王 帥，鄧木蘭, ，梁志成，周泓宇，何少媚，張 智，穆云萍，李芳紅,*，趙子建,*

（1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006；2.華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006；3.深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518060）

乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，L.lactis）是一種廣泛存在于自然界的食品級(jí)微生物，因其具有營(yíng)養(yǎng)和免疫等益生功能[1]，被FDA（食品藥品監(jiān)督管理局，F(xiàn)ood and Drug Administration）公認(rèn)為GRAS（一般認(rèn)為安全的，Generally Recognized as Safe）的微生物，在食品發(fā)酵、乳制品的生產(chǎn)和保存中的應(yīng)用有著悠久的歷史[2]。L.lactis是一種生長(zhǎng)速度快、易于操作、遺傳背景清楚的革蘭氏陽性菌，某些菌株全基因組測(cè)序已經(jīng)完成，因其良好的宿主基因工程能力，L.lactis常被用來作為表達(dá)異源蛋白的宿主菌，逐漸成為了食品和醫(yī)藥研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)[3-8]。

然而，傳統(tǒng)的L.lactis表達(dá)系統(tǒng)存在一些問題，例如大多以抗生素作為篩選標(biāo)記，抗性基因的橫向轉(zhuǎn)移導(dǎo)致抗生素污染已成為全球問題[9-12]。另外，傳統(tǒng)的L.lactis表達(dá)系統(tǒng)的潛在危害主要是因其表達(dá)載體中含有來源于病原微生物或非安全型微生物DNA 片段，這極大地限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，尋找新的非抗性食品級(jí)篩選標(biāo)記，構(gòu)建食品級(jí)表達(dá)載體使得乳酸菌在食品和醫(yī)療行業(yè)具有更廣泛的應(yīng)用是乳酸菌基因工程需要探索的方向之一[13]。作為食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)，L.lactis必須具備：a.遺傳特性清楚且穩(wěn)定；b.表達(dá)載體中的表達(dá)元件等功能性DNA 片段必須來自食品級(jí)微生物；c.選擇標(biāo)記必須是食品級(jí)的[14]。因此，為滿足這三個(gè)基本條件，越來越多的研究者著手以來源于食品級(jí)微生物的DNA 片段構(gòu)建的食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的研究[15]。

安全且穩(wěn)定的篩選標(biāo)記是食品級(jí)表達(dá)載體的關(guān)鍵因素之一。乳清酸核苷-5-磷酸脫羧酶基因（orotidine-5'-phosphate decarboxylase，pyrF）是目前應(yīng)用最為廣泛的一類營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記之一，pyrF基因是L.lactis尿嘧啶核苷酸生物合成和代謝過程的關(guān)鍵酶，將pyrF基因突變或缺失，L.lactis突變菌株不能將體內(nèi)底物乳清酸轉(zhuǎn)化為乳清酸核苷酸，從而導(dǎo)致尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的產(chǎn)生，其在培養(yǎng)時(shí)需要額外添加尿嘧啶才能正常生長(zhǎng)，而出發(fā)菌株能將5-氟乳清酸（5-fluoroorotic acid，5-FOA）轉(zhuǎn)化為對(duì)細(xì)胞有毒的5-氟尿嘧啶，從而導(dǎo)致野生型菌株不能在含5-FOA 的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)[16]?；谝陨虾Y選原理，可通過5-FOA 篩選獲得尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，然后利用不加尿嘧啶的培養(yǎng)基篩選回補(bǔ)原養(yǎng)型菌株，在酵母、絲狀真菌等和其他細(xì)菌物種中都有著重要的應(yīng)用[16-17]。

因此，本研究以pyrF基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，通過同源重組法構(gòu)建NZ3900 ΔpyrF營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，并利用食品級(jí)L.lactis的相關(guān)表達(dá)元件[18-19]，構(gòu)建L.lactis食品級(jí)表達(dá)載體，以ZsGreen 為報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)ZsGreen 在NZ3900 ΔpyrF缺陷型菌株中的穩(wěn)定表達(dá)。本研究為L(zhǎng).lactis食品級(jí)無抗性篩選標(biāo)記的遺傳改造提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

