響應(yīng)面法優(yōu)化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛」に嚰捌浼兓に囇芯?/h1>
2024-04-30 12:01:44羅世博古麗格娜皮達買買提劉媛夢高紅艷
食品工業(yè)科技 2024年9期 關(guān)鍵詞：影響
馮 琳，羅世博，古麗格娜·皮達買買提，劉媛夢,3，高紅艷,
（1.伊犁師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.新疆普通高等學(xué)校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，新疆伊寧 835000；3.污染物化學(xué)與環(huán)境治理重點實驗室，新疆伊寧 835000）
準(zhǔn)噶爾山楂（Crataegus songarica），屬薔薇科山楂屬光核組，小喬木或灌木[1]，作為天山野果林的主要樹種之一，準(zhǔn)噶爾山楂具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[2]。其果實中含有多糖、黃酮和三萜等多種成分[3-4]，具有抗氧化、保肝和抗衰老等功效[5-7]，三萜類化合物在植物中部分以游離的形式存在，多數(shù)與糖以苷鍵或酯鍵相結(jié)合，其基本碳架是由30 個碳原子構(gòu)成[8-9]，具有抗氧化[10]、保肝[11-12]、保護腎臟[13]、抗癌[14]、降血脂[15]、降糖[16]、抗炎[17]、抑菌[18]等生物活性，具有極大的藥用價值。為了研究準(zhǔn)噶爾山楂的藥理作用是否與其總?cè)频暮肯嚓P(guān)，首先對其總?cè)频奶崛『图兓に囘M行優(yōu)化，目前有關(guān)總?cè)铺崛〉姆椒ㄖ饕谢亓魈崛》?、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界CO2流體萃取法等。相比于其他提取方法，酶輔助提取法條件溫和，操作方便且對環(huán)境無污染，是利用各種酶來破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，從而提高植物中生物活性物質(zhì)的提取，多種酶協(xié)同作用，可以提高提取效率[19-20]，超聲輔助提取法同樣能夠破壞細(xì)胞壁，使有效成分溶出。大孔樹脂具有機械強度高、耐酸堿性能好、使用壽命長等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化和富集[21-22]。
目前對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频难芯看嬖诳杖保瑹o法以現(xiàn)有研究高效利用準(zhǔn)噶爾山楂。因此本文采用酶-超聲分步提取法提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)疲\用比色法[23]以準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×繛橹笜?biāo)，通過單因素實驗、正交試驗和響應(yīng)面試驗探究準(zhǔn)噶爾山楂的提取工藝和大孔樹脂純化工藝，為準(zhǔn)噶爾山楂的進一步研究與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
準(zhǔn)噶爾山楂 采于新疆伊犁州伊寧市內(nèi)，去核，自然晾干至恒重，粉碎后過100 目篩，備用；無水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸、乙酸鈉天津市福晨化學(xué)試劑廠；高氯酸 桃浦化工廠；香草醛 上海源葉生物科技有限公司，以上試劑均為分析純；D101 型大孔吸附樹脂 滄州茂全新材料科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（＞3 U/mg）、中性蛋白酶（≥50 U/mg） 伊勢久（江蘇連云港）生物科技有限責(zé)任公司；果膠酶（500 U/mg）上海士鋒生物科技有限公司。
BSA124S 電子天平 德國賽多利斯股份公司；YB-150 高速多功能粉碎機 永康市速峰工貿(mào)有限公司；HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KM-300DE 超聲波清洗機 昆山美美超聲儀器有限公司；TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；WH220-HT 磁力攪拌器德國維根斯公司；Hei-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫公司；UV2550 紫外-可見分光光度計 日本島津公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 單一酶提取單因素實驗 準(zhǔn)確稱取0.5 g 準(zhǔn)噶爾山楂粉末，選擇纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶（質(zhì)量比均為1%，2%，3%，4%，5%），以1:20 g/mL 的料液比加入pH5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，55 ℃酶解60 min，后沸水浴滅活10 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液定容，計算總?cè)铺崛×俊?/p>
1.2.2 復(fù)合酶正交試驗 根據(jù)單一酶提取單因素實驗結(jié)果，選取纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶3 個因素，每個因素選取3 個水平，設(shè)計L9（34）正交試驗，篩選復(fù)合酶的最優(yōu)配比，正交因素水平如表1 所示。
表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental factor horizontal design
1.2.3 復(fù)合酶提取工藝單因素實驗 以提取物中總?cè)铺崛×繛橹笜?biāo)，固定其他實驗條件，結(jié)合復(fù)合酶配比的正交試驗結(jié)果，分別對料液比、酶解時間、酶解溫度、酶解pH 等4 個因素對總?cè)铺崛×康挠绊戇M行考察。
1.2.3.1 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：酶解時間60 min，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.2 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察酶解時間為30、60、90、120、150 min 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.3 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解pH5.0，考察酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.4 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解溫度為50 ℃，考察酶解pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.4 酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频捻憫?yīng)面優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總?cè)铺崛×繛轫憫?yīng)值，選擇料液比（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗因素水平如表2 所示。
表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factor level of response surface experiment
