劉 璐，李晶峰，蘭 夢，李冬冰，張凱月，王躍龍，申嘉明，李春楠，張 輝,*，孫佳明,*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）

牡蠣為牡蠣科動物長牡蠣（Ostrea gigasThunberg）、大連灣牡蠣（Ostrea talienwhanensisCrosse ）或近江牡蠣（Ostrea rivularisGould）的貝殼，素有“海洋牛奶”的美譽(yù)，富含豐富的蛋白質(zhì)、多糖、?；撬岬任镔|(zhì)[1]，其中牡蠣蛋白是牡蠣最重要的營養(yǎng)來源[2]。牡蠣殼約占牡蠣總重量的60%[3-4]，雖其主要成分為碳酸鈣，但其棱柱層中富含豐富的蛋白質(zhì)[5-6]。我國每年會產(chǎn)生數(shù)以萬計(jì)的牡蠣殼廢料[7]，不僅會對自然環(huán)境產(chǎn)生影響，同時也會對自然資源造成浪費(fèi)，因此針對牡蠣殼的再利用迫在眉睫。

牡蠣補(bǔ)腎益精的功效在多本醫(yī)術(shù)中均有記載，《名醫(yī)別錄》中記載牡蠣能“療瀉精”，《本草經(jīng)疏》指出牡蠣能“斂澀精氣”，《海藥本草》指出牡蠣“主男子遺精”。Zhang 等[8]研究發(fā)現(xiàn)牡蠣肉提取物可提高雷公藤內(nèi)酯（TP）誘導(dǎo)的小鼠睪丸損傷模型的精子數(shù)量和活力，降低丙二醛（MDA）水平，增加抗氧化酶（SOD 和GPH-Px）活性，對睪丸損傷具有保護(hù)作用。葉賢英[9]研究發(fā)現(xiàn)近江牡蠣多糖能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬顯著改善氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。

生物活性肽是指具有豐富生物學(xué)活性的肽類化合物。近年來，通過生物活性肽開發(fā)為高附加值食品在世界范圍內(nèi)越來越受到關(guān)注。常見的提取生物活性肽的方法有化學(xué)提取法、酶解法、微生物提取法[10-11]等，其中化學(xué)提取法水解條件難以控制，蛋白質(zhì)易變性[12]；微生物提取法的代謝過程復(fù)雜，產(chǎn)物難以控制[13]；而酶解法條件溫和、安全性高，酶解反應(yīng)沒有副反應(yīng)且不會降低蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值而被廣泛應(yīng)用。Liao 等[14]通過木瓜蛋白酶水解得到了中華鱉甲殼肽，且對血管緊張素I 轉(zhuǎn)換酶的抑制活性較強(qiáng)。王振杰[15]采用響應(yīng)法優(yōu)化雜色蛤多肽的酶法制備工藝，得到的酶解肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

因此，本實(shí)驗(yàn)選用模擬消化道酸堿環(huán)境的兩種酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行仿生酶解，以期模擬蛋白質(zhì)大分子在人體消化過程，通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳酶解條件，制備牡蠣蛋白酶解肽，并探究其對小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌和氧化應(yīng)激的影響，為牡蠣蛋白酶解肽的合理開發(fā)和牡蠣資源的合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 長春市同鑫海鮮市場；胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 百克賽斯生物科技（鎮(zhèn)江）有限公司；茚三酮 廣州和為醫(yī)藥科技有限公司；牛血清白蛋白、DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Gibco 公司；小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞TM3 上海弘順生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（MTT） 上海炎熙生物可以有限公司；4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色液 上海碧云天生物科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO） 陜西養(yǎng)元神生物科技有限公司；小鼠睪酮ELISA 檢測試劑盒、SOD、MDA 測定試劑盒 黃石科研生物科技有限公司；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

