劉曉丹，肖 瀛, ，周建金，高 雅，王伊朋，唐慶九，俞 苓

（1.上海城建職業(yè)學(xué)院食品與旅游學(xué)院，上海 201415；2.三明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，福建?。ㄉ絽^(qū)）作物遺傳改良與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建三明 365051；3.上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精化妝品學(xué)部，上海 201418；4.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403）

近年研究表明腸道微生物與人類(lèi)健康密切相關(guān)，腸道細(xì)菌生態(tài)系統(tǒng)對(duì)人體疾病、免疫調(diào)控等方面起著重要的作用[1-3]。從腸道微生物和代謝產(chǎn)物的角度詮釋益生元對(duì)腸道微生物群的調(diào)節(jié)作用已成為研究的熱點(diǎn)[4-6]。已有研究表明中藥中的有效成分如多糖，能夠?qū)δc道菌群失調(diào)起到一定調(diào)節(jié)作用[7]。

多花黃精（Polyonatum cyrtonemaHua.）作為一種歷史悠久且藥食同源的藥材[8]，是中國(guó)藥典收載的黃精基原植物之一，其多糖具有較好的藥理作用和應(yīng)用價(jià)值[9-12]。多花黃精多糖（Polyonatum cyrtonemaHua.Polysaccharide，PCP）的分子量為2～7 kDa，主要由果聚糖及半乳聚糖組成[13-14]。研究發(fā)現(xiàn)PCP 的結(jié)構(gòu)組成與菊粉（Inulin，INU）結(jié)構(gòu)相似[15]，INU 是一種優(yōu)質(zhì)的益生元和膳食纖維，不會(huì)被胃腸道內(nèi)源酶消化，能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[16]，因此，本研究推測(cè)PCP 具有潛在的抗消化性和益生元活性。但目前對(duì)于PCP 對(duì)腸道微生物的影響少有文獻(xiàn)報(bào)道，目前僅有研究通過(guò)單一菌株的培養(yǎng)模式下，發(fā)現(xiàn)多花黃精多糖對(duì)雙歧桿菌（Bifidobacterium）、乳桿菌（actobacillus）等有益菌有著促進(jìn)生長(zhǎng)的作用[16]，但這種研究方式?jīng)]有考慮腸道中多種微生物以及代謝物之間的相互作用。

因此，本研究以從多花黃精中提取的多糖為原料，以INU 作為陽(yáng)性對(duì)照，通過(guò)體外模擬消化模型研究其抗消化特性，并采用體外厭氧發(fā)酵模型，探究PCP 對(duì)pH、微生物結(jié)構(gòu)數(shù)量及代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的影響，為多花黃精產(chǎn)品在食品中的推廣應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為多花黃精益生元食品的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

多花黃精（福建省三明市寧化縣人工栽培，品種編號(hào) FJ-105-1） 福建省三明農(nóng)科院提供；無(wú)水乙醇AR，上海泰坦（Titan）科技股份有限公司；乙酸、丙酸、丁酸等標(biāo)準(zhǔn)品 ＞99%，上海梯希愛(ài)（TCI）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；α-淀粉酶（100 U/mg）、胃蛋白酶（3000 U/g）、胃脂肪酶（3000 U/g）、胰酶（4000 U/g）美國(guó)西格瑪奧德里奇公司；膽鹽 阿拉丁試劑（上海）有限公司；DNAzol 基因組DNA 快速提取試劑盒 上海美吉逾華生物醫(yī)藥科技有限公司；其他試劑國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；糞便樣品 年齡為22～25 歲的志愿者（男性、女性各三人，簽署參與本研究項(xiàng)目的知情同意書(shū)）的糞便，所選志愿者身體狀況良好、健康，飲食正常，6 個(gè)月內(nèi)無(wú)腸道疾病，且2 周內(nèi)未服用過(guò)益生菌或抗生素；發(fā)酵培養(yǎng)基的制備[17]0.1 mol/L 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液1 L（pH6.8）2 g 蛋白胨，2 g 酵母浸提物，0.1 g NaCl，0.04 g K2HPO4，0.04 g KH2PO4，0.01 g MgSO4·7H2O，0.01 g CaC12·6H2O，2 g NaHCO3，2 mL 吐溫-80，0.02 g 血紅素，10 μL 維生素K1，0.5 g 膽鹽，0.5 g 半胱氨酸。