1.2.5 酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)?稱取0.3 g 準(zhǔn)噶爾山楂粉末，在最優(yōu)酶解提取條件下提取后，濾渣以1:15 g/mL 的料液比加入70%的乙醇，在超聲功率為120 W，超聲溫度為50 ℃的條件下提取30 min，抽濾，合并兩次提取液，定容，計算總?cè)铺崛×俊?/p>
1.2.6 總?cè)铺崛×康臏y定 準(zhǔn)確稱取5 mg 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，70%乙醇溶解后定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置于比色管中，水浴蒸干溶劑，根據(jù)前期探究顯色條件的實驗結(jié)果，分別加入0.4 mL 顯色劑5%香草醛-冰乙酸，1.0 mL 穩(wěn)定劑高氯酸（71%），60 ℃水浴15 min后，立即轉(zhuǎn)移至冰水浴，5 min 后取出，加入5 mL 冰乙酸，搖勻，在最大吸收波長550 nm 處測定吸光度。橫坐標(biāo)為齊墩果酸的質(zhì)量濃度C，縱坐標(biāo)為吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A=55.88724C-0.05808，R2=0.9995。公式（1）為準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×康挠嬎愎絒24]：
式中：C 為總?cè)频馁|(zhì)量濃度，mg/mL；V 為所取提取液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。
1.2.7 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∥?/p>
1.2.7.1 上樣液的制備 取準(zhǔn)噶爾山楂粉末50 g，以1.2.5 的方法提取，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，備用。
1.2.7.2 大孔樹脂預(yù)處理 稱取適量D101 型大孔樹脂以95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后過濾，濕法裝柱。先用95%的乙醇沖洗至流出液與蒸餾水混合無渾濁后，再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味，備用[25]。
1.2.7.3 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频墓に噧?yōu)化 上樣液濃度的選擇：稱取相同質(zhì)量預(yù)處理好的D101 型大孔樹脂5 份，濕法裝柱，柱體積為20 mL，分別制備濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL 的上樣液各10 mL，上樣速度為1 mL/min 吸附后，均用5 BV的水和 95%乙醇分步洗脫，收集洗脫液，計算洗脫液中總?cè)茲舛?，并根?jù)公式（2）計算吸附率，確定上樣液濃度。
式中，C0為起始樣品溶液中總?cè)茲舛?，mg/mL；C1為吸附后樣品溶液中總?cè)茲舛?，mg/mL。
上樣量的選擇：稱取預(yù)處理好的D101 型大孔樹脂，濕法裝柱，上樣液以1 mL/min 的流速上柱，流出液每5 mL 收集1 次，測定并計算每份流出液的總?cè)茲舛?，繪制泄露曲線。
洗脫劑濃度的確定：稱取5 份預(yù)處理好的D101型大孔樹脂，濕法裝柱，取5 份15 mL，6 mg/mL 準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∫?，? mL/min 的流速上柱，吸附完成后用蒸餾水洗至流出液無色，分別用體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，每10 mL 收集1 次洗脫液，計算每份洗脫液以及合并洗脫液中總?cè)频臐舛?，繪制不同乙醇濃度動態(tài)解吸曲線，確定洗脫液體積和濃度。
1.2.8 準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)萍兌燃盎厥章实挠嬎?在上述篩選的純化工藝條件下，用D101 型大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)拼痔嵛?，流出液旋干，?.01 g總?cè)萍兓铮╩1），以一定量（V1）的純水溶解，按照
1.2.6 的方法測定其總?cè)茲舛龋–2），并根據(jù)公式（3）和公式（4）計算純度以及回收率[21]。
1.3 數(shù)據(jù)處理
每組實驗平行做3 次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)使用Origin 2022 軟件作圖，并使用IBM SPSS Statistics 26 和Design-Expert 8.0.6 進行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 單一酶提取效果
單一酶提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频挠昧拷Y(jié)果如圖1 所示，由圖可知，隨著酶用量的增加，4 種酶輔助提取效果均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于酶的作用使準(zhǔn)噶爾山楂細(xì)胞的通透性增強，總?cè)聘兹艹?，從而提高其提取效果，但達到最高點后呈現(xiàn)下降趨勢，可能是過量的酶會包裹原料顆粒，不利于三萜的溶出，造成總?cè)铺崛÷实南陆礫26-27]。總體來看，果膠酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛⌒Ч詈?，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶輔助提取的最高提取量相近，但考慮到經(jīng)濟效益，選擇木瓜蛋白酶進行后期實驗。因此選擇纖維素酶（2%、3%、4%），果膠酶（2%、3%、4%），木瓜蛋白酶（1%、2%、3%）進行正交試驗確定復(fù)合酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频拿副壤?/p>
圖1 單一酶提取單因素實驗Fig.1 Single factor experiment of single enzyme extraction
2.2 復(fù)合酶比例對總?cè)铺崛×康挠绊?/h3>
復(fù)合酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频恼辉囼灲Y(jié)果和方差分析結(jié)果見表3 和表4，通過極差分析可知，三種酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛〗Y(jié)果的影響程度的順序為A＞B＞C，即纖維素酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶，且據(jù)方差分析可知，纖維素酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛⌒Ч酗@著影響（P＜0.05），果膠酶和木瓜蛋白酶無顯著影響（P＞0.05）。確定復(fù)合酶提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)比例A3B3C2，即纖維素酶4%，果膠酶4%，木瓜蛋白酶2%，與正交試驗結(jié)果一致。根據(jù)優(yōu)化條件進行3 次平行實驗，結(jié)果顯示準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频钠骄崛×繛椋?3.536±0.601）mg/g，說明此方法具有較好的穩(wěn)定性和可行性。