WP-UP-III-40 超純水機(jī) 四川沃特爾科技發(fā)展有限公司；85-2A 雙數(shù)顯恒溫磁力加熱攪拌器 金壇區(qū)西城新瑞儀器廠；GIPP-FD-3 冷凍干燥機(jī) 上海繼譜電子科技有限公司；L-8900 型氨基酸自動分析儀 日本日立公司；C3-6550-01 酶標(biāo)儀 日本ASONE公司；CKX 53 倒置熒光生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡蠣蛋白的制備 取牡蠣適量，洗凈后在通風(fēng)處陰干，粉碎過20 目篩，以料液比1:5 g/mL 加入蒸餾水，冷浸法提取12 h，共提取3 次，合并提取液[16]，3600 r/min 離心15 min，將上清液在冷阱溫度-50 ℃和真空度10～12 Pa 條件下真空冷凍干燥，即得牡蠣蛋白凍干粉，備用。

1.2.2 牡蠣蛋白含量測定 參考Lowry 法測定牡蠣蛋白含量[17]。標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：精密稱取2.0 mg 牛血清白蛋白（BSA）于10 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 于干燥試管中，每管補(bǔ)充蒸餾水至1.0 mL。分別加入堿性銅試液1 mL，搖勻，加入福林酚試液4 mL，立即搖勻，置55 ℃水浴中反應(yīng)5 min，取出，置冷水浴中10 min，以0 號管做空白，測定其在650 nm 處的吸光度值，以吸光度為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品測定：將牡蠣蛋白凍干粉待測樣品配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 溶液，照標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作項(xiàng)下的方法，測定牡蠣蛋白含量，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算供試品中蛋白質(zhì)的含量。

1.2.3 牡蠣蛋白酶解工藝 為模擬人的消化道環(huán)境，將酶解固定條件設(shè)為溫度37 ℃，胃蛋白酶酶解pH 為2.0，胰蛋白酶酶解pH 為8.0[18]。稱取適量牡蠣蛋白凍干粉，以料液比1:10 g/mL 加入蒸餾水，于恒溫磁力攪拌器中攪拌，加入1.0%的胃蛋白酶酶解1.0 h 后加入2.0%的胰蛋白酶酶解3.0 h，期間加入1 mol/L NaOH 或HCl 使溶液維持在酶的最適pH[19]，酶解結(jié)束后轉(zhuǎn)入100 ℃沸水中滅活15 min，以3600 r/min 離心15 min，取其上清液在冷阱溫度-50 ℃和真空度10～12 Pa 條件下真空冷凍干燥，即得牡蠣蛋白酶解肽凍干粉，備用。

1.2.4 牡蠣蛋白酶解工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn) 以水解度為指標(biāo)，考察酶用量對水解效果的影響。在固定料液比為1:10 g/mL，胃蛋白酶酶解時間為1.0 h，胰蛋白酶用量為2.0%、酶解時間為3.0 h 的基礎(chǔ)上，研究胃蛋白酶量在0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%時對水解度的影響；在固定料液比為1:10 g/mL，胃蛋白酶用量為1.0%、酶解時間為1.0 h，胰蛋白酶酶解時間為3.0 h 的基礎(chǔ)上，研究胰蛋白酶量1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%對水解度的影響。

考察酶解時間對水解效果的影響。在固定料液比為1:10 g/mL，胃蛋白酶用量為1.0%，胰蛋白酶用量為2.0%、酶解時間為3.0 h 的基礎(chǔ)上，研究胃蛋白酶酶解時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 對水解度的影響；在固定料液比為1:10 g/mL，胃蛋白酶用量為1.0%、酶解時間為1.0 h，胰蛋白酶用量為2.0%，研究胰蛋白酶酶解時間1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h 對水解度的影響。

考察料液比對水解效果的影響。在固定胃蛋白酶用量為1.0%、酶解時間為1.0 h，胰蛋白酶用量為2.0%、酶解時間為3.0 h 的基礎(chǔ)上，研究料液比在1:6、1:8、1:10、1:12、1:14 g/mL 時對水解度的影響。

1.2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) Box-Behnken 設(shè)計(jì)（BBD）因其不包含嵌入的因子或分?jǐn)?shù)因子設(shè)計(jì)，所以被稱為獨(dú)立的二次設(shè)計(jì)。在這種設(shè)計(jì)中，處理組合位于工藝空間邊緣的中點(diǎn)和中心[20]。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取胰胃蛋白酶量（A），胃蛋白酶量（B）和胰蛋白酶酶解時間（C）為自變量，選取水解度（Y）作為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 Box-Behnken 試驗(yàn)因素與水平Table 1 Box-Behnken test factors and horizontal