XMTD-204 型恒溫水浴鍋 天津市歐諾儀器有限公司；Infinite M200PRO 型多功能酶標(biāo)儀 奧地利帝肯有限公司；VS-8401 型超凈操作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；LRH-250 型生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；FE-28 型pH 計(jì) 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；TQ8040 型氣相色譜儀 日本島津公司；TGL-16M 型臺(tái)式冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黃精多糖的制備 取干燥多花黃精生品粉碎，過(guò)60 目篩，按料液比1:25（g/g）加水，于80 ℃加熱2 h，4000 r/min 離心15 min 收集上清，加入無(wú)水乙醇，使提取液中乙醇濃度達(dá)到75%，于4 ℃過(guò)夜沉淀，離心（6000 r/min，20 min）收集沉淀后凍干，即獲得水提多糖[18]。制備的多糖經(jīng)蒽酮硫酸法[19]分析提取PCP 多糖含量為83.1%，其它組分包括糖醛酸（8.8%）、蛋白質(zhì)（3.6%）、多酚類(lèi)（4.5%）。PCP 多糖經(jīng)凝膠滲透色譜（Gel Permeation Chromatography，GPC）[20]分析其Mw 為4.2 kDa，多糖經(jīng)過(guò)三氟乙酸水解，高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測(cè)定單糖組成[21]為葡萄糖71.21%、木糖 13.21%、半乳糖4.57%、甘露糖4.47%、巖藻糖 4.15%、果糖2.39%。

1.2.2 黃精多糖的體外模擬消化實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 模擬口腔、胃腸道消化 模擬唾液、模擬胃液和模擬小腸液及三段式體外消化模型參考文獻(xiàn)[22]的方法并略作修改，以INU 作為對(duì)照。

模擬口腔消化：用HCl（6 mol/L）將模擬唾液pH 調(diào)至6.8，在37 ℃的水浴中預(yù)熱0.5 h 后，將50 mL 多糖樣品（15.0 mg/mL）、CaCl2溶液（0.25 mL，0.3 mmol/L）和α-淀粉酶溶液（75 U/mL，5 mL）加入40 mL 模擬唾液中，加入超純水定容至100 mL 后于37 ℃水浴孵育5 min，后用HCl（6 mol/L）將pH調(diào)至3.0。

模擬胃消化：將80 mL 模擬胃液于37 ℃水浴中預(yù)熱，加入上一階段模擬口腔消化液、CaCl2溶液（0.05 mL，0.3 mmol/L）、胃蛋白酶溶液（2000 U/mL，5 mL）、胃脂肪酶溶液（60 U/mL，5 mL）和超純水補(bǔ)充至100 mL，在37 ℃下孵育4 h。用NaOH（6 mol/L）將pH 調(diào)至7.0。

模擬腸道消化：在37 ℃水浴中預(yù)熱40 mL 模擬小腸液，加入上一段模擬消化液、膽鹽溶液（25 mL，10 mmol/L）、CaCl2溶液（0.4 mL，0.3 mmol/L）、胰酶溶液（5 g，100 U/mL）和超純水補(bǔ)充至200 mL，37 ℃孵育6 h，沸水滅活酶。在模擬消化培養(yǎng)基中加入超純水作為空白對(duì)照組。

1.2.2.2 總糖和還原糖測(cè)定 將胃模擬消化4 h 和小腸模擬消化6 h 樣品分別測(cè)定總糖和還原糖含量，總糖含量采用苯酚硫酸法測(cè)定[23]，分別取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.1 mg/mL）于試管中，用蒸餾水補(bǔ)足至1 mL，混勻后加入0.5 mL 5%苯酚溶液混勻，再加入2.5 mL 濃硫酸溶液，混勻后放于沸水浴15 min，冷卻后于490 nm 處檢測(cè)吸光度，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=9.6407x+0.0353（R2=0.999），樣品加樣量為1 mL，操作過(guò)程同前，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出總糖含量。還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）方法測(cè)定[23]，分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/mL）于定容管中，用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL，然后加入3 mL DNS 試劑，混勻后沸水浴中加熱5 min，冷卻后用蒸餾水定容至25 mL，搖勻后在520 nm 處檢測(cè)吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.2975x-0.0313（R2=0.997）。樣品加樣量為2 mL，操作過(guò)程同前，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出還原糖含量。