表3 復(fù)合酶比例正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of compound enzyme ratio
表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis
2.3 復(fù)合酶提取單因素實驗
2.3.1 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖2 可知，總?cè)频奶崛×吭诖朔秶鷥?nèi)隨料液比的逐漸增大而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比達到1:20 g/mL時，總?cè)铺崛×匡@著高于其他（P＜0.05），分析原因可能是提取劑的體積增加，使固液之間總?cè)频臐舛炔钤龃?，有利于其傳質(zhì)作用，但是由于樣品中總?cè)铺崛×坑邢?，且其他物質(zhì)也更容易被溶解，并與三萜競爭溶劑，導(dǎo)致料液比繼續(xù)增加時，總?cè)铺崛×砍尸F(xiàn)下降趨勢[28-29]。因此，選擇1:15、1:20、1:25 g/mL的料液比進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖2 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.2 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.2 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖3 可知，在30～60 min 時，準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×砍尸F(xiàn)上升趨勢，而60 min 之后則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，酶解時間為60 min 時，提取物中總?cè)铺崛×匡@著高于其他（P＜0.05）。這可能是由于酶解時間過短時，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)沒有被完全破壞，酶解不充分，時間過長則會使更多其他成分溶解于提取液中，且可能會破壞有效成分的結(jié)構(gòu)，影響總?cè)频奶崛⌒Ч鸞30]。因此，選擇酶解時間30、60、90 min 進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖3 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.3 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖4 可知，酶解溫度對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛⌒Ч绊戄^大，溫度過高或過低都不利于總?cè)频奶崛?，?dāng)溫度達到50 ℃時，提取液中總?cè)频奶崛×孔罡?，?dāng)溫度持續(xù)升高時，總?cè)频奶崛×砍霈F(xiàn)急劇下降，分析原因可能是溫度升高有利于提高酶活性和分子擴散速率，從而加快提取速率，但是溫度超過50 ℃時，酶活性降低，提取效率下降[31]。因此，選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖4 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.4 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊?酶都有最適宜的pH，過酸或過堿都有可能造成酶的變性，從而失去活性。由圖5 可知，準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×侩S著酶解pH 的增大，總體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH 為4.5 時，提取液中總?cè)频奶崛×孔罡?，繼續(xù)增大pH 時，提取量反而下降，說明pH4.5 為酶解的最適宜pH，在此之外酶活性降低。因此，選擇酶解的最適宜pH4.5 進行下一步實驗。
圖5 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the extraction amount of total triterpenoids
通過以上單因素實驗結(jié)果可以看出，料液比、酶解溫度和酶解時間的不同均對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×坑休^大影響，而改變酶解pH 對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×康挠绊懖淮螅虼诉x擇料液比、酶解溫度、酶解時間進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，在試驗過程中，酶解pH 均為4.5。
2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频墓に?/h3>
2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，優(yōu)化提取工藝，分析各因素對總?cè)铺崛⌒Ч木C合影響，試驗結(jié)果見表5。
表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 5 Test design and results of response surface methodology
運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表中數(shù)據(jù)進行分析和數(shù)據(jù)擬合，得到二項多次回歸方程為：Y=36.72+0.13A+0.26B+0.29C+0.01AB+0.45AC-7.25×10-3BC-0.23A2-1.00B2-0.61C2。為檢驗方程是否有效，利用軟件對其回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表6。由表6 可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），R2=0.9536，失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型擬合較好，其他因素對實驗結(jié)果的影響較小，可用于分析響應(yīng)值，預(yù)測實驗結(jié)果。由表6 可知，在一次項中，酶解溫度（B）和酶解時間（C）對總?cè)铺崛×康挠绊懖町愶@著（P＜0.05），料液比（A）對總?cè)铺崛×康挠绊懖町惒伙@著（P＞0.05），二次項中B2的影響高度顯著（P＜0.0001），C2影響極顯著（P＜0.01），交互項中AC 影響極顯著（P＜0.01），AB 和BC 影響不顯著（P＞0.05）。比較F值可知，各因素對提取量的影響大小順序為：酶解時間（C）＞酶解溫度（B）＞料液比（A）。
表6 回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of regression model
通過回歸方程作響應(yīng)面圖和等高線圖（見圖6），可以更直觀地反映各因素的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊?。響?yīng)面圖曲線彎曲明顯，顏色變化快，等高線呈現(xiàn)橢圓形說明兩個因素交互作用大，反之，曲線彎曲程度小，顏色變化不快，等高線呈現(xiàn)圓形，則說明兩個因素交互作用對響應(yīng)值的影響不明顯。因此，由圖6 可知，A（料液比）和C（酶解時間）的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懽畲?，A（料液比）和B（酶解溫度）交互作用影響其次，B（酶解溫度）和C（酶解時間）的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懽钊酢?/p>
