劉鑫燕，李占峰，彭幫柱,

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430000；2.漯河微康生物科技有限公司，河南漯河 462300）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata），又稱(chēng)皺環(huán)球蓋菇和酒紅大球蓋菇，屬于擔(dān)子菌門(mén)，層菌綱，傘菌目，球蓋菇科，球蓋菇屬[1-2]，因其廣泛的藥用價(jià)值，被稱(chēng)為“山中珍品”[3]。大球蓋菇作為我國(guó)食用菌產(chǎn)業(yè)的后起之秀，2010 年在我國(guó)產(chǎn)量為4.74 萬(wàn)噸，到2020 年增長(zhǎng)到了20.10 萬(wàn)噸，2021 年產(chǎn)量約28.75萬(wàn)噸[4]。

有研究表明，在杏鮑菇、平菇和香菇貯藏過(guò)程中均檢測(cè)到酵母菌和霉菌，且平均計(jì)數(shù)分別為3.2 和3.4 log CFU/g[5]。Santana 等[6]發(fā)現(xiàn)香菇在儲(chǔ)藏過(guò)程中的致腐微生物為霉菌、假單胞菌、嗜溫菌及酵母。姜天甲[7]發(fā)現(xiàn)平菇和金針菇易受霉菌和酵母菌的侵染腐敗而失去商品價(jià)值。朱曉玲[8]對(duì)二次培養(yǎng)后受霉菌污染的香菇菌塊進(jìn)行分離純化，得到木霉屬、短密青霉（Penicillium brevicompactum）和總狀毛霉（Mucor racemosus）。馮智紅[9]和崔麗紅[10]在香菇和香菇菌棒上分離到不同種類(lèi)的鐮刀菌、曲霉和根霉。蘭玉菲等[11]在罹病香菇菌棒中曾發(fā)現(xiàn)七種曲霉和米根霉（Rhizopus oryzae）。由此可見(jiàn)，不同種類(lèi)的食用菌其優(yōu)勢(shì)腐敗菌各不相同，霉菌占比較多。其中曲霉和根霉是食品發(fā)酵工業(yè)中常用的菌種，在腐敗變質(zhì)的食用菌中也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)該菌[12]。此外，鐮刀菌也是一個(gè)龐大而復(fù)雜的屬，可引起多種植物疾病，產(chǎn)生單端孢霉烯族毒素類(lèi)等真菌毒素，并日益被認(rèn)為是一種重要的人類(lèi)病原體[13]，易對(duì)人體健康造成危害。

目前國(guó)內(nèi)外針對(duì)大球蓋菇腐敗菌的分離、鑒定研究較少。因此，為了解大球蓋菇在貯藏時(shí)的優(yōu)勢(shì)腐敗真菌，預(yù)防和控制大球蓋菇在貯運(yùn)過(guò)程中發(fā)生腐敗問(wèn)題，本文將儲(chǔ)藏至腐敗的新鮮大球蓋菇用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法與ITS 測(cè)序及分析方法對(duì)腐敗菌進(jìn)行分離、純化和鑒定，篩選出優(yōu)勢(shì)腐敗菌并研究其生長(zhǎng)特性，以期為后續(xù)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖及大球蓋菇的貯藏保鮮提供一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大球蓋菇 湖北省武漢市蔡甸區(qū)蘑菇蜀黍食用菌基地和河南省洛陽(yáng)市智慧食用菌產(chǎn)業(yè)園提供；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）、馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)（PDB） 青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；Tris-酚 上海鈺博生物科技有限公司；氯仿、75%酒精、異戊醇 分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