乳酸乳球菌L.lactisNZ3900 購(gòu)自德國(guó)MoBi-TecGmbH 公司，由本實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存；ZsGreen基因 來自本實(shí)驗(yàn)室保存的pLVX-IRES-ZsGreen質(zhì)粒，經(jīng)密碼子優(yōu)化并在C 端加入6×His-tag 蛋白標(biāo)簽，由華大基因公司合成；本研究所有DNA 序列和所用引物（表1） 均由華大基因公司合成；SacII 和Hind III 限制性內(nèi)切酶（1 U/μL）、Taq 酶（5 U/μL）、T4DNA 連接酶（350 U/μL） TaKaRa 公司；DNA Marker 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；蛋白Marker 北京索萊寶科技有限公司；尿嘧啶、5-氟乳清酸、抗壞血酸、葡萄糖、蔗糖、甘油 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；M17 培養(yǎng)基 生物風(fēng)；細(xì)菌基因組快速提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒 OMEGA 公司；His-Tag（D3I1O）偶聯(lián)辣根過氧化物酶（HRP Conjugate）抗體 美國(guó)CST 公司；本研究主要培養(yǎng)基及溶液：G17 培養(yǎng)基、電轉(zhuǎn)感受態(tài)SG17 培養(yǎng)基、Elliker 培養(yǎng)基、蔗糖-甘油溶液、電轉(zhuǎn)復(fù)蘇培養(yǎng)基、Elliker-FOA 培養(yǎng)基具體配方參考文獻(xiàn)[20]。

表1 本研究所用到的引物Table 1 Primers used in this study

T100+^TM+Thermal+Cycler PCR 儀、Micro-Pulser 電穿孔儀（1652100）、伯樂的電泳轉(zhuǎn)化膜系統(tǒng)（165-8000）、ChemiDoc+XRS+凝膠成像及分析系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad 公司；Leica DM2500 熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡；SW-CJ-1BU 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司；LBI-80 恒溫培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；TS-200B 空氣浴搖床 上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；DELTA320pH 計(jì) Mettler Toledo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pLD 載體的合成 根據(jù)L.lactis的基因組DNA 全序列（GenBank：CP002094.1）查詢得到repA、repC、pyrF、P8、Tusp45和TpepN等相關(guān)基因的序列，P32的基因 組 DNA 全序列 從 GenBank:AP018499.1 查詢得到、由深圳華大基因公司合成，pLD 載體詳細(xì)結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示。

圖1 表達(dá)載體pLD 的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Structure diagram of expression vector pLD

1.2.2 電轉(zhuǎn)感受態(tài)L.lactisNZ3900 的制備 將NZ3900 甘油凍存菌劃線于G17 平板上，置于30 ℃靜置培養(yǎng)活化2 d。挑取單克隆菌落，接種到50 mL的G17 培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600=0.3 時(shí)，于室溫下3000×g 離心5 min 收集NZ3900。用5 mL 蔗糖-甘油溶液（冰上預(yù)冷）重懸和洗滌菌體，4 ℃，6000×g 離心3 min，棄上清液，用1 mL 蔗糖-甘油溶液（冰上預(yù)冷）重懸菌體，此時(shí)即為電轉(zhuǎn)感受態(tài)，80 μL/EP 管分裝，儲(chǔ)存于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3pyrF突變盒pyrF-PT 的構(gòu)建 用OMEGA的細(xì)菌基因組快速抽提試劑盒提取，按照說明書操作提取NZ3900gDNA，以其為模板，利用pyrFsen1/pyrFanti1 和pyrFsen2/pyrFanti2 引物分別擴(kuò)增出5'pyrF重組臂pyrF-P 和3'pyrF重組臂pyrF-T，目標(biāo)片段DNA 序列大小分別為658 bp 和604 bp，PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃50 s，72 ℃ 40 s，產(chǎn)物進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。將pyrF-P 和pyrF-T 的DNA 片段進(jìn)行電泳并切膠純化回收，作為overlap PCR 模板，引物為pyrFsen1/pyrFanti2，PCR 擴(kuò)增條件：預(yù)變性94 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，產(chǎn)物進(jìn)行25 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min，擴(kuò)增出pyrF突變盒pyrF-PT 的DNA 序列，為1262 bp。然后電泳并切膠純化回收，將所得的DNA 片段定量并于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4L.lactisNZ3900 ΔpyrF突變株的構(gòu)建 將純化的pyrF-PT DNA 片段電轉(zhuǎn)化入L.lactisNZ3900：吸取冰上融化的80 μL 感受態(tài)NZ3900 于事先預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中，再加入10 μL（含5 μg 的pyrF-PT DNA）待轉(zhuǎn)化DNA。設(shè)置電轉(zhuǎn)程序如下：2000 V，25 μF，200 Ω，5 ms。電擊后加入1 mL 電轉(zhuǎn)復(fù)蘇培養(yǎng)基混勻，將電轉(zhuǎn)杯置于冰上5 min，然后放入培養(yǎng)箱30 ℃孵育2 h，3000×g 離心5 min，棄去上清液體然后用200 μL 生理鹽水重懸，涂布于Elliker-FOA 平板上，30 ℃培養(yǎng)72 h。