圖6 各因素交互作用對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effect of interaction of various factors on the total triterpenoids extraction amount of Crataegus songarica
2.4.2 最優(yōu)工藝驗證實驗結(jié)果 運用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)提取工藝為：料液比為1:24.06 g/mL，酶解溫度為50.66 ℃，酶解時間為75.99 min，預(yù)測在此條件下總?cè)频奶崛×繛?6.865 mg/g。根據(jù)實際操作調(diào)節(jié)，調(diào)整最優(yōu)條件為：料液比為1:24 g/mL，酶解溫度為51 ℃，酶解時間為76 min。通過3 次平行實驗驗證，得到在此條件下總?cè)频钠骄崛×繛椋?6.570±0.332）mg/g，實驗結(jié)果與預(yù)測值相近，說明此方法具有可行性且穩(wěn)定性高。
2.5 酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)?/h3>
在最優(yōu)酶解條件下提取結(jié)束后，再進行超聲提取，通過3 次平行實驗，得出酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×繛椋?3.782±0.673）mg/g。實驗結(jié)果說明酶解后的濾渣再次進行超聲提取能夠明顯增加總?cè)频奶崛⌒Ч?，且具有穩(wěn)定性。
2.6 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∥?/h3>
2.6.1 大孔樹脂純化工藝
2.6.1.1 上樣液濃度的選擇 由圖7 可知，吸附率在2～6 mg/mL 的范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢，這可能是由于上樣液濃度增大后，溶液中三萜與大孔樹脂接觸的幾率也逐漸增大，而隨著上樣液濃度的進一步增加，樣液中其他成分的濃度也會增大，與三萜競爭活性位點，導(dǎo)致吸附率呈下降的趨勢[32]。當(dāng)上樣液濃度為6 mg/mL 時，大孔樹脂吸附率最高，之后開始呈現(xiàn)下降趨勢。
圖7 上樣液濃度對總?cè)莆铰实挠绊慒ig.7 Effect of loading concentration on the adsorption rate of total triterpenoids
2.6.1.2 上樣量的選擇 由圖8 可知，隨著上樣體積的逐漸增加，流出液中的總?cè)茲舛瘸尸F(xiàn)先平緩后快速上升，最后又平緩上升的趨勢。當(dāng)流出液為15 mL時，流出液中總?cè)频臐舛壬仙缴蠘右嚎側(cè)茲舛鹊?/10，達到泄露點[11]，隨后總?cè)崎_始大量泄露，因此選擇15 mL 為上樣液體積。當(dāng)流出液體積為60 mL 后，流出液總?cè)茲舛戎饾u與上樣液總?cè)茲舛冉咏?，因此上樣液體積最大不應(yīng)超過60 mL。
圖8 大孔樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.8 Dynamic adsorption curve of microporous resin
2.6.1.3 洗脫液的選擇 不同乙醇濃度的解吸曲線如圖9 所示。由圖9 可知，當(dāng)乙醇濃度為70%和90%時，均能夠迅速將吸附的三萜洗脫下來，在洗脫液通過體積為20 mL 時達到高峰，洗脫液體積為50 mL時，被吸附的三萜類化合物基本被洗脫，洗脫曲線出峰快，無明顯拖尾現(xiàn)象，而乙醇濃度較低時，三萜難以被洗脫。因此為了節(jié)約試劑，并提高純化效率，選擇70%的乙醇進行洗脫，洗脫液體積為50 mL。
圖9 不同乙醇濃度時大孔樹脂的洗脫曲線Fig.9 Elution curves of macroporous resin at different ethanol concentrations
2.6.2 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∫旱墓に?在以上優(yōu)化的純化條件下純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)拼痔嵛?，?jīng)測定計算得純化前后總?cè)频募兌扔?.52%提高至29.93%，回收率為81.25%。實驗結(jié)果表明D101 型大孔樹脂能夠用于純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)疲厥章瘦^高，但純化效果一般，提取物中仍含有其他成分，說明大孔樹脂只能除去一部分雜質(zhì)，并不能達到精制的目的，若想得到純度高的總?cè)萍兓铮€需進行二次純化。
3 結(jié)論
通過設(shè)計正交試驗和響應(yīng)面試驗確定準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)提取條件為纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的添加量分別為4%、4%和2%，料液比為1:24 g/mL，溫度51 ℃，pH 為4.5，酶解76 min，提取量為（36.570±0.332）mg/g，通過超聲再次提取后，總?cè)铺崛×窟_到（53.782±0.673）mg/g,說明酶-超聲分步提取法能夠顯著提高準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×?。其次，通過D101 型大孔樹脂確定純化工藝為：上樣液濃度為6 mg/mL，流速：1 mL/min，上樣量：15 mL，洗脫條件為50 mL，70%乙醇，純化后的準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频募兌瓤蛇_29.93%，回收率為81.25%，說明大孔樹脂可以除去一部分雜質(zhì)，提高準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频募兌?，但若想得到純度更高的三萜純化物，還需進一步純化精制。以上提取工藝和純化工藝的建立，均為準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频某煞盅芯亢透患峁┝诵碌膶嶒炓罁?jù)，而且方法條件溫和，效率高且穩(wěn)定性好。實驗只針對提取的酶解部分進行了條件優(yōu)化，對超聲部分的提取條件還有待進一步優(yōu)化，同時還需要對大孔樹脂純化后的純化物進行進一步精制，并對其純化前后的生物活性進一步研究。
? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
猜你喜歡
美食網(wǎng)紅如何影響我們吃什么英語文摘(2022年4期)2022-06-05 07:45:18 是什么影響了滑動摩擦力的大小中學(xué)生數(shù)理化·八年級物理人教版(2022年3期)2022-03-16 05:55:08 哪些顧慮影響擔(dān)當(dāng)?當(dāng)代陜西(2021年2期)2021-03-29 07:41:24 影響大師家庭影院技術(shù)(2020年10期)2020-12-14 07:54:18 沒錯，痛經(jīng)有時也會影響懷孕媽媽寶寶(2017年3期)2017-02-21 01:22:28 擴鏈劑聯(lián)用對PETG擴鏈反應(yīng)與流變性能的影響中國塑料(2016年3期)2016-06-15 20:30:00 基于Simulink的跟蹤干擾對跳頻通信的影響通信電源技術(shù)(2016年3期)2016-03-26 07:13:38 如何影響他人知識經(jīng)濟·中國直銷(2016年3期)2016-02-27 16:15:49 APRIL siRNA對SW480裸鼠移植瘤的影響現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志(2014年6期)2014-02-02 03:02:04
