式，優(yōu)化錐孔電壓使母離子響應(yīng)豐度最大且穩(wěn)定，同時優(yōu)化碰撞能量，選取響應(yīng)豐度較高、易得到、出峰穩(wěn)定的碎片離子作為子離子，并將母離子和子離子組成離子對。具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 液相色譜條件的優(yōu)化

在優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，考察不同色譜柱不同流動相對目標(biāo)物質(zhì)譜信號的影響。本實(shí)驗(yàn)對比了四種色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（1.7 μm，2.1 mm×150 mm）、ATLANTIS T3色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）、INERTSILTMODS-3 色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）、CAPCELL PAK BBH C18色譜柱（3 μm，2.1 mm×150 mm）。甲酸和乙酸銨具有增強(qiáng)目標(biāo)化合物離子化程度和改善峰形的作用[14]，因此，分別考察0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈幾種流動相對目標(biāo)化合物的影響。對比圖3A～D，同種流動相下ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱、Atlantis T3色譜柱、CAPCELL PAK BBH C18色譜柱、INERTSILTM ODS-3 色譜柱，使用INERTSILTMODS-3 色譜柱的色譜圖目標(biāo)化合物響應(yīng)均高于其它3 根色譜柱；對比圖3D～F，同種色譜柱中的三種流動相體系出峰均良好，間距適宜。使用INERTSILTMODS-3 色譜柱，對比0.1%甲酸水-甲醇流動相體系和5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈流動相體系，殺蟲威、除蟲脲在5 mmol/L 乙酸銨溶液-乙腈流動相中出現(xiàn)雜峰，特丁硫磷砜在0.1%甲酸水-甲醇流動相中響應(yīng)值較高。使用INERTSILTMODS-3 色譜柱，對比0.1%甲酸水-甲醇和0.1%甲酸水-乙腈流動相，提取目標(biāo)化合物離子對，結(jié)果顯示使用0.1%甲酸水-甲醇體系時絕大部分化合物的響應(yīng)都高于0.1%甲酸水-乙腈體系。因此，選用INERTSILTMODS-3 色譜柱和0.1%甲酸水-甲醇體系。

圖3 不同色譜柱和流動相的色譜圖Fig.3 Chromatogram of different chromatographic columns and mobile phases

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)（Matrix effect，ME）是指樣品中除待測物以外的組分，常常對分析物的分析過程有明顯的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性?；|(zhì)效應(yīng)可用以下公式計算：

式中，ME 為基質(zhì)效應(yīng)；A 為溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；B 為基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。若ME＜0.8，則表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，ME＞1，則為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，ME=0.8～1，則表現(xiàn)為基質(zhì)效應(yīng)影響不大。本實(shí)驗(yàn)對47 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行評估（圖4），發(fā)現(xiàn)47 種化合物的基質(zhì)效應(yīng)均低于1，其中85%的化合物受到基質(zhì)抑制，因此本方法檢測采用基質(zhì)匹配曲線，以此滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

圖4 47 種化合物在茶葉中的基質(zhì)效應(yīng)Fig.4 Matrix effects of 47 compounds in tea

2.6 線性范圍、檢出限、定量限

在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，按“1.2.2”配制6 個濃度水平的基質(zhì)工作溶液，上機(jī)測定，以目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表2，47 種目標(biāo)化合物在2～100 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9971～0.9996，檢出限（LOD）為0.001～0.006 mg/kg，定量限（LOQ）為0.002～0.020 mg/kg，滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。

表2 47 種化合物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和食品中農(nóng)藥最大殘留限量（MRL）Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LOD,LOQ and maximum residue limits (MRL) for pesticides in food of 47 compounds

2.7 回收率

根據(jù)GB/T 27404-2008[33]對食品理化檢測的質(zhì)量控制要求，分別向空白茶葉樣品添加低、中、高3 水平加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，平行測試6 次，結(jié)果見表3。47 種化合物的平均回收率為73.4%～114.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%）為0.3%～19.9%（n=6），方法具有良好的回收率與精密度。

表3 47 種化合物的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of 47 compounds (n=6)

2.8 實(shí)際樣品檢測

利用本次實(shí)驗(yàn)建立的方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 23200.121-2021[34]分別對廣西省內(nèi)銷售的100 份茶葉進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份。部分農(nóng)藥超出國家標(biāo)準(zhǔn)限值，結(jié)果見表4，其余農(nóng)藥均為未檢出。

表4 QuEChERS 方法和國家標(biāo)準(zhǔn)方法結(jié)果對比Table 4 Comparison results of QuEChERS method and national standard method

3 結(jié)論

本文采用優(yōu)化QuEChERS 方法進(jìn)行前處理，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜作為檢測儀器，在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，47 種農(nóng)藥平均回收率為73.4%～114.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3%～19.9%（n=6），檢出限為0.001～0.006 mg/kg，定量限為0.002～0.020 mg/kg，并對廣西省內(nèi)銷售的100 份茶葉進(jìn)行農(nóng)藥殘留分析，包含綠茶20 份、紅茶20 份、白茶10 份、黑茶25 份、花茶25 份，其中檢出綠茶中水胺硫磷1.78 mg/kg、吡蟲啉0.65 mg/kg，紅茶中氧樂果0.061 mg/kg，其余農(nóng)藥均為未檢出。與國家標(biāo)準(zhǔn)方法相比，標(biāo)準(zhǔn)偏差SD 值滿足農(nóng)藥殘留的檢測要求。該方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，可滿足茶葉中47 種農(nóng)藥殘留的檢測要求。

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