1.2.3 黃精多糖的體外厭氧發(fā)酵

1.2.3.1 糞便處理 將糞便取樣器、一次性手套、鑷子、牛皮紙、自封袋、EP 管離心管、試劑瓶等采樣工具提前滅菌，在厭氧操作箱中將采集的6 位志愿者的新鮮糞便等量混合，取混合糞樣10 g 加入到100 mL 無(wú)菌磷 酸鹽緩沖液（PBS，pH6.8）中 按1:10 稀釋?zhuān)訋琢o(wú)菌玻璃珠渦旋振蕩混勻配制成糞便懸液。稀釋的糞液用4 層無(wú)菌紗布過(guò)濾取濾液為菌源液，所有新鮮糞便樣品的采集和處理需在1 h 內(nèi)完成。

1.2.3.2 體外厭氧發(fā)酵 體外厭氧發(fā)酵方法參考文獻(xiàn)[24-25]并對(duì)方法進(jìn)行一定的改進(jìn)，以基礎(chǔ)發(fā)酵液為空白對(duì)照組，以1%（w/v）INU 作為陽(yáng)性對(duì)照，以1%（w/v）PCP 作為實(shí)驗(yàn)組，并以1:9（v:v）的接種量接入菌源液，于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每組實(shí)驗(yàn)5 個(gè)重復(fù)。分別在發(fā)酵 0、6、12、24 h 后取樣，用0.4 mL 0.5%硫酸銅或20%乙腈停止微生物的發(fā)酵。

1.2.3.3 pH 的測(cè)定 厭氧發(fā)酵0、6、12、24 h 對(duì)空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別取樣，使用pH 計(jì)對(duì)樣品進(jìn)行pH 的測(cè)定。

1.2.3.4 總糖和還原糖測(cè)定 對(duì)發(fā)酵0、6、12、24 h空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別取樣，離心后（4000×g 離心15 min）取上清液，按1.2.2.2 方法，測(cè)定發(fā)酵液的總糖和還原糖的含量。

1.2.4 16S rDNA 基因及生物信息學(xué)分析 發(fā)酵24 h后的發(fā)酵液于8000×g 離心15 min，取離心后得到的菌泥沉淀，保存于-80 ℃冰箱中，用于腸道菌群測(cè)序。使用DNAzol 基因組DNA 快速提取試劑盒提取菌泥沉淀中腸道微生物中的DNA，用瓊脂糖凝膠電泳（1%）對(duì)抽提的DNA 進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)合格的樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司檢測(cè)，通過(guò)Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)對(duì)進(jìn)行腸道菌群進(jìn)行測(cè)序（引物序列為：338F（5′-ACTCCTACGGGAGGC AGCAG-3′）；806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCT AAT-3′）），得到 16S rDNA 數(shù)據(jù)。

16S rDNA 數(shù)據(jù)分析方法：MiSeq/Novaseq 測(cè)序得到的PE reads 進(jìn)行樣本拆分后，首先根據(jù)測(cè)序質(zhì)量對(duì)雙端Reads 進(jìn)行質(zhì)控和過(guò)濾，同時(shí)根據(jù)雙端Reads 之間的Overlap 關(guān)系進(jìn)行拼接，獲得質(zhì)控拼接之后的優(yōu)化數(shù)據(jù)。然后使用序列降噪方法（DADA2/Deblur 等）處理優(yōu)化數(shù)據(jù)，獲得ASV（Amplicon Sequence Variant）代表序列和豐度信息，使用Majorbio在線云平臺(tái)（www.majorbio.com）對(duì)微生物數(shù)據(jù)進(jìn)行α、β多樣性的分析；運(yùn)用ANOSIM 進(jìn)行各組之間的多樣性差異檢驗(yàn)分析；采用 Kruskal-Wallis（KW）sum-rank test 進(jìn)行物種組間差異顯著性分析；對(duì)各組樣本群落組成進(jìn)行分類(lèi)學(xué)可視化分析。