1.2.4.3 水解度的測定 參照劉麗紅等[21]等的方法測定水解度，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方為：y=1.8327x-0.0163，R2=0.9949，x 為完全水解液的濃度μg/mL，y 為測得的吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線可以計(jì)算出蛋白質(zhì)量，帶入下列公式中計(jì)算可得到牡蠣蛋白酶解肽的水解度：

其中：A 為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的待測溶液中的蛋白質(zhì)量，mg；V1水解液的總體積，mL；W 為實(shí)驗(yàn)中稱取的樣品質(zhì)量，g；V2表示所用稀釋液的體積，mL。

1.2.5 牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞存活率、睪酮分泌及氧化應(yīng)激水平的影響

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及造模 將凍存的TM3 細(xì)胞在37 ℃的水中快速解凍后離心，棄去上清液加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液混懸，混懸后將其轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶中，并補(bǔ)足培養(yǎng)基，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃，含有5% CO2）中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞將其密度稀釋為4×103個/mL 后接種于96 孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后將細(xì)胞分為空白組、模型組和給藥組，模型組、給藥組加入200 μL 含有H2O2（5 μmol/L）培養(yǎng)基[22]，PBS 緩沖液作為空白組。

1.2.5.2 MTT 法測定細(xì)胞存活率 TM3 細(xì)胞按“1.2.5.1”項(xiàng)下培養(yǎng)4 h 后，各給藥組加入相應(yīng)濃度的牡蠣蛋白酶解肽（50、100、200、300、400 μg/mL），每組設(shè)置3 個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h 后，培養(yǎng)板每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT，4 h 后吸出上清液，加入DMSO 150 μL，振搖10 min 至結(jié)晶物完全溶解，通過酶標(biāo)儀于490 nm 波長處測定各孔吸光度，計(jì)算細(xì)胞存活率，公式如下：

1.2.5.3 DAPI 染色 將細(xì)胞密度稀釋為3×105個/mL后接種于6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，按照“1.2.5.1”的方法設(shè)定空白組、模型組和給藥組，給藥組加入相應(yīng)濃度的牡蠣蛋白酶解肽（50、100、200、300、400 μg/mL），培養(yǎng)48 h 后，每孔加入DAPI 染色液5 μL，放入培養(yǎng)箱中孵育20 min，棄去染色液，PBS洗滌2 次，在熒光顯微鏡下隨機(jī)選取視野拍照。

1.2.5.4 牡蠣蛋白酶解肽對睪酮分泌量和氧化應(yīng)激水平的影響 空白組、模型組、給藥組設(shè)定方法同“1.2.5.1”。給藥組加入相應(yīng)濃度的牡蠣蛋白酶解肽（100、200、300 μg/mL），培養(yǎng)24 h 后，吸出上清液，按睪酮、SOD、MDA 試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.2.6 牡蠣蛋白酶解肽氨基酸組成 取牡蠣蛋白酶解肽凍干粉10 mg 加入10 mL 6 mol/L 的HCl，置于130 ℃烘箱中水解24 h，得到牡蠣蛋白酶解肽完全水解液，將水解液蒸干并加水反復(fù)蒸干3 次后溶于1 mL 0.02 mol/L 的HCl 中，于氨基酸自動檢測儀中檢測氨基酸含量[23]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用Design Expert 13.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析，采用GraphPad Prism 8 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析及繪圖，應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以xˉ±s 表示，所有試驗(yàn)重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 牡蠣蛋白含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=2.7972x+0.0228，R2=0.9973，x 為牛血清白蛋白質(zhì)量濃度mg/mL，y 為測得的吸光度值，計(jì)算得牡蠣蛋白凍干粉的蛋白含量為11.04%±0.54%。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 蛋白酶用量對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響 蛋白酶用量對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響如圖1所示。當(dāng)胃蛋白酶量為1.0%，胰蛋白酶量為2.0%時，水解程度達(dá)到最大，分別為34.98%、35.07%。這可能是因?yàn)殡S著酶濃度的增大，底物與酶接觸的概率增加，使水解度增加。當(dāng)胃蛋白酶用量＞1.0%，胰蛋白酶用量＞2.0%時，水解度有下降的趨勢?？赡芤?yàn)槊傅鞍酌噶吭黾雍?，水解速度加快，產(chǎn)生的小分子肽會和底物競爭與酶結(jié)合，導(dǎo)致牡蠣蛋白與酶作用概率大大減小，從而水解度降低[24-25]。當(dāng)水解度達(dá)到最大值時，繼續(xù)增加酶用量，水解度顯著降低（P＜0.05）。因此，使用0.5%～1.5%的胃蛋白酶和1.5%～2.5%的胰蛋白酶進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 酶用量對水解度的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree

2.2.2 酶解時間對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響 酶解時間對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響如圖2 所示。當(dāng)胃蛋白酶酶解時間達(dá)到1.0 h，胰蛋白酶酶解時間達(dá)到3.0 h 時，水解程度達(dá)到最大，分別為35.13%、37.26%，這可能因?yàn)樵谒馇捌陔S著酶解時間的增加，底物與酶反應(yīng)更徹底，從而水解度增大。當(dāng)胃蛋白酶酶解時間＞1.0 h，胰蛋白酶酶解時間＞3.0 h 時，水解度有下降趨勢，這可能是因?yàn)槊附鈺r間的延長，酶解反應(yīng)體系中酶解物濃度增大，使酶解體系變稠，不適合酶解反應(yīng)進(jìn)行，使水解度降低[26]。當(dāng)胃蛋白酶酶解時間為1.5 h 時，水解度與1.0 h 時相比沒有顯著性變化（P＞0.05），當(dāng)水解度達(dá)到最大值時，繼續(xù)增加胰蛋白酶酶解時間，水解度顯著降低（P＜0.05）。所以在后續(xù)的響應(yīng)面試驗(yàn)中未選擇胃蛋白酶酶解時間作為優(yōu)化因素，以胃蛋白酶酶解1.0 h 作為固定條件，選擇胰蛋白酶酶解2.5～3.5 h 對牡蠣蛋白酶解肽進(jìn)行酶解。

2.2.3 料液比對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響 料液比對牡蠣蛋白酶解肽水解度的影響如圖3 所示。當(dāng)料液比達(dá)到1:10 g/mL 時，水解度達(dá)到最大為34.72%。料液比的變化即是底物濃度的變化，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?:6、1:8 g/mL 時，底物濃度較大，導(dǎo)致底物與蛋白酶之間擴(kuò)散與運(yùn)動受到限制[27-28]，使酶解不完全。當(dāng)?shù)孜餄舛龋?:10 g/mL 時，水解度開始降低，這可能是因?yàn)榇藭r底物濃度過小導(dǎo)致底物與酶的碰撞機(jī)會變少，酶未被完全飽和。當(dāng)水解度達(dá)到最大值時繼續(xù)改變料液比，水解度顯著降低（P＜0.05），但其對水解度的總體趨勢較為平緩，故未在后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)中選擇料液比作為優(yōu)化因素，使用料液比1:10 g/mL作為固定條件。

2.3 Box-Benhnken 試驗(yàn)優(yōu)化分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。兩個因素之間交互作用結(jié)果見圖4，得到以水解度為目標(biāo)的（Y）預(yù)測值對所選自變量的回歸方程：Y=38.252+2.98125 A+4.9875B+1.06375C+0.225AB+0.3925AC+0.785BC-5.58475A2-10.36725B2-3.59975C2。

圖4 各因素的交互作用影響Fig.4 Interaction influence of various factors

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experimental

由表3 可知，方程二次多項(xiàng)式回歸模型P＜0.001，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），模型的R2=0.9835，說明該模型可解釋98.35%的水解度變化，R2adj=0.9622，表明試驗(yàn)結(jié)果與模型擬合度好，該模型可用于優(yōu)化牡蠣的酶解工藝。由F值及相應(yīng)曲面坡度可知各因素的影響大小為B＞A＞C，即胃蛋白酶用量對牡蠣肽水解度影響最大。通過P值可以看出AC、BC 因素交互作用較強(qiáng)。