馮 琳，羅世博，古麗格娜·皮達買買提，劉媛夢,3，高紅艷,
（1.伊犁師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆伊寧 835000；2.新疆普通高等學(xué)校天然產(chǎn)物化學(xué)與應(yīng)用重點實驗室，新疆伊寧 835000；3.污染物化學(xué)與環(huán)境治理重點實驗室，新疆伊寧 835000）
準(zhǔn)噶爾山楂（Crataegus songarica），屬薔薇科山楂屬光核組，小喬木或灌木[1]，作為天山野果林的主要樹種之一，準(zhǔn)噶爾山楂具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[2]。其果實中含有多糖、黃酮和三萜等多種成分[3-4]，具有抗氧化、保肝和抗衰老等功效[5-7]，三萜類化合物在植物中部分以游離的形式存在，多數(shù)與糖以苷鍵或酯鍵相結(jié)合，其基本碳架是由30 個碳原子構(gòu)成[8-9]，具有抗氧化[10]、保肝[11-12]、保護腎臟[13]、抗癌[14]、降血脂[15]、降糖[16]、抗炎[17]、抑菌[18]等生物活性，具有極大的藥用價值。為了研究準(zhǔn)噶爾山楂的藥理作用是否與其總?cè)频暮肯嚓P(guān)，首先對其總?cè)频奶崛『图兓に囘M行優(yōu)化，目前有關(guān)總?cè)铺崛〉姆椒ㄖ饕谢亓魈崛》?、酶輔助提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法以及超臨界CO2流體萃取法等。相比于其他提取方法，酶輔助提取法條件溫和，操作方便且對環(huán)境無污染，是利用各種酶來破壞植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)完整性，從而提高植物中生物活性物質(zhì)的提取，多種酶協(xié)同作用，可以提高提取效率[19-20]，超聲輔助提取法同樣能夠破壞細(xì)胞壁，使有效成分溶出。大孔樹脂具有機械強度高、耐酸堿性能好、使用壽命長等優(yōu)點，被廣泛用于天然產(chǎn)物的分離純化和富集[21-22]。
目前對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频难芯看嬖诳杖保瑹o法以現(xiàn)有研究高效利用準(zhǔn)噶爾山楂。因此本文采用酶-超聲分步提取法提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)疲\用比色法[23]以準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×繛橹笜?biāo)，通過單因素實驗、正交試驗和響應(yīng)面試驗探究準(zhǔn)噶爾山楂的提取工藝和大孔樹脂純化工藝，為準(zhǔn)噶爾山楂的進一步研究與開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與儀器
準(zhǔn)噶爾山楂 采于新疆伊犁州伊寧市內(nèi)，去核，自然晾干至恒重，粉碎后過100 目篩，備用；無水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；冰乙酸、乙酸鈉天津市福晨化學(xué)試劑廠；高氯酸 桃浦化工廠；香草醛 上海源葉生物科技有限公司，以上試劑均為分析純；D101 型大孔吸附樹脂 滄州茂全新材料科技有限公司；木瓜蛋白酶（800 U/mg）、齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%） 上海源葉生物科技有限公司；纖維素酶（＞3 U/mg）、中性蛋白酶（≥50 U/mg） 伊勢久（江蘇連云港）生物科技有限責(zé)任公司；果膠酶（500 U/mg）上海士鋒生物科技有限公司。
BSA124S 電子天平 德國賽多利斯股份公司；YB-150 高速多功能粉碎機 永康市速峰工貿(mào)有限公司；HH-S1數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KM-300DE 超聲波清洗機 昆山美美超聲儀器有限公司；TDZ5-WS 多管架自動平衡離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司；WH220-HT 磁力攪拌器德國維根斯公司；Hei-VAP 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國海道夫公司；UV2550 紫外-可見分光光度計 日本島津公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 單一酶提取單因素實驗 準(zhǔn)確稱取0.5 g 準(zhǔn)噶爾山楂粉末，選擇纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶（質(zhì)量比均為1%，2%，3%，4%，5%），以1:20 g/mL 的料液比加入pH5.0 的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液，55 ℃酶解60 min，后沸水浴滅活10 min，離心（4000 r/min，10 min），取上清液定容，計算總?cè)铺崛×俊?/p>
1.2.2 復(fù)合酶正交試驗 根據(jù)單一酶提取單因素實驗結(jié)果，選取纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶3 個因素，每個因素選取3 個水平，設(shè)計L9（34）正交試驗，篩選復(fù)合酶的最優(yōu)配比，正交因素水平如表1 所示。
表1 正交試驗因素水平設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental factor horizontal design
1.2.3 復(fù)合酶提取工藝單因素實驗 以提取物中總?cè)铺崛×繛橹笜?biāo)，固定其他實驗條件，結(jié)合復(fù)合酶配比的正交試驗結(jié)果，分別對料液比、酶解時間、酶解溫度、酶解pH 等4 個因素對總?cè)铺崛×康挠绊戇M行考察。
1.2.3.1 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：酶解時間60 min，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察料液比為1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.2 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解溫度為50 ℃，酶解pH5.0，考察酶解時間為30、60、90、120、150 min 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.3 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解pH5.0，考察酶解溫度為40、45、50、55、60 ℃對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.3.4 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊?稱取0.5 g準(zhǔn)噶爾山楂粉末，以最優(yōu)復(fù)合酶配比加入復(fù)合酶，固定其他單因素條件為：料液比1:20 g/mL，酶解時間為60 min，酶解溫度為50 ℃，考察酶解pH 為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0 對總?cè)铺崛×康挠绊憽?/p>
1.2.4 酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频捻憫?yīng)面優(yōu)化設(shè)計 在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，以總?cè)铺崛×繛轫憫?yīng)值，選擇料液比（A）、酶解溫度（B）和酶解時間（C）設(shè)計三因素三水平的響應(yīng)面試驗，試驗因素水平如表2 所示。