1.2.5 短鏈脂肪酸（SCFAs）的測(cè)定 樣液使用0.22 μm 膜過(guò)濾，裝入進(jìn)樣瓶待用。采用GC-MS 測(cè)定，色譜條件：島津Rtx-WAX 色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱溫100 ℃；離子源溫度220 ℃；接口溫度250 ℃，升溫程序：100 ℃以7.5 ℃/min 的速率升溫至140 ℃，保持4 min，再以60 ℃/min 升溫至 200 ℃；樣品進(jìn)樣量1 μL；載氣He；分流比10:1；流速2 mL/min；溶劑延遲1.5 min；Q3 Scan 方式采集1.5 min 到9.5 min，質(zhì)量掃描范圍m/z 20.0～300.0。分別配制濃度梯度在0.25～32 mmol/L 范圍內(nèi)的乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用外標(biāo)法定量分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示；運(yùn)用SPSS 21.0 軟件的單因素方差分析方法（ANOVA）進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）；通過(guò)Origin2021 軟件進(jìn)行作圖。高通量測(cè)序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控、過(guò)濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)，進(jìn)行分類(lèi)操作單元的劃分，菌群結(jié)構(gòu)差異及微生物種類(lèi)差異通過(guò)美吉生物云平臺(tái)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃精多糖的體外抗消化特性

通過(guò)模擬口腔、胃、小腸消化液，對(duì)PCP 進(jìn)行體外消化，結(jié)果見(jiàn)表1。INU 和PCP 在三段消化過(guò)程中總糖含量幾乎無(wú)變化（P＞0.05），在口腔與小腸模擬消化后還原糖含量沒(méi)有顯著性變化（P＞0.05）。在模擬胃消化過(guò)程中INU 還原糖含量顯著升高（P＜0.05），可能是在酸性環(huán)境下INU 的部分糖苷鍵斷裂成為單糖或寡糖[26]，少量多糖被降解為還原糖，而PCP 則無(wú)顯著變化（P＞0.05），表明INU 與PCP 具有一定的抗消化特性，且PCP 的抗消化能力更強(qiáng)，PCP 能夠不被消化系統(tǒng)降解，進(jìn)入結(jié)腸后可能被微生物利用并發(fā)酵，具有益生元的潛能。

表1 不同消化時(shí)間的總糖含量、還原糖含量變化Table 1 Changes in total sugar content and reducing sugar content at different digestion times

2.2 發(fā)酵過(guò)程中pH、總糖和還原糖的變化

腸道微生物體外厭氧發(fā)酵和腸道內(nèi)發(fā)酵在細(xì)菌數(shù)量、組成、多樣性和代謝產(chǎn)物等方面都相似[27-28]。因此，本研究通過(guò)體外糞便菌群厭氧發(fā)酵模型，探究PCP 對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)與利用的影響，腸道微生物能夠利用不被消化的碳水化合物，產(chǎn)生有機(jī)酸、短鏈脂肪酸等一系列代謝產(chǎn)物，進(jìn)而改變腸道生境的酸堿度[29]，不同時(shí)間的發(fā)酵液pH、總糖和還原糖含量結(jié)果如表2 所示。

表2 體外發(fā)酵過(guò)程pH、總糖含量、還原糖含量變化Table 2 Changes in pH,total sugar content and reducing sugar content during in vitro fermentation

由表2 可知，空白對(duì)照組pH 變化沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），而PCP 組和INU 組的pH 在6 h 急劇下降后趨于穩(wěn)定，同時(shí)，前6 h 總糖含量快速下降且還原糖有一定上升，表明腸道微生物能夠利用PCP、INU 作為碳源生長(zhǎng)，并產(chǎn)生大量有機(jī)酸與短鏈脂肪酸類(lèi)等代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵體系中的pH 下降；而后總糖含量下降趨緩，pH 也變化不明顯，表明腸道微生物生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。上述結(jié)果表明，INU 和PCP 能夠被腸道菌群作為碳源利用，促進(jìn)產(chǎn)酸。

2.3 黃精多糖體外發(fā)酵對(duì)腸道菌群α、β 多樣性的影響

本研究采用16S 多樣性測(cè)序技術(shù)，進(jìn)一步探究PCP 對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響。Rank-Abundance 曲線能夠說(shuō)明物種豐度和群落均勻度。在水平方向，物種的豐富度由曲線的寬度來(lái)反映，物種的豐富度越高，曲線在橫軸上的范圍越大；曲線的平滑程度反映了樣本中物種的均勻度，曲線越平緩，群落中物種分布越均勻[30]。如圖1 所示，三組在ASV 等級(jí)水平上的寬度較大，說(shuō)明物種豐富度高；從縱軸來(lái)看，曲線較平緩，說(shuō)明樣本中物種分布較為均勻，取得的測(cè)序結(jié)果適宜用于分析。

