李心智，劉 希，徐新玉，周其洋,5，吳昌正,6，童 星,5, ，歐仕益1,

（1.暨南大學(xué)食品科學(xué)與工程系，廣東廣州 510632；2.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司，廣東佛山 528000；3.佛山市海天（高明）調(diào)味食品有限公司，廣東佛山 528511；4.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司，廣東佛山 528000；5.廣東省調(diào)味食品生物發(fā)酵先進(jìn)技術(shù)企業(yè)重點實驗室，廣東佛山 528000；6.廣東省釀造微生物育種與發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，廣東佛山 528000）

醬油是起源于我國的一種傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品，具有濃厚的鮮咸口感和獨特的香氣，廣泛流行于中國、日韓及其他亞洲地區(qū)[1]。在醬油傳統(tǒng)釀造工藝中，醬油制曲和醬醪發(fā)酵都是在非無菌的環(huán)境中進(jìn)行的，因此原生微生物菌落的生長代謝對醬油風(fēng)味的形成具有重要影響[2]。醬油作為亞洲消費者日常生活中的必需調(diào)味料，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于人們?nèi)粘ｏ嬍澈团腼冎?。隨著健康飲食意識的提高，人們開始注意限制食物中鈉鹽的日常攝入。數(shù)據(jù)顯示，在許多亞洲國家和地區(qū)，人們?nèi)粘z入的鈉鹽有80%來自醬油和醬料等調(diào)味品[3]。因此，開發(fā)出風(fēng)味和品質(zhì)較好的減鹽醬油和醬料成為調(diào)味品行業(yè)發(fā)展的新趨勢，且具有巨大的市場潛力。

開發(fā)減鹽醬油的關(guān)鍵技術(shù)問題之一為腐敗微生物的防控：因為鹽分降低后，發(fā)酵醬油中的環(huán)境滲透壓隨之降低，對有害微生物抑制力度降低；問題之二為醬油風(fēng)味調(diào)控：鹽分降低后，傳統(tǒng)嗜鹽發(fā)酵微生物的生長代謝受到影響，從而影響了發(fā)酵醬油中風(fēng)味物質(zhì)的形成[4]。LIN 等[5]提出減鹽醬油的研發(fā)的關(guān)鍵為調(diào)控和利用好關(guān)鍵發(fā)酵微生物如酵母和乳酸菌的相互作用，在降低有害微生物污染的同時保證醬油風(fēng)味物質(zhì)的形成。醬醪微生物的生長規(guī)律及代謝作用與體系中的鹽分濃度、溫度控制關(guān)系較大，其中，活性乳酸菌和酵母之間的拮抗作用對醬油的風(fēng)味形成影響較大[1]。尹文穎等[6]探究了不同發(fā)酵溫度（25 ℃、35 ℃、自然溫度）對高鹽稀態(tài)醬油原油品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)在25 ℃下發(fā)酵60 d 獲得的原油品質(zhì)和風(fēng)味最好，這款原油的總氮、氨基酸態(tài)氮、還原糖等理化指標(biāo)均為最高。于茜雅等[7]探究37、30、15 ℃和自然溫度對高鹽稀態(tài)發(fā)酵原油的品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)在30 ℃的溫度下發(fā)酵的原油中檢測到的醇類、酯類及酚類揮發(fā)性化合物的相對含量最豐富，且該組的感官評分最高，綜合品質(zhì)最佳。HOANG 等[8]發(fā)現(xiàn)，在醬醪發(fā)酵的第一個月，把溫度控制在15 ℃，后期再逐步升溫至30 ℃的工藝有利于調(diào)控前期乳酸菌和酵母的生長，從而影響整體醬油風(fēng)味形成，并獲得品質(zhì)更優(yōu)的發(fā)酵原油。

然而，目前國內(nèi)外有關(guān)溫度對發(fā)酵醬油風(fēng)味影響的研究多采用同一溫度的恒溫發(fā)酵工藝，關(guān)于梯度升溫發(fā)酵工藝的研究少有報道。因此，本文對兩種鹽分濃度—高鹽分（18%，w/v）和低鹽分（12%，w/v）的醬醪進(jìn)行梯度控溫發(fā)酵，并通過測定醬醪在發(fā)酵過程中的微生物計數(shù)、理化指標(biāo)的變化，以及發(fā)酵到期原油中游離氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成，探究梯度升溫工藝對不同鹽分下稀態(tài)發(fā)酵醬油風(fēng)味形成的影響，為開發(fā)出一種高品質(zhì)的低鹽發(fā)酵醬油提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