表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factor level of response surface experiment
1.2.5 酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)?稱取0.3 g 準(zhǔn)噶爾山楂粉末，在最優(yōu)酶解提取條件下提取后，濾渣以1:15 g/mL 的料液比加入70%的乙醇，在超聲功率為120 W，超聲溫度為50 ℃的條件下提取30 min，抽濾，合并兩次提取液，定容，計算總?cè)铺崛×俊?/p>
1.2.6 總?cè)铺崛×康臏y定 準(zhǔn)確稱取5 mg 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，70%乙醇溶解后定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，即得0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別吸取標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 置于比色管中，水浴蒸干溶劑，根據(jù)前期探究顯色條件的實驗結(jié)果，分別加入0.4 mL 顯色劑5%香草醛-冰乙酸，1.0 mL 穩(wěn)定劑高氯酸（71%），60 ℃水浴15 min后，立即轉(zhuǎn)移至冰水浴，5 min 后取出，加入5 mL 冰乙酸，搖勻，在最大吸收波長550 nm 處測定吸光度。橫坐標(biāo)為齊墩果酸的質(zhì)量濃度C，縱坐標(biāo)為吸光度A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程A=55.88724C-0.05808，R2=0.9995。公式（1）為準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×康挠嬎愎絒24]：
式中：C 為總?cè)频馁|(zhì)量濃度，mg/mL；V 為所取提取液體積，mL；n 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品質(zhì)量，g。
1.2.7 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∥?/p>
1.2.7.1 上樣液的制備 取準(zhǔn)噶爾山楂粉末50 g，以1.2.5 的方法提取，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，備用。
1.2.7.2 大孔樹脂預(yù)處理 稱取適量D101 型大孔樹脂以95%乙醇浸泡24 h，充分溶脹后過濾，濕法裝柱。先用95%的乙醇沖洗至流出液與蒸餾水混合無渾濁后，再用蒸餾水沖洗至流出液無醇味，備用[25]。
1.2.7.3 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频墓に噧?yōu)化 上樣液濃度的選擇：稱取相同質(zhì)量預(yù)處理好的D101 型大孔樹脂5 份，濕法裝柱，柱體積為20 mL，分別制備濃度為2、4、6、8、10、12 mg/mL 的上樣液各10 mL，上樣速度為1 mL/min 吸附后，均用5 BV的水和 95%乙醇分步洗脫，收集洗脫液，計算洗脫液中總?cè)茲舛?，并根?jù)公式（2）計算吸附率，確定上樣液濃度。
式中，C0為起始樣品溶液中總?cè)茲舛?，mg/mL；C1為吸附后樣品溶液中總?cè)茲舛?，mg/mL。
上樣量的選擇：稱取預(yù)處理好的D101 型大孔樹脂，濕法裝柱，上樣液以1 mL/min 的流速上柱，流出液每5 mL 收集1 次，測定并計算每份流出液的總?cè)茲舛?，繪制泄露曲線。
洗脫劑濃度的確定：稱取5 份預(yù)處理好的D101型大孔樹脂，濕法裝柱，取5 份15 mL，6 mg/mL 準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∫?，? mL/min 的流速上柱，吸附完成后用蒸餾水洗至流出液無色，分別用體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、50%、70%、90%的乙醇洗脫，每10 mL 收集1 次洗脫液，計算每份洗脫液以及合并洗脫液中總?cè)频臐舛?，繪制不同乙醇濃度動態(tài)解吸曲線，確定洗脫液體積和濃度。
1.2.8 準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)萍兌燃盎厥章实挠嬎?在上述篩選的純化工藝條件下，用D101 型大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)拼痔嵛?，流出液旋干，?.01 g總?cè)萍兓铮╩1），以一定量（V1）的純水溶解，按照
1.2.6 的方法測定其總?cè)茲舛龋–2），并根據(jù)公式（3）和公式（4）計算純度以及回收率[21]。
1.3 數(shù)據(jù)處理
每組實驗平行做3 次，結(jié)果取平均值，數(shù)據(jù)使用Origin 2022 軟件作圖，并使用IBM SPSS Statistics 26 和Design-Expert 8.0.6 進行數(shù)據(jù)分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 單一酶提取效果
單一酶提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频挠昧拷Y(jié)果如圖1 所示，由圖可知，隨著酶用量的增加，4 種酶輔助提取效果均呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，這可能是由于酶的作用使準(zhǔn)噶爾山楂細(xì)胞的通透性增強，總?cè)聘兹艹?，從而提高其提取效果，但達到最高點后呈現(xiàn)下降趨勢，可能是過量的酶會包裹原料顆粒，不利于三萜的溶出，造成總?cè)铺崛÷实南陆礫26-27]。總體來看，果膠酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛⌒Ч詈?，木瓜蛋白酶與中性蛋白酶輔助提取的最高提取量相近，但考慮到經(jīng)濟效益，選擇木瓜蛋白酶進行后期實驗。因此選擇纖維素酶（2%、3%、4%），果膠酶（2%、3%、4%），木瓜蛋白酶（1%、2%、3%）進行正交試驗確定復(fù)合酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频拿副壤?/p>
圖1 單一酶提取單因素實驗Fig.1 Single factor experiment of single enzyme extraction
2.2 復(fù)合酶比例對總?cè)铺崛×康挠绊?/h3>
復(fù)合酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频恼辉囼灲Y(jié)果和方差分析結(jié)果見表3 和表4，通過極差分析可知，三種酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛〗Y(jié)果的影響程度的順序為A＞B＞C，即纖維素酶＞果膠酶＞木瓜蛋白酶，且據(jù)方差分析可知，纖維素酶對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛⌒Ч酗@著影響（P＜0.05），果膠酶和木瓜蛋白酶無顯著影響（P＞0.05）。確定復(fù)合酶提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)比例A3B3C2，即纖維素酶4%，果膠酶4%，木瓜蛋白酶2%，與正交試驗結(jié)果一致。根據(jù)優(yōu)化條件進行3 次平行實驗，結(jié)果顯示準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频钠骄崛×繛椋?3.536±0.601）mg/g，說明此方法具有較好的穩(wěn)定性和可行性。