圖1 體外發(fā)酵樣本 Rank-Abundance 曲線Fig.1 Rank-Abundance curve of in vitro fermentation samples

Alpha 多樣性分析可以表明腸道微生物群的均勻度和豐富度，ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)反映菌群豐度，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)反映菌群多樣性[31]。由圖2 可知，PCP 組、INU 組與CON 組相比，呈現(xiàn)類(lèi)似的影響，Shannon 指數(shù)、ACE 指數(shù)與Chao1 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），而Simpson 指數(shù)顯著上升（P＜0.05），這說(shuō)明PCP 與INU 可降低腸道菌群的豐富度和多樣性。這與先前INU 在小鼠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，可能由于其促進(jìn)某些有益腸道菌群增殖有關(guān)[32]。

圖2 體外發(fā)酵菌群α 多樣性分析Fig.2 Alpha diversity of community by in vitro fermentation

主坐標(biāo)分析（PCoA）代表了各組間腸道菌群的差異性，由圖3 可知，主成分PC1 與PC2 占比分別為88.78%、7.04%。三組間區(qū)別明顯，說(shuō)明發(fā)酵24 h后，發(fā)酵液中的腸道菌群發(fā)生顯著變化，表明PCP 能夠調(diào)控腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)。此外，PCP 和INU 兩組在PC1 軸位置相近，而在PC2 軸上距離較遠(yuǎn)，這表明兩者對(duì)腸道菌群調(diào)控作用雖然有所差異但具有較大的相似性。

圖3 體外發(fā)酵菌群β 多樣性分析Fig.3 Beta diversity of community by in vitro fermentation

2.4 黃精多糖體外發(fā)酵對(duì)腸道菌群豐度的影響

如圖4 所示，16S rDNA 基因測(cè)序表明了PCP基于體外發(fā)酵模型能夠在門(mén)水平上改變腸道菌群組成。相對(duì)于CON 組，PCP 組和INU 組中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria）相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05），變形菌門(mén)（Proteobacteria）相對(duì)豐度顯著減少（P＜0.05）。厚壁菌門(mén)通常能夠利用多糖產(chǎn)生SCFAs，并有助于抑制病原菌的增長(zhǎng)[33]。放線菌門(mén)中包含益生菌如雙歧桿菌，能夠通過(guò)產(chǎn)生醋酸鹽保護(hù)宿主免受腸道致病性感染[34]。變形菌門(mén)包括很多病原菌，如大腸桿菌、志賀氏菌等，易導(dǎo)致腸道微生物失調(diào)，與糖尿病、炎癥和癌癥正相關(guān)，進(jìn)而影響宿主的機(jī)體健康[35]。

圖4 采用K-W H 秩檢驗(yàn)分析體外發(fā)酵24 h 后腸道微生物菌群門(mén)水平組成Fig.4 Analysis of intestinal microbial community composition at phylum level after in vitro fermentation for 24 h with Kruskal-Wallis H test

采用Student’st-test 檢驗(yàn)對(duì)豐度前25 的菌屬進(jìn)行顯著性差異比較分析，結(jié)果如圖5 所示，INU 組或PCP 組相較于CON 組，巨單胞菌屬（Megamonas）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、大腸桿菌屬（Enterobacteriaceae）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、經(jīng)黏液真桿菌屬（Blautia）、丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae）、霍氏真桿菌屬（Eubacterium_hallii_group）、普拉梭菌（Faecalibacterium）共10 種菌屬均存在顯著性差異（P＜0.05）。與CON 組相比，INU 組的巨單胞菌屬（Megamonas）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度顯著增加（P＜0.05）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella）、克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、腸桿菌屬（Enterobacter）、腸球菌屬（Enterococcus）、丹毒絲菌屬（Erysipelotrichaceae_UCG-003）等相對(duì)豐度顯著降低（P＜0.05）。通過(guò)對(duì)比PCP 組與CON 組顯著差異菌屬，可以發(fā)現(xiàn)，PCP 組在屬水平上對(duì)菌群調(diào)節(jié)作用與INU 相似，PCP 與INU 兩組中最為優(yōu)勢(shì)為巨單胞菌屬（Megamonas）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）。研究表明，巨單胞菌的增殖可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)能量攝入抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)，其主要代謝產(chǎn)物為乙酸和丙酸[36]。雙歧桿菌和腸球菌屬是益生菌，具有增強(qiáng)免疫，阻止有害菌黏附以及幫助宿主消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等多種生理功能[37-38]。因此，PCP 可能通過(guò)促進(jìn)雙歧桿菌和腸球菌等有益菌的增殖，抑制大腸桿菌、志賀氏菌的增殖，來(lái)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)并發(fā)揮益生元活性。此外，PCP 與INU 對(duì)腸道菌群調(diào)節(jié)趨勢(shì)相似但調(diào)節(jié)能力有所差異，PCP 組中雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）的相對(duì)豐度顯著高于INU 組（P＜0.05），除巨單胞菌屬（Megamonas）、擬桿菌屬（Bacteroides）、戴阿利斯特桿菌屬（Dialister）外，PCP 組與INU 組的其它主要優(yōu)勢(shì)菌群均有顯著差異（P＜0.05）。