DEM 生物顯微鏡 上海萊卡顯微系統(tǒng)有限公司；ABI 2720 PCR 儀 上海普迪生物技術(shù)有限公司；HZQ-F160 生化培養(yǎng)箱 太倉(cāng)市華美生化儀器廠；GYMJ-436 高壓滅菌鍋 上海東亞壓力容器制造有限公司；SCI-VS 漩渦混合器 寧波新芝生物科技股份有限公司；D1008E 小型離心機(jī) 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；96 孔核酸提取儀 武漢納磁生物科技有限公司；NanoDrop 8000 超微量分光光度計(jì) 賽默飛世爾科技公司；DYY-6C 電泳儀 北京六一生物科技有限公司；GelDocTMXR+紫外分析儀伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；3730xl 測(cè)序儀 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)中國(guó)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大球蓋菇腐敗時(shí)間的確定 將兩批產(chǎn)地不同（湖北武漢、河南洛陽(yáng)）的新鮮大球蓋菇同時(shí)放入消毒后的聚乙烯塑料保鮮盒中，于4 ℃條件下敞口保存，通過(guò)感官評(píng)價(jià)來(lái)確定大球蓋菇的腐敗時(shí)間點(diǎn)。感官評(píng)價(jià)小組針對(duì)大球蓋菇的氣味、色澤、菌蓋和菌柄形態(tài)打分，并對(duì)腐敗特征進(jìn)行描述，最后計(jì)算平均分。當(dāng)任一指標(biāo)評(píng)分低于5 分為感官接受臨界點(diǎn)，低于5 分表示該樣品感官品質(zhì)不可接受[14-15]。參考商立超[16]的方法，制定了感官指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)表（表1）。

表1 大球蓋菇感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria for the sensual sense of S. rugosoannulata

1.2.2 大球蓋菇腐敗菌的分離與純化 參照牛耀星[17]的方法并略作修改。取大球蓋菇腐敗組織接種于PDA 培養(yǎng)基上，放入26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5 d。挑取具有代表性的菌落邊緣菌絲接種到新的PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)，重復(fù)2～3 次以確保得到純化菌株。

1.2.3 大球蓋菇腐敗菌的鑒定

1.2.3.1 致腐性分析 參照王瑩[18]的方法并略作修改。按照柯赫準(zhǔn)則進(jìn)行返接試驗(yàn)以驗(yàn)證菌株的致腐能力。用直徑為5 mm 的打孔器取腐敗菌菌絲塊，分別在新鮮大球蓋菇的菌柄和菌蓋處接種，于26 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察接種處的變化。每組處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，另設(shè)不接種菌株的大球蓋菇作為對(duì)照。在培養(yǎng)5 d 后觀察每組大球蓋菇的腐敗情況、腐敗速度及腐敗癥狀，并按照1.2.2 的方法在子實(shí)體腐敗處分離純化腐敗菌，與所接種菌株進(jìn)行比較，判斷接種菌株是否為大球蓋菇的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

1.2.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定 將優(yōu)勢(shì)腐敗菌接種于PDA 平板上，于26 ℃下恒溫培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后對(duì)菌落形態(tài)、質(zhì)地、正反顏色等性狀進(jìn)行觀察。在倒置顯微鏡下觀察菌絲、孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子的形態(tài)和大小，記錄觀察結(jié)果并拍照，根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》[19]對(duì)真菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 將純化后的菌株送至武漢天一華煜基因科技有限公司，委托公司測(cè)序鑒定。主要操作步驟如下：a.DNA 提?。翰捎肅TAB 方法提取菌絲DNA，電泳檢測(cè)合格后于-20 ℃冰箱中保存待用。b.PCR 擴(kuò)增：分別使用真菌rDNA ITS 的通用引 物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）對(duì)菌株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系及程序見(jiàn)表2。為確保PCR 擴(kuò)增的特異性，將擴(kuò)增完成后的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（1%濃度），通過(guò)帶型來(lái)判斷各樣本擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。c.DNA 測(cè)序：將條帶符合標(biāo)準(zhǔn)的PCR 產(chǎn)物送Sanger 測(cè)序。處理后的序列 在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov.）中進(jìn)行BLAST 分析，比較其同源性。d.系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建：將測(cè)得的ITS 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）中已有的ITS 序列進(jìn)行比對(duì)，將同源性＞97%的物種名稱(chēng)、基因登錄號(hào)和序列號(hào)保存。利用軟件MEGA5 中的鄰接法（Neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)自展法（Bootstrap）檢驗(yàn)，重復(fù)次數(shù)為1000 次。