1.2.5L.lactisNZ3900 ΔpyrF突變株的鑒定 挑取Elliker-FOA 平板上的單菌落，接種于100 mL 含有50 mg/L 的尿嘧啶的G17 培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)2 d，提取L.lactisNZ3900 ΔpyrFgDNA，用1%瓊脂糖電泳鑒定，部分送往華大基因公司進(jìn)行序列鑒定。然后將構(gòu)建成功的L.lactisNZ3900 ΔpyrF突變株制備為電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.6 pLD-ZsG 載體的構(gòu)建 將pLD 質(zhì)粒與P32-ZsG-Tusp45DNA 片段分別進(jìn)行SacII 和Hind III雙酶切反應(yīng)后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收備用。將純化的pLD 質(zhì)粒酶切片段與P32-ZsGTusp45DNA 酶切片段進(jìn)行連接反應(yīng)，16 ℃水浴連接過夜，重組載體命名為pLD-ZsG。

1.2.7 LL-pLD-ZsG 工程菌株的構(gòu)建及鑒定 將pLD 和pLD-ZsG 質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)入NZ3900 ΔpyrF感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于Elliker 平板上。30 ℃培養(yǎng)72 h，將重組菌株分別命名為L(zhǎng)L-pLD 和LL-pLDZsG。然后提取質(zhì)粒DNA，提取步驟參考任志娟等[21]的研究。將質(zhì)粒DNA 進(jìn)行酶切，反應(yīng)完成后取5 μL 酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，部分質(zhì)粒DNA 送去華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。LLpLD-ZsG 重組工程菌株蛋白樣的制備：在室溫下5000×g 離心3 min 收集LL-pLD-ZsG 菌體，液氮研磨成細(xì)粉狀后取菌體50 mg 至1.5 mL 離心管中，加入1 mL RIPA 細(xì)胞裂解液振蕩均勻，按比例加入5×蛋白上樣緩沖液（4:1 v/v）充分振蕩混勻，100 ℃水浴變性10 min，室溫下5000×g 離心3 min，取上清液作為蛋白樣保存。ZsGreen 蛋白驗(yàn)證步驟參考文獻(xiàn)[22]。

1.2.8 LL-pLD-ZsG 重組工程菌的熒光觀察 將轉(zhuǎn)化pLD-ZSG 片段的Elliker 篩選平板上長(zhǎng)出的陽性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到3 mL 含有40 mg/L 的尿嘧啶的Elliker 液體培養(yǎng)基中，30 ℃下靜置培養(yǎng)48 h 后，室溫下3000×g 離心1 min，棄上清液，用1 mL 的PBS溶液重懸菌體，將菌液制片并于Leica DM2500 熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在菌體中的表達(dá)情況（對(duì)照組為相同培養(yǎng)條件的NZ3900 ΔpyrF），激發(fā)光波長(zhǎng)為493 nm。