圖5 t-檢驗(yàn)分析屬水平組間顯著性差異Fig.5 Significant difference on genus level by Student’s t-test bar plot

2.5 發(fā)酵過(guò)程中SCFAs 的變化

SCFAs 作為人體腸道菌群的發(fā)酵產(chǎn)物，能夠起到維持腸道水電解質(zhì)平衡、抑制病原微生物、調(diào)節(jié)菌群平衡和抗炎等重要作用[39]。膳食中的碳水化合物是腸道微生物發(fā)酵產(chǎn)生SCFAs 的主要底物[40]。如表3 所示，經(jīng)過(guò)體外厭氧發(fā)酵24 h 后，PCP 組的乙酸含量顯著高于INU 組（P＜0.05），是CON 組的6.7倍，這可能與PCP 促進(jìn)產(chǎn)乙酸的雙歧桿菌、巨單胞菌豐度顯著增加（P＜0.05）有關(guān)，乙酸通常被認(rèn)為是雙歧桿菌等有益菌的發(fā)酵產(chǎn)物，能夠通過(guò)激活G 蛋白偶聯(lián)受體調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境，并能夠作為周?chē)M織的能量來(lái)源[33,41]。

表3 體外發(fā)酵過(guò)程中不同 SCFAs 含量的變化（mmol/L）Table 3 Changes in different SCFAs content during in vitro fermentation (mmol/L)

此外，經(jīng)過(guò)24 h 發(fā)酵，丙酸在PCP 和INU 組均有顯著增加（P＜0.05），這可能與巨單胞菌有關(guān)，巨單胞菌可產(chǎn)乙酸和丙酸[33]，PCP 和INU 均能顯著增加巨單胞菌豐度（P＜0.05）。丙酸經(jīng)腸道細(xì)菌產(chǎn)生后，可被人體吸收進(jìn)入血液隨后轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，下調(diào)肝臟和血漿中的脂肪酸含量，抑制免疫過(guò)度激活，提高胰島素敏感性，并對(duì)肝癌細(xì)胞有抗增殖作用[42]。丁酸可以由腸道細(xì)菌代謝未消化的碳水化合物產(chǎn)生，也可通過(guò)對(duì)乙酸及乳酸的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生，與結(jié)腸細(xì)胞的抗炎和抗腫瘤作用相關(guān)[43]，丁酸在三組中雖有顯著差異（P＜0.05），但整體含量占比低。此外，PCP 組中總的SCFAs 含量顯著增加（P＜0.05），與CON 組相比，增加了3.2倍。SCFAs 的產(chǎn)生能夠降低周?chē)h(huán)境的pH，有利于雙歧桿菌等益生菌的生長(zhǎng)[44]。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)體外模擬口腔、胃與小腸消化與體外糞便細(xì)菌發(fā)酵模型，探究了PCP 的抗消化特性及其對(duì)于腸道菌群結(jié)構(gòu)與短鏈脂肪酸代謝產(chǎn)物的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，PCP 與INU 具有相似的活性，具有抗消化性，能夠到達(dá)結(jié)腸被腸道菌群所利用，并能調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的活性，促進(jìn)雙歧桿菌等有益菌群增殖，促進(jìn)乙酸與丙酸等短鏈脂肪酸代謝產(chǎn)物含量，是一種潛在的益生元。本研究為多花黃精多糖作為功能因子開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了理論依據(jù)，同時(shí)，后續(xù)研究需要進(jìn)一步明確多糖功效成分的結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其活性功效。

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