表2 PCR 反應(yīng)體系和循環(huán)條件Table 2 PCR reaction system and cycling conditions

1.2.4 大球蓋菇腐敗菌的生長(zhǎng)特性研究

1.2.4.1 腐敗菌生長(zhǎng)曲線的繪制 采用干重法[20-21]測(cè)定腐敗菌的生長(zhǎng)曲線。在無(wú)菌條件下制備優(yōu)勢(shì)腐敗菌的孢子懸液，并將其濃度調(diào)為106CFU/mL。取1 mL 接種于200 mL PDB 培養(yǎng)液中，在26 ℃、180 r/min 恒溫箱中培養(yǎng)，于4 ℃，10000 r/min 下離心20 min，將沉淀放入105 ℃干燥箱中烘干至恒重，記錄菌絲干重。每種腐敗菌做3 個(gè)平行，每隔12 h測(cè)一次，直至達(dá)到腐敗菌的穩(wěn)定期。

1.2.4.2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 參照石浩[22]的方法并略作修改。將直徑為5 mm 的菌餅接種于PDA 培養(yǎng)基中，設(shè)置4、5、10、15、20、25、28、30、35 ℃不同溫度，于不同溫度下培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理重復(fù)3 次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。

1.2.4.3 不同pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 參照石浩[22]的方法并略作修改。分別將PDA 培養(yǎng)基的pH 調(diào)整為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0。將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于PDA 培養(yǎng)基中，于26 ℃下培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理重復(fù)3 次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率。

1.2.4.4 腐敗菌致死溫度的測(cè)定 參照丁仁惠等[23]的方法并略作修改。將直徑為5 mm 的菌餅置于裝有5 mL 無(wú)菌水的離心管中并分別放入50～65 ℃（溫度梯度為5 ℃）的恒溫水浴鍋中處理30 min，迅速冷卻后接種在PDA 培養(yǎng)基中，以未經(jīng)處理的菌絲塊接種于PDA 培養(yǎng)基中作為空白對(duì)照，于26 ℃下培養(yǎng)5 d，每個(gè)處理重復(fù)3 次。采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，記錄菌絲密集度并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速率和菌絲抑制率（MGI）。菌絲生長(zhǎng)速率及MGI 計(jì)算公式如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均做3 次平行，使用Microsoft excel 2019 整理數(shù)據(jù)，Origin 2021 軟件作圖，IBM SPSS Statistics 26 進(jìn)行方差分析，Duncan’s 法進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05 為顯著性差異判別標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇腐敗時(shí)間的確定

大球蓋菇的感官評(píng)價(jià)如圖1 所示。貯藏于4 ℃的大球蓋菇在第8 d 時(shí)，除質(zhì)地外，其他指標(biāo)的感官評(píng)分均低于5，判斷腐敗時(shí)間為8 d。此時(shí)菌蓋開(kāi)傘明顯，組織稍微軟化，表面略微發(fā)黏并產(chǎn)生輕微異味。譚志勇等[24]報(bào)道稱(chēng)，貯藏于4 ℃冷庫(kù)的雞腿菇在第6 d 時(shí)各項(xiàng)指標(biāo)正常，8 d 后菌蓋開(kāi)始軟化、開(kāi)裂，但無(wú)異味，12 d 后菌蓋頂部開(kāi)始變黑并伴有明顯異味。姜紅波[25]研究發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)菇在5 ℃下貯藏8 d后便出現(xiàn)腐敗現(xiàn)象。本研究結(jié)果與上述結(jié)果接近。

圖1 大球蓋菇的感官評(píng)價(jià)雷達(dá)圖Fig.1 Ragar map of S. rugosoannulata sensory evaluation

2.2 大球蓋菇腐敗菌的分離與鑒定

通過(guò)傳統(tǒng)培養(yǎng)對(duì)兩批產(chǎn)地不同（湖北武漢、河南洛陽(yáng)）的大球蓋菇進(jìn)行腐敗菌的分離，共得到75 個(gè)菌株。其中鐮刀菌屬16 株、曲霉屬14 株，根霉屬4 株。通過(guò)致腐性分析，取其中致腐性較強(qiáng)的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定。