1.2.9 LL-pLD-ZsG 工程菌株的連續(xù)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定性測(cè)定 將LL-pLD-ZsG 重組工程菌株從Elliker平板上挑取陽性菌落，接種于100 mL 的Elliker 培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h，至OD600約0.4 的時(shí)候即作為第1 代LL-pLD-ZsG 重組工程菌株，然后取1 mL 的第1 代工程菌株培養(yǎng)菌液于室溫下5000×g 離心1 min，棄上清液留菌體沉淀，然后用PBS 洗滌，室溫下5000×g 離心1 min，然后用PBS重懸菌體。取1×104CFU PBS 重懸的第1 代工程菌株接種到100 mL 的Elliker 培養(yǎng)基中，在30 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)24 h，至OD600約0.4 的時(shí)候即作為第2 代工程菌株，按照上述步驟收集工程菌株并傳代，重復(fù)培養(yǎng)到30 代。然后分別提取1、5、10、15、20、25、30 代的重組工程菌的質(zhì)粒并進(jìn)行SacII 單酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠鑒定，將第30 代重組工程菌的質(zhì)粒送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。以第1 代培養(yǎng)菌液和第30 代培養(yǎng)菌液制作為蛋白樣，然后進(jìn)行Western blotting 鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文采用的數(shù)據(jù)庫GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）；PCR 引物設(shè)計(jì)軟件：Primer premier 5；基因和蛋白序列處理軟件：DNAssist（v3.0）；密碼子優(yōu)化JCat online tool（http://www.jcat.de/）。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變盒pyrF-PT 的構(gòu)建

利用基因組DNA 提取試劑盒提取NZ3900gDNA，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2a，在10 kbp 上方可以看到條帶，說明NZ3900gDNA 提取成功。以NZ3900gDNA 為模板，擴(kuò)增5'pyrF重組 臂pyrF-P 和3'pyrF重組臂pyrF-T 的DNA 片段，并以pyrF-P/pyrF-T 為模板進(jìn)行overlap PCR，擴(kuò)增出pyrF突變盒pyrF-PT，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果如圖2b，目的序列的DNA 片段分別約為658、604和1262 bp，與預(yù)期大小一致，且測(cè)序結(jié)果表明pyrFP、pyrF-T 和突變盒pyrF-PT 擴(kuò)增成功。

圖2 突變盒pyrF-PT 的構(gòu)建Fig.2 Construction of mutation cassette pyrF-PT

2.2 NZ3900 ΔpyrF 突變株的鑒定

將突變盒pyrF-PT 電轉(zhuǎn)化至NZ3900 出發(fā)菌中，構(gòu)建NZ3900 ΔpyrF突變株，在含有尿嘧啶和5-FOA 的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行NZ3900 ΔpyrF突變株篩選。基因組PCR 鑒定如圖3 所示，結(jié)果表明NZ3900出發(fā)菌的pyrF基因大小約為1976 bp，而NZ3900 ΔpyrF突變株的pyrF基因區(qū)大小約為1262 bp 左右，比出發(fā)菌減少了714 bp，經(jīng)過測(cè)序表明，pyrF基因的編碼序列被成功地敲除。

圖3 pyrF 突變盒的PCR 鑒定Fig.3 PCR detection of pyrF mutation cassette

2.3 pLD-ZSG 載體的構(gòu)建

將合成的P32-ZsG-Tusp45DNA 片段和pLD 載體分別進(jìn)行SacII 和Hind III 雙酶切，純化后由連接酶連接，構(gòu)建pLD-ZsG。將其電轉(zhuǎn)至NZ3900 ΔpyrF突變株，構(gòu)建原養(yǎng)型LL-pLD-ZsG 工程菌株并擴(kuò)增pLD-ZsG 質(zhì)粒，提取pLD-ZsG 進(jìn)行雙酶切鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖4，在約1073 bp 和3686 bp處可見目標(biāo)條帶，與雙酶切的P32-ZsG-Tusp45DNA和pLD 質(zhì)粒的酶切片段大小一致，且測(cè)序結(jié)果表明pLD-ZsG 載體構(gòu)建成功。