表3 復(fù)合酶比例正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal experimental results of compound enzyme ratio
表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis
2.3 復(fù)合酶提取單因素實驗
2.3.1 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖2 可知，總?cè)频奶崛×吭诖朔秶鷥?nèi)隨料液比的逐漸增大而呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，當(dāng)料液比達到1:20 g/mL時，總?cè)铺崛×匡@著高于其他（P＜0.05），分析原因可能是提取劑的體積增加，使固液之間總?cè)频臐舛炔钤龃?，有利于其傳質(zhì)作用，但是由于樣品中總?cè)铺崛×坑邢?，且其他物質(zhì)也更容易被溶解，并與三萜競爭溶劑，導(dǎo)致料液比繼續(xù)增加時，總?cè)铺崛×砍尸F(xiàn)下降趨勢[28-29]。因此，選擇1:15、1:20、1:25 g/mL的料液比進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖2 料液比對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.2 Effect of liquid material ratio on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.2 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖3 可知，在30～60 min 時，準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×砍尸F(xiàn)上升趨勢，而60 min 之后則呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，酶解時間為60 min 時，提取物中總?cè)铺崛×匡@著高于其他（P＜0.05）。這可能是由于酶解時間過短時，細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)沒有被完全破壞，酶解不充分，時間過長則會使更多其他成分溶解于提取液中，且可能會破壞有效成分的結(jié)構(gòu)，影響總?cè)频奶崛⌒Ч鸞30]。因此，選擇酶解時間30、60、90 min 進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖3 酶解時間對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.3 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊?由圖4 可知，酶解溫度對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛⌒Ч绊戄^大，溫度過高或過低都不利于總?cè)频奶崛?，?dāng)溫度達到50 ℃時，提取液中總?cè)频奶崛×孔罡?，?dāng)溫度持續(xù)升高時，總?cè)频奶崛×砍霈F(xiàn)急劇下降，分析原因可能是溫度升高有利于提高酶活性和分子擴散速率，從而加快提取速率，但是溫度超過50 ℃時，酶活性降低，提取效率下降[31]。因此，選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行下一步響應(yīng)面優(yōu)化試驗。
圖4 酶解溫度對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the extraction amount of total triterpenoids
2.3.4 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊?酶都有最適宜的pH，過酸或過堿都有可能造成酶的變性，從而失去活性。由圖5 可知，準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×侩S著酶解pH 的增大，總體呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)pH 為4.5 時，提取液中總?cè)频奶崛×孔罡?，繼續(xù)增大pH 時，提取量反而下降，說明pH4.5 為酶解的最適宜pH，在此之外酶活性降低。因此，選擇酶解的最適宜pH4.5 進行下一步實驗。
圖5 酶解pH 對總?cè)铺崛×康挠绊慒ig.5 Effect of enzymatic hydrolysis pH on the extraction amount of total triterpenoids
通過以上單因素實驗結(jié)果可以看出，料液比、酶解溫度和酶解時間的不同均對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×坑休^大影響，而改變酶解pH 對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×康挠绊懖淮螅虼诉x擇料液比、酶解溫度、酶解時間進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，在試驗過程中，酶解pH 均為4.5。
2.4 響應(yīng)面優(yōu)化酶輔助提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频墓に?/h3>
2.4.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken 試驗設(shè)計原理，優(yōu)化提取工藝，分析各因素對總?cè)铺崛⌒Ч木C合影響，試驗結(jié)果見表5。
表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案與結(jié)果Table 5 Test design and results of response surface methodology
運用Design-Expert 8.0.6 軟件對表中數(shù)據(jù)進行分析和數(shù)據(jù)擬合，得到二項多次回歸方程為：Y=36.72+0.13A+0.26B+0.29C+0.01AB+0.45AC-7.25×10-3BC-0.23A2-1.00B2-0.61C2。為檢驗方程是否有效，利用軟件對其回歸模型進行方差分析，結(jié)果見表6。由表6 可知，回歸模型極顯著（P＜0.01），R2=0.9536，失擬項不顯著（P＞0.05），說明模型擬合較好，其他因素對實驗結(jié)果的影響較小，可用于分析響應(yīng)值，預(yù)測實驗結(jié)果。由表6 可知，在一次項中，酶解溫度（B）和酶解時間（C）對總?cè)铺崛×康挠绊懖町愶@著（P＜0.05），料液比（A）對總?cè)铺崛×康挠绊懖町惒伙@著（P＞0.05），二次項中B2的影響高度顯著（P＜0.0001），C2影響極顯著（P＜0.01），交互項中AC 影響極顯著（P＜0.01），AB 和BC 影響不顯著（P＞0.05）。比較F值可知，各因素對提取量的影響大小順序為：酶解時間（C）＞酶解溫度（B）＞料液比（A）。
表6 回歸模型方差分析結(jié)果Table 6 Results of variance analysis of regression model
通過回歸方程作響應(yīng)面圖和等高線圖（見圖6），可以更直觀地反映各因素的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊?。響?yīng)面圖曲線彎曲明顯，顏色變化快，等高線呈現(xiàn)橢圓形說明兩個因素交互作用大，反之，曲線彎曲程度小，顏色變化不快，等高線呈現(xiàn)圓形，則說明兩個因素交互作用對響應(yīng)值的影響不明顯。因此，由圖6 可知，A（料液比）和C（酶解時間）的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懽畲?，A（料液比）和B（酶解溫度）交互作用影響其次，B（酶解溫度）和C（酶解時間）的交互作用對總?cè)铺崛×康挠绊懽钊酢?/p>