2.2.1 致腐性分析結(jié)果

2.2.1.1 子實(shí)體回接 將得到的菌株回接至健康的大球蓋菇子實(shí)體上，其對(duì)大球蓋菇子實(shí)體的生長(zhǎng)影響如圖2 所示。回接試驗(yàn)結(jié)果表明，其中四種菌株對(duì)大球蓋菇具有較強(qiáng)的致腐性，分別命名為X、Q、C 和A。健康的大球蓋菇子實(shí)體接種X 后，菌蓋處會(huì)產(chǎn)生凹陷，菌柄和菌蓋均產(chǎn)生白色腐爛病斑，并呈現(xiàn)水漬狀，組織軟爛；接種Q 后，菌柄和菌蓋嚴(yán)重黑化，5 d 后子實(shí)體逐漸變黑，接種處出現(xiàn)明顯凹陷且表面變得濕潤(rùn)，滲出黑色惡臭味汁液；接種C 后，菌蓋和菌柄表面均出現(xiàn)稠密的白色菌絲，5 d 后菌絲開(kāi)始蔓延至整個(gè)菌蓋；接種A 后，菌蓋、菌柄處出現(xiàn)明顯的腐敗現(xiàn)象，菌蓋收縮并產(chǎn)生腐敗汁液，菌柄處產(chǎn)生淡黃色病斑。而對(duì)照組中的大球蓋菇除了菌體表面顏色稍微加深外，并無(wú)其他癥狀，菇體質(zhì)地保持不變，無(wú)異味和汁液滲出。

圖2 健康子實(shí)體菌柄、菌蓋接種菌絲塊后的生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of healthy fruiting body stalks and caps inoculated with mycelium block

2.2.1.2 回接后腐敗菌的分離與對(duì)比 回接前后腐敗菌菌落形態(tài)對(duì)比如圖3 所示。結(jié)果證實(shí)上述四種腐敗菌對(duì)大球蓋菇子實(shí)體均有強(qiáng)烈致腐性。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)由回接致腐的子實(shí)體中分離、純化得到的腐敗菌（圖3x、q、c、a）與回接前的腐敗菌（圖3X、Q、C、A）一致，確定上述四種腐敗菌為大球蓋菇的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。

圖3 回接前后分離腐敗菌菌落形態(tài)對(duì)比Fig.3 Comparison of colony morphology of spoilage fungi before and after re-inoculation

2.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果 腐敗菌的菌落形態(tài)圖和顯微鏡觀察圖如圖4 和圖5 所示。菌株X 在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，菌落中央產(chǎn)生密集的白色棉絮狀氣生菌絲，呈放射狀蔓延至整個(gè)平板。菌落背面呈淡黃色。菌株多產(chǎn)生小型的無(wú)色分生孢子，多為卵形、橢圓形的單細(xì)胞，偶見(jiàn)雙胞；大型分生孢子多為3～5 分隔，兩端尖細(xì)彎曲，呈鐮刀形、紡錘形等。初步推測(cè)菌株X 屬于半知菌亞門(mén)，絲孢綱，瘤座孢目，瘤座孢科，鐮刀菌屬。

圖4 X，Q，C，A 四種腐敗菌菌落形態(tài)Fig.4 Colonial morphology of four spoilage fungi X,Q,C,A

圖5 X，Q，C，A 腐敗菌顯微形態(tài)觀察Fig.5 Microstructure morphology of spoilage fungi X,Q,C,A

菌株Q 在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，菌落生長(zhǎng)迅速，出現(xiàn)青褐色菌叢，表面平滑或粗糙。菌落背面呈褐色。菌絲結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多個(gè)分枝，是一種具有隔膜的多核多細(xì)胞真菌。其厚實(shí)的足細(xì)胞形成的分生孢子梗頂端膨大，呈囊狀。雙層小梗從泡囊表面或頂部呈放射狀生出，其頂端分布有串狀或“菊花”狀的青褐色分生孢子。初步推測(cè)菌株Q 為半知菌亞門(mén)，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬。