表3 水解度顯著性檢驗(yàn)及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of hydrolysis degree

通過Design-Expert 13 軟件得到了最佳工藝條件優(yōu)化的組合為料液比1:10 g/mL，胃蛋白酶量1.13%，酶解時間1.0 h，胰蛋白酶量2.14%，酶解時間為3.09 h,在此基礎(chǔ)上的水解度預(yù)測值為39.40%?？紤]到實(shí)驗(yàn)的操作情況選取胰蛋白酶量2.1%，胃蛋白酶量1.1%，胰蛋白酶酶解時間3.1 h，驗(yàn)證模型預(yù)測的準(zhǔn)確性。進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)，水解度為39.43%±0.42%，與預(yù)測值無明顯差異。綜上，采用響應(yīng)面的方法優(yōu)化牡蠣仿生酶解工藝是可行的。

2.4 牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞存活率的影響

由圖5 可知，H2O2誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞與空白組細(xì)胞相比，存活率極顯著下降（P＜0.01），表明氧化損傷模型造模成功。與H2O2模型組相比，50～400 μg/mL質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞存活率的影響呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)牡蠣蛋白酶解肽的質(zhì)量濃度為100 μg/mL 時，對TM3 細(xì)胞增殖影響顯著（P＜0.05）；當(dāng)牡蠣蛋白酶解肽的質(zhì)量濃度為200～400 μg/mL 時，對TM3 細(xì)胞增殖影響極顯著（P＜0.01），且300 μg/mL 質(zhì)量濃度的牡蠣肽對TM3細(xì)胞存活率最大達(dá)93.25%。隨著牡蠣蛋白酶解肽質(zhì)量濃度的繼續(xù)增加，存活率開始下降，故選擇100～300 μg/mL 的牡蠣蛋白酶解肽進(jìn)行進(jìn)一步研究。

圖5 不同質(zhì)量濃度牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞存活率的影響Fig.5 Effects of oyster protein enzymolysis peptides with different concentration on the survival rate of TM3 cells

2.5 DAPI 染色結(jié)果

由圖6 可知，與模型組相比，不同質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解肽處理過的TM3 細(xì)胞數(shù)量發(fā)生明顯變化，質(zhì)量濃度為300 μg/mL 時，細(xì)胞數(shù)量最多，與細(xì)胞存活率的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

圖6 DAPI 染色觀察Fig.6 DAPI staining observation

2.6 牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞睪酮分泌量的影響

睪丸間質(zhì)細(xì)胞的主要功能是合成和分泌睪酮，睪酮是促進(jìn)睪丸和前列腺等男性生殖組織發(fā)育以及維持精子發(fā)生和第二性征的重要激素，維系著男性正常的生殖功能[29-30]。由圖7 可知，與模型組比較，給藥24 h 后200、300 μg/mL 質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解肽極顯著增加了TM3 細(xì)胞的睪酮分泌量（P＜0.01），且質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時睪酮分泌量達(dá)到最大，為20.43 ng/mL，表明了牡蠣蛋白酶解肽有一定的補(bǔ)腎作用。200 μg/mL 的牡蠣蛋白酶解肽睪酮分泌量最多，而細(xì)胞存活率的最佳濃度為300 μg/mL，這二者的濃度并不一致，推測牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞的增殖作用可能還伴隨著其他物質(zhì)的分泌來發(fā)揮藥效。

圖7 不同質(zhì)量濃度牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞睪酮分泌量的影響Fig.7 Effects of oyster protein enzymolysis peptides with different concentration on testosterone secretion in TM3 cells

2.7 牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞SOD 酶活力、MDA含量的影響

TM3 細(xì)胞內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激是睪酮水平下降的重要原因，睪酮的分泌需要保證細(xì)胞內(nèi)合適的氧化環(huán)境[31]。超氧化物歧化酶（SOD）可以催化超氧自由基歧化為過氧化氫和氧氣，去除細(xì)胞中自由基[32]，常表征機(jī)體抗氧化水平[33]，SOD 酶活力較低代表著嚴(yán)重的氧化應(yīng)激水平。丙二醛（MDA）是一種機(jī)體過氧化的重要最終產(chǎn)物[34]，其含量可有效地反映機(jī)體組織中脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度及速率，已被廣泛用于評估氧化應(yīng)激的水平[35]，高含量的MDA 濃度代表著嚴(yán)重的氧化應(yīng)激水平[36]。二者常用來評價(jià)氧化應(yīng)激水平。