圖4 pLD-ZsG 質(zhì)粒雙酶切結(jié)果Fig.4 Result of pLD-ZsG plasmid digested

2.4 LL-pLD-ZsG 重組工程菌中綠色熒光的觀察

本研究以ZsGreen 綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，構(gòu)建的LL-pLD-ZsG 原養(yǎng)型重組工程菌在熒光顯微鏡下可觀察到明亮的綠色熒光菌體，而NZ3900 ΔpyrF突變株在相同條件下無綠色熒光（見圖5）且NZ3900 ΔpyrF出發(fā)菌和LL-pLD-ZsG 重組工程菌在形態(tài)上并無差別，表明pLD-ZsG 表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)入NZ3900 ΔpyrF突變株，使得ZsGreen 基因在NZ3900 ΔpyrF突變株進(jìn)行有效的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

圖5 LL-pLD-ZsG 的熒光顯微鏡圖Fig.5 Fluorescence microscope image of LL-pLD-ZsG

2.5 LL-pLD-ZsG 重組工程菌中ZsGreen 蛋白的表達(dá)

通過Western blotting 驗(yàn)證ZsGreen 蛋白在NZ3900 ΔpyrF突變株中的表達(dá)情況，結(jié)果如圖6 所示，在NZ3900 出發(fā)菌、LL-pLD 空載工程菌、LLpLD-ZsG 重組工程菌中只有LL-pLD-ZsG 工程菌的菌體蛋白在約28 kDa 處有特異性目的條帶出現(xiàn)，該條帶的大小與預(yù)期相符，表明綠色熒光蛋白ZsGreen 能在NZ3900 ΔpyrF中表達(dá)，同時(shí)也說明pLD 能實(shí)現(xiàn)外源基因在NZ3900 ΔpyrF突變株中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。

圖6 Western blotting 驗(yàn)證LL-pLD-ZsG 中ZsGreen 的表達(dá)Fig.6 Western blotting verified the expression of ZsGreen in LL-pLD-ZsG

2.6 LL-pLD-ZsG 重組工程菌傳代穩(wěn)定性的鑒定

提取不同代的LL-pLD-ZsG 重組工程菌的pLD-ZsG 質(zhì)粒進(jìn)行SacII 單酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖膠電泳鑒定，結(jié)果如圖7 所示，1、5、10、15、20、25、30 代的重組工程菌的質(zhì)粒經(jīng)過單酶切后大小均一致約為4759 bp，表明LL-pLD-ZsG 工程菌在30 代以內(nèi)質(zhì)粒沒有丟失或發(fā)生改變，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。

圖7 LL-pLD-ZsG 質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性鑒定Fig.7 Genetic stability assessment of LL-pLD-ZsG plasmid

通過Western blotting 驗(yàn)證LL-pLD-ZsG 工程菌經(jīng)過30 次傳代后，是否仍能穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白，結(jié)果如圖8 所示，以第1 代LL-pLD-ZsG 工程菌為陽性對(duì)照，結(jié)果表明LL-pLD-ZsG 工程菌經(jīng)過30 次傳代后仍能正確表達(dá)ZsGreen，分子量大小約為28 kDa，再次證實(shí)了LL-pLD-ZsG 重組工程菌至少在傳代培養(yǎng)的30 代以內(nèi)保持質(zhì)粒不丟失，具有一定的遺傳穩(wěn)定性。

圖8 Western blotting 鑒定第1 代與30 代的LL-pLD-ZsG工程菌株Fig.8 Western blotting results of 1st and 30th generation of recombinant LL-pLD-ZsG

3 討論與結(jié)論

在L.lactis的前期研究中，以抗生素作為篩選標(biāo)記的非食品級(jí)表達(dá)載體，構(gòu)建了大量的乳酸菌抗性基因工程菌株，在多肽、酶、多糖、細(xì)菌素等代謝物質(zhì)的合成表達(dá)方面的大量應(yīng)用，促進(jìn)了乳酸菌工業(yè)化的應(yīng)用進(jìn)展，為制備酶制劑、乳酸菌口服疫苗提供了理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)[23]。然而，抗生素在生物體或者環(huán)境中漂移擴(kuò)散，破壞生態(tài)，影響生物多樣性，給全球生態(tài)和世界經(jīng)濟(jì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)[9-10]。