菌株C 在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d 后，形成初為白灰色后為灰褐色的菌落。菌落可以快速覆蓋平板表面，呈“棉花糖”狀生長(zhǎng)。菌落背面呈白色。菌絲體稠密，產(chǎn)生無(wú)色匍匐菌絲。假根分布錯(cuò)綜復(fù)雜，較發(fā)達(dá)。孢囊梗略微彎曲，其頂端有時(shí)膨大為球形或橢圓形的泡囊，有時(shí)產(chǎn)生褐色分枝。孢子囊和胞囊孢子均呈球形或近球形，老后呈暗褐色。可見(jiàn)大量形狀、大小不一的厚垣孢子，無(wú)接合孢子。初步推測(cè)為接合菌亞門(mén)，接合菌綱，毛霉目，毛霉科，根霉屬。

菌株A 在PDA 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，菌落生長(zhǎng)緩慢，一開(kāi)始呈白色，慢慢變成綠色，且中間夾雜淡黃色菌叢。菌落背面呈橘黃色。菌落直徑為2～4 cm，表面粗糙，邊界呈圓弧狀，中間凸起。菌絲有橫隔，頂端產(chǎn)雙輪或單輪掃帚狀的分生孢子梗。菌株產(chǎn)生的分生孢子呈球形或卵形，直徑為2.5～3.5 μm。初步推測(cè)為子囊菌亞門(mén)，不整囊菌綱，散囊菌目，散囊菌科，青霉屬。

以上僅是根據(jù)形態(tài)學(xué)鑒定方法推測(cè)所得結(jié)果，無(wú)法準(zhǔn)確判斷該菌的種類(lèi)，故需進(jìn)一步進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

2.2.3.1 PCR 擴(kuò)增 從四種純化的腐敗菌中提取DNA 后，以真菌ITS 通用引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，最終在2000 bp 附近檢測(cè)到單一且明亮的條帶，達(dá)到PCR 擴(kuò)增預(yù)期結(jié)果。腐敗菌ITS 區(qū)的凝膠電泳結(jié)果如圖6 所示。

圖6 腐敗菌ITS 區(qū)的凝膠電泳圖Fig.6 Gel electrophoresis of the ITS from spoilage fungi

2.2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建 將已進(jìn)行PCR 產(chǎn)物測(cè)序得到的腐敗菌基因序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的脫氧核糖核酸序列進(jìn)行比對(duì)，選擇與測(cè)序腐敗菌基因序列相似度最高（＞97%）的真菌，作為該菌株在分子生物學(xué)上的歸類(lèi)，并記錄其基因登錄號(hào)。四種腐敗菌的比對(duì)結(jié)果如表3 所示，通過(guò)鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖7 所示。結(jié)果進(jìn)一步表明，腐敗菌株X 與鐮刀菌屬（Fusariumsp.）的親緣關(guān)系最近，Q 與曲霉屬（Aspergillussp.）的親緣關(guān)系最近，C 與根霉屬（Rhizopussp.）的親緣關(guān)系最近，腐敗菌株A 與藍(lán)狀菌屬（Tala-romycessp.）的親緣關(guān)系最近，結(jié)合其形態(tài)特征與ITS 序列鑒定的結(jié)果，確定菌株X 為假嗜花鐮刀菌（Fusarium pseudoanthophilum），菌株Q 為黑曲霉（Aspergillus niger），菌株C 為單孢根霉菌（Rhizopus azygosporus），菌株A 為產(chǎn)紫藍(lán)狀菌（Talaromyces purpureogenus）。

圖7 X，Q，C，A 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.7 Phologenetic tree of X,Q,C,A