由圖8 和圖9 可知，與模型組相比，200、300 μg/mL 牡蠣蛋白酶解肽極顯著提高SOD 酶活力（P＜0.01），極顯著降低MDA 含量（P＜0.01），且質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時，SOD 酶活力最高，為12.85 ng/mL，MDA 含量最低，為6.59 nmol/mL，可以認(rèn)定牡蠣蛋白酶解肽可以平衡細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的最佳濃度與細(xì)胞存活率最佳濃度不一致，推測牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞的增殖作用不僅僅是調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激這一個途徑。

圖8 不同質(zhì)量濃度牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞SOD活性的影響Fig.8 Effects of oyster protein enzymolysis peptides with different concentration on SOD activity of TM3 cells

圖9 不同質(zhì)量濃度牡蠣蛋白酶解肽對TM3 細(xì)胞MDA濃度的影響Fig.9 Effects of oyster protein enzymolysis peptides with different concentration on MDA concentration in TM3 cells

結(jié)果表明，牡蠣蛋白酶解肽濃度為200 μg/mL時，睪酮分泌量達(dá)到最大值且此時細(xì)胞內(nèi)氧化環(huán)境最好。

2.8 牡蠣蛋白酶解肽氨基酸的組成

由表4 可知，牡蠣蛋白酶解肽中含有17 種氨基酸，其中甘氨酸的含量最高，精氨酸的含量次之。Liu 等[37]研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸減輕了氟化鈉誘導(dǎo)的豬睪丸細(xì)胞的氧化應(yīng)激，細(xì)胞凋亡和衰老。初步認(rèn)為甘氨酸可以防止機(jī)體氧化損傷和細(xì)胞凋亡。El-Shalofy等[38]研究發(fā)現(xiàn)肌肉注射精氨酸可以增強(qiáng)熱應(yīng)激公羊中的血漿睪酮和一氧化氮濃度。初步認(rèn)定精氨酸可以降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的程度并且維持細(xì)胞內(nèi)ATP的穩(wěn)定[39-40]。研究表明，賴氨酸、精氨酸、脯氨酸等氨基酸都具有抗氧化活性，在維持機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有著重要作用[41]。牡蠣蛋白酶解肽中甘氨酸和精氨酸含量較高，因此能夠極顯著增加（P＜0.01）TM3細(xì)胞的SOD 酶活力與睪酮分泌量，極顯著降低（P＜0.01）MDA 含量。

表4 牡蠣蛋白酶解肽氨基酸組成（n=6）Table 4 Amino acid composition of oyster protein peptides(n=6)

3 結(jié)論

本研究以牡蠣殼為原料，冷浸法提取牡蠣蛋白，確定最佳酶解工藝為：溫度37 ℃，料液比1:10 g/mL，胃蛋白酶量1.1%，酶解時間1.0 h，pH 2.0，胰蛋白酶量2.1%，酶解時間3.1 h，pH 8.0，制備牡蠣蛋白酶解肽，水解度達(dá)最大值為39.43%±0.42%。同時，本研究發(fā)現(xiàn)300 μg/mL 質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解肽對H2O2誘導(dǎo)的TM3 細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的增值活性，200 μg/mL 質(zhì)量濃度的牡蠣蛋白酶解肽能夠極顯著的增加睪酮分泌，增強(qiáng)SOD 酶活力，降低MDA 水平（P＜0.01)，表明牡蠣蛋白酶解肽對促進(jìn)TM3 細(xì)胞分泌睪酮，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)具有一定的作用。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)為實(shí)現(xiàn)廢棄牡蠣殼的資源化及牡蠣蛋白酶解肽在食品、保健品領(lǐng)域內(nèi)的開發(fā)提供合理依據(jù)。

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