目前，研究者為了構(gòu)建L.lactis食品級(jí)表達(dá)載體開發(fā)了糖類篩選標(biāo)記、細(xì)菌素篩選標(biāo)記、抗金屬離子篩選標(biāo)記、噬菌體篩選標(biāo)記以及營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記等[24-27]。營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記是理想的安全選擇性標(biāo)記，Dickely 等[28]以supB基因作為選擇標(biāo)記，構(gòu)建pFG1 表達(dá)載體，進(jìn)行克隆表達(dá)。Sorensen 等[29]用supD基因構(gòu)建了pFG200 載體，實(shí)現(xiàn)了多種外源蛋白的過表達(dá)。以上兩種選擇標(biāo)記均屬無義突變抑制基因，可在多種培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇，由于其使用靈活，相比較于其他“食品級(jí)”篩選標(biāo)記有許多優(yōu)點(diǎn)，但tRNA 抑制基因可能會(huì)導(dǎo)致多重效應(yīng)[30]。而孫強(qiáng)正等[14]以營(yíng)養(yǎng)缺陷型thyA基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，構(gòu)建pSQZ 食品級(jí)表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)具有保護(hù)活性蛋白的表達(dá)。以上的研究可以看出，營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記在L.lactis的食品級(jí)表達(dá)載體構(gòu)建中的應(yīng)用較少，因此，本實(shí)驗(yàn)利用pyrF/5-FOA 營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，構(gòu)建L.lactis食品級(jí)表達(dá)載體，為L(zhǎng).lactis食品級(jí)表達(dá)載體的構(gòu)建提供新的選擇。尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型是一種在微生物中常用的營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，因其來自于宿主本身，屬于同源轉(zhuǎn)化，避免了甲基化[31-32]，是理想的安全型篩選標(biāo)記。本研究基于pyrF/5-FOA營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，構(gòu)建L.lactisNZ3900 ΔpyrF突變株，并以其為出發(fā)菌，通過電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)染包含pyrF回補(bǔ)標(biāo)記和報(bào)告基因ZsGreen 的pLD-ZsG 質(zhì)粒構(gòu)建LL-pLD-ZsG 原養(yǎng)型工程菌株，成功實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)，為L(zhǎng).lactis的遺傳改造提供了有效的食品級(jí)篩選標(biāo)記。

L.lactisNZ3900/pNZ8149 是目前食品工業(yè)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最常用且唯一商業(yè)化的NICE 表達(dá)系統(tǒng)[33]，由于其需要添加誘導(dǎo)劑Nisin 來誘導(dǎo)外源蛋白的表達(dá)，不適用于口服疫苗、生物活性多肽的應(yīng)用；且在食品工業(yè)發(fā)酵過程中需要添加誘導(dǎo)劑，操作過程麻煩、增加生產(chǎn)成本[5]。而相較于NICE 表達(dá)系統(tǒng)，pyrF/5-FOA 表達(dá)體系的優(yōu)勢(shì)在于它不需要添加任何的誘導(dǎo)劑和抗生素的條件下，可實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達(dá)，這為L(zhǎng).lactis食品級(jí)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)際應(yīng)用提供了可能。L.lactis組成型表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白產(chǎn)量較低是目前亟待解決的問題。本研究所構(gòu)建的表達(dá)載體pLD 也存在這樣的問題。因此，在后續(xù)研究中繼續(xù)改造該組成型表達(dá)載體，從強(qiáng)啟動(dòng)子篩選、增加多拷貝數(shù)等方向進(jìn)行改造，以期提高外源蛋白在L.lactis組成型表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，進(jìn)而提高該食品級(jí)表達(dá)載體的表達(dá)能力。

本研究基于pyrF/5-FOA 篩選機(jī)制構(gòu)建的食品級(jí)表達(dá)載體pLD 不含有任何抗生素抗性基因、各組分均來自食品級(jí)微生物，且宿主菌也為食品級(jí)微生物，完全符合FDA 所規(guī)定的嚴(yán)格的食品級(jí)規(guī)范，很好地解決了生物安全性問題，提供了一種高效簡(jiǎn)捷的構(gòu)建可供口服的食品級(jí)表達(dá)載體的方法，為利用L.lactis生產(chǎn)食品級(jí)藥物多肽提供了研究基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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