表3 真菌鑒定結(jié)果Table 3 Identification results of fungus

2.3 大球蓋菇腐敗菌的生長(zhǎng)特性研究

2.3.1 腐敗菌的生長(zhǎng)曲線 大球蓋菇腐敗菌的生長(zhǎng)曲線如圖8 所示。其中X 假嗜花鐮刀菌、Q 黑曲霉和C 單孢根霉菌在0～12 h 內(nèi)菌絲干重并無(wú)顯著差異（P＞0.05），處于生長(zhǎng)遲緩期；24～120 h 的菌絲干重顯著上升（P＜0.05），為生長(zhǎng)快速期；132 h 后的菌絲干重?zé)o顯著差異性（P＞0.05），進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期。這是因?yàn)殡S著菌體細(xì)胞的快速生長(zhǎng)，培養(yǎng)基內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被逐步消耗，菌體的生長(zhǎng)速率與死亡速率達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。而A 產(chǎn)紫藍(lán)狀菌生長(zhǎng)緩慢，在0～36 h 內(nèi)菌絲干重?zé)o顯著性差異（P＞0.05），處于生長(zhǎng)遲緩期；36～84 h 呈顯著上升趨勢(shì)，生長(zhǎng)速率快，菌絲干重從0.02 g 增至0.20 g，為生長(zhǎng)快速期。隨著時(shí)間增加，菌絲干重開(kāi)始下降但無(wú)顯著差異，菌體逐步進(jìn)入生長(zhǎng)停滯期。

圖8 大球蓋菇腐敗菌的生長(zhǎng)曲線Fig.8 Growth curves of spoilage fungi in S.rugosoannulata

2.3.2 腐敗菌最適生長(zhǎng)條件研究

2.3.2.1 不同培養(yǎng)溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同培養(yǎng)溫度對(duì)大球蓋菇腐敗菌菌絲生長(zhǎng)的影響如表4 所示。當(dāng)溫度為4～10 ℃時(shí)，大球蓋菇四種腐敗菌生長(zhǎng)緩慢，高于10 ℃后，腐敗菌菌絲生長(zhǎng)速率逐漸增加。當(dāng)溫度為28 ℃時(shí)，四種腐敗菌的生長(zhǎng)速率達(dá)到最大，分別為11.33 mm/d（X 假嗜花鐮刀菌），11.27 mm/d（Q 黑曲霉），11.51 mm/d（C 單孢根霉菌）和11.49 mm/d（A 產(chǎn)紫藍(lán)狀菌）。繼續(xù)增大培養(yǎng)溫度，相較于28 ℃，四種腐敗菌的生長(zhǎng)速率在30 ℃時(shí)略微下降，在35 ℃時(shí)下降明顯，分別下降60.48%（X 假嗜花鐮刀菌），13.89%（Q 黑曲霉），16.05%（C 單孢根霉菌）和13.74%（A 產(chǎn)紫藍(lán)狀菌）。四種腐敗菌的菌落直徑由28 ℃時(shí)的最大直徑（84.30、83.91、85.60 和85.45 mm）降至54.44、70.44、73.71和73.71 mm，分別下降35.12%（X 假嗜花鐮刀菌），17.71%（Q 黑曲霉），13.90%（C 單孢根霉菌）和13.74%（A 產(chǎn)紫藍(lán)狀菌）。表明在低溫4～10 ℃和高于35 ℃下會(huì)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖。

表4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)大球蓋菇腐敗菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of different temperatures on mycelial growth of S. rugosoannulata