圖6 各因素交互作用對準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛×坑绊懙捻憫?yīng)面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour map of the effect of interaction of various factors on the total triterpenoids extraction amount of Crataegus songarica
2.4.2 最優(yōu)工藝驗證實驗結(jié)果 運用Design-Expert 8.0.6 軟件分析得出準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)提取工藝為：料液比為1:24.06 g/mL，酶解溫度為50.66 ℃，酶解時間為75.99 min，預(yù)測在此條件下總?cè)频奶崛×繛?6.865 mg/g。根據(jù)實際操作調(diào)節(jié)，調(diào)整最優(yōu)條件為：料液比為1:24 g/mL，酶解溫度為51 ℃，酶解時間為76 min。通過3 次平行實驗驗證，得到在此條件下總?cè)频钠骄崛×繛椋?6.570±0.332）mg/g，實驗結(jié)果與預(yù)測值相近，說明此方法具有可行性且穩(wěn)定性高。
2.5 酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)?/h3>
在最優(yōu)酶解條件下提取結(jié)束后，再進行超聲提取，通過3 次平行實驗，得出酶-超聲分步提取準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×繛椋?3.782±0.673）mg/g。實驗結(jié)果說明酶解后的濾渣再次進行超聲提取能夠明顯增加總?cè)频奶崛⌒Ч?，且具有穩(wěn)定性。
2.6 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∥?/h3>
2.6.1 大孔樹脂純化工藝
2.6.1.1 上樣液濃度的選擇 由圖7 可知，吸附率在2～6 mg/mL 的范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢，這可能是由于上樣液濃度增大后，溶液中三萜與大孔樹脂接觸的幾率也逐漸增大，而隨著上樣液濃度的進一步增加，樣液中其他成分的濃度也會增大，與三萜競爭活性位點，導(dǎo)致吸附率呈下降的趨勢[32]。當(dāng)上樣液濃度為6 mg/mL 時，大孔樹脂吸附率最高，之后開始呈現(xiàn)下降趨勢。
圖7 上樣液濃度對總?cè)莆铰实挠绊慒ig.7 Effect of loading concentration on the adsorption rate of total triterpenoids
2.6.1.2 上樣量的選擇 由圖8 可知，隨著上樣體積的逐漸增加，流出液中的總?cè)茲舛瘸尸F(xiàn)先平緩后快速上升，最后又平緩上升的趨勢。當(dāng)流出液為15 mL時，流出液中總?cè)频臐舛壬仙缴蠘右嚎側(cè)茲舛鹊?/10，達到泄露點[11]，隨后總?cè)崎_始大量泄露，因此選擇15 mL 為上樣液體積。當(dāng)流出液體積為60 mL 后，流出液總?cè)茲舛戎饾u與上樣液總?cè)茲舛冉咏?，因此上樣液體積最大不應(yīng)超過60 mL。
圖8 大孔樹脂動態(tài)吸附曲線Fig.8 Dynamic adsorption curve of microporous resin
2.6.1.3 洗脫液的選擇 不同乙醇濃度的解吸曲線如圖9 所示。由圖9 可知，當(dāng)乙醇濃度為70%和90%時，均能夠迅速將吸附的三萜洗脫下來，在洗脫液通過體積為20 mL 時達到高峰，洗脫液體積為50 mL時，被吸附的三萜類化合物基本被洗脫，洗脫曲線出峰快，無明顯拖尾現(xiàn)象，而乙醇濃度較低時，三萜難以被洗脫。因此為了節(jié)約試劑，并提高純化效率，選擇70%的乙醇進行洗脫，洗脫液體積為50 mL。
圖9 不同乙醇濃度時大孔樹脂的洗脫曲線Fig.9 Elution curves of macroporous resin at different ethanol concentrations
2.6.2 大孔樹脂純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)铺崛∫旱墓に?在以上優(yōu)化的純化條件下純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)拼痔嵛?，?jīng)測定計算得純化前后總?cè)频募兌扔?.52%提高至29.93%，回收率為81.25%。實驗結(jié)果表明D101 型大孔樹脂能夠用于純化準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)疲厥章瘦^高，但純化效果一般，提取物中仍含有其他成分，說明大孔樹脂只能除去一部分雜質(zhì)，并不能達到精制的目的，若想得到純度高的總?cè)萍兓铮€需進行二次純化。
3 結(jié)論
通過設(shè)計正交試驗和響應(yīng)面試驗確定準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频淖顑?yōu)提取條件為纖維素酶、果膠酶和木瓜蛋白酶的添加量分別為4%、4%和2%，料液比為1:24 g/mL，溫度51 ℃，pH 為4.5，酶解76 min，提取量為（36.570±0.332）mg/g，通過超聲再次提取后，總?cè)铺崛×窟_到（53.782±0.673）mg/g,說明酶-超聲分步提取法能夠顯著提高準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频奶崛×?。其次，通過D101 型大孔樹脂確定純化工藝為：上樣液濃度為6 mg/mL，流速：1 mL/min，上樣量：15 mL，洗脫條件為50 mL，70%乙醇，純化后的準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频募兌瓤蛇_29.93%，回收率為81.25%，說明大孔樹脂可以除去一部分雜質(zhì)，提高準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频募兌?，但若想得到純度更高的三萜純化物，還需進一步純化精制。以上提取工藝和純化工藝的建立，均為準(zhǔn)噶爾山楂總?cè)频某煞盅芯亢透患峁┝诵碌膶嶒炓罁?jù)，而且方法條件溫和，效率高且穩(wěn)定性好。實驗只針對提取的酶解部分進行了條件優(yōu)化，對超聲部分的提取條件還有待進一步優(yōu)化，同時還需要對大孔樹脂純化后的純化物進行進一步精制，并對其純化前后的生物活性進一步研究。
? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
猜你喜歡
英語文摘(2022年4期)2022-06-05 07:45:18
中學(xué)生數(shù)理化·八年級物理人教版(2022年3期)2022-03-16 05:55:08
當(dāng)代陜西(2021年2期)2021-03-29 07:41:24
家庭影院技術(shù)(2020年10期)2020-12-14 07:54:18
媽媽寶寶(2017年3期)2017-02-21 01:22:28
中國塑料(2016年3期)2016-06-15 20:30:00
通信電源技術(shù)(2016年3期)2016-03-26 07:13:38
知識經(jīng)濟·中國直銷(2016年3期)2016-02-27 16:15:49
現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志(2014年6期)2014-02-02 03:02:04