2.3.2.2 不同pH 對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 不同pH 對(duì)大球蓋菇腐敗菌菌絲生長(zhǎng)的影響如表5 所示。四種腐敗菌菌絲在pH 為5.0～12.0 的培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，當(dāng)pH 增大到13.0 時(shí)生長(zhǎng)則會(huì)受到抑制。這是因?yàn)閺?qiáng)堿環(huán)境下，真菌細(xì)胞膜及其電荷狀態(tài)發(fā)生改變，抑制了真菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收[26]。X 假嗜花鐮刀菌在pH 為7.0～8.0 時(shí)生長(zhǎng)最快，菌絲稠密，菌絲生長(zhǎng)速率最高達(dá)到9.82 mm/d，菌落直徑最大達(dá)到73.75 mm。藍(lán)江林等[27]和秦涵淳等[28]的研究結(jié)果表明尖孢鐮刀菌菌落生長(zhǎng)的適宜pH 范圍很寬，在5.0～8.0 范圍內(nèi)均可以生長(zhǎng)，pH 為7.0 時(shí)最適。該結(jié)論與本研究結(jié)果相似。A 產(chǎn)紫藍(lán)狀菌和Q 黑曲霉分別在pH 為6.0、7.0 時(shí)生長(zhǎng)最快，生長(zhǎng)速率最高分別達(dá)到9.19和11.45 mm/d，菌落直徑分別達(dá)到69.39 和85.15 mm。C 單孢根霉菌在pH 為8.0～9.0 時(shí)生長(zhǎng)速度最快，生長(zhǎng)速率最高達(dá)到11.48 mm/d，菌落直徑最大達(dá)到85.33 mm。而當(dāng)pH 為13.0 時(shí)，四種腐敗菌幾乎不生長(zhǎng)。綜上，大球蓋菇腐敗菌菌絲適合在中堿性環(huán)境尤其是pH 為7.0 左右時(shí)生長(zhǎng)，而在強(qiáng)堿性環(huán)境下生長(zhǎng)緩慢。

表5 不同pH 對(duì)大球蓋菇腐敗菌菌絲生長(zhǎng)的影響Table 5 Effects of different pH on mycelial growth of S. rugosoannulata

2.3.2.3 致死溫度分析 該試驗(yàn)使腐敗菌在較高溫度下保持一定時(shí)間后探究不同腐敗菌的致死溫度。由于大部分真菌菌種的致死溫度在50～100 ℃之間[21]，因此本試驗(yàn)將起始溫度設(shè)定為50 ℃，以5 ℃為一個(gè)溫度梯度，共設(shè)置4 個(gè)梯度。不同致死溫度對(duì)腐敗菌的生長(zhǎng)影響如表6 所示。當(dāng)溫度為60 ℃時(shí)，四種腐敗菌均受到較大程度的抑制，其中C 單孢根霉菌的菌絲抑制率達(dá)到了95.98%，菌落直徑僅為6.65 mm。X 假嗜花鐮刀菌的菌絲抑制率達(dá)到了99.51%，菌落直徑僅為接種菌餅的5 mm。在65 ℃水浴處理30 min 后，四種菌均死亡。因此，可以確定大球蓋菇優(yōu)勢(shì)腐敗菌的致死溫度為60～65 ℃。

表6 大球蓋菇腐敗菌的致死溫度Table 6 Lethal temperature of S. rugosoannulata

3 結(jié)論

本文對(duì)腐敗大球蓋菇采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離、純化腐敗菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)手段確定腐敗菌種類(lèi)并對(duì)腐敗菌的生長(zhǎng)特性進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)腐敗大球蓋菇經(jīng)分離純化后共得到75 個(gè)腐敗菌株，其中鐮刀菌屬16 株、曲霉屬14 株，根霉屬4 株。通過(guò)致腐性分析，得到四種致腐性強(qiáng)的腐敗菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定其分別為假嗜花鐮刀菌（Fusarium pseudoanthophilum），黑曲霉（Aspergillus niger），單孢根霉菌（Rhizopus azygosporus）和產(chǎn)紫藍(lán)狀菌（Talaromyces purpureogenus）。四種腐敗菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～28 ℃，在4～10 ℃和高于35 ℃下會(huì)抑制腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖，在60～65 ℃時(shí)腐敗菌無(wú)法生長(zhǎng)。此外，腐敗菌的最適生長(zhǎng)pH 為7.0 左右，pH 為13.0 時(shí)腐敗菌無(wú)法生長(zhǎng)。因此為了避免腐敗菌的生長(zhǎng)繁殖導(dǎo)致大球蓋菇的腐敗變質(zhì)，可將采后大球蓋菇存放于低溫和適當(dāng)?shù)膲A性環(huán)境下貯藏，以期延長(zhǎng)大球蓋菇的貨架期，并為進(jìn)一步研究大球蓋菇的貯藏保鮮技術(shù)提供了理論依據(jù)。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).