曲料和鹽水 佛山市海天（高明）調(diào)味食品股份有限公司；PCA、PDA、MRS 培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱生物公司；納他霉素、氯霉素、游離氨基酸標(biāo)準(zhǔn)樣 美國Sigma-Aldrich 公司；高濃度甲醛、氫氧化鈉溶液等測定試劑 天津市大茂化學(xué)試劑廠。

YXQ-70A 型立式壓力蒸汽滅菌器 上海東亞壓力容器制造有限公司；DL-CJ-2NDI 單面普及型潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；JC-100-SE 型恒溫培養(yǎng)箱 青島精誠儀器儀表有限公司；PHscan40 筆形 pH 計 上海般特儀器制造有限公司；905 自動電位滴定儀 瑞士萬通中國有限公司；1290 infinity ll 高壓液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、7890B-5977B 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；LA8080 高速氨基酸分析儀 日本株式會社日立高新技術(shù)科學(xué)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬醪制備與發(fā)酵 通過計算調(diào)整成曲和鹽水的混合比例，落黃后獲得高鹽分醬醪和低鹽分醬醪的含鹽量分別為18%和12%（w/v）。醬醪樣品以落黃日開始記為 0 d，這個發(fā)酵周期為 60 d。樣品在2 L的小型發(fā)酵罐中進(jìn)行靜態(tài)發(fā)酵。梯度升溫組的升溫調(diào)控分為四個階段：（a）0～5 d 發(fā)酵溫度為15 ℃；（b）5～15 d 發(fā)酵溫度為20 ℃；（c）15～30 d 發(fā)酵溫度為25 ℃；（d）30～60 d 發(fā)酵溫度為30 ℃。其中梯度升溫實驗組根據(jù)鹽分濃度標(biāo)記為TC12（鹽分濃度為12%）和TC18（鹽分濃度為18%），對應(yīng)的恒溫發(fā)酵對照組則持續(xù)在30 ℃（本項目所在地區(qū)進(jìn)行自然醬油發(fā)酵時的實際平均溫度）條件下發(fā)酵至到期，樣品標(biāo)記為C12 和C18。發(fā)酵過程中定期（約每5 d）對發(fā)酵樣品進(jìn)行通氣攪拌，并于第0、5、15、30、45 和60 d 進(jìn)行醬醪取樣約50 g，隨即進(jìn)行微生物計數(shù)和用手持式pH 計對醬醪進(jìn)行pH 測定；剩余樣品凍存留作后續(xù)理化分析。

1.2.2 微生物菌落計數(shù) 參考HOANG 等[8]微生物菌落計數(shù)的方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，將取得的醬醪樣品先用滅菌的0.85%鹽水進(jìn)行梯度稀釋至適宜濃度，取1.0 mL 稀釋液于平板內(nèi)，倒入PCA 培養(yǎng)基（添加5%氯化鈉），置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)約48 h，記錄總菌落數(shù)；取0.1 mL 稀釋液涂布于PDA 培養(yǎng)基（添加5%氯化鈉和0.1 g/L 氯霉素），置于30 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)48～72 h，記錄總酵母計數(shù)；取1.0 mL 稀釋液于平板內(nèi)，倒入MRS 培養(yǎng)基（添加5%氯化鈉0.5 g/L納他霉素），置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～36 h，記錄總?cè)樗峋嫈?shù)。

1.2.3 理化指標(biāo)的測定 各個發(fā)酵階段取樣的醬醪樣品壓榨過濾后獲得醬醪清液。還原糖的測定參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》的直接滴定法[9]；氨基酸態(tài)氮的測定使用GB 5009.235-2016《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》的甲醛滴定法[10]。游離氨基酸的含量測定根據(jù)GB/T 30987-2020《植物中游離氨基酸的測定》的方法進(jìn)行[11]。

1.2.4 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定 參考阮志強等[12]測定醬油揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的方法并作一定優(yōu)化后對樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行處理和進(jìn)樣測定。每個樣品測定三次平行并根據(jù)NIST 17.0 數(shù)據(jù)庫和內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行半定量分析。

樣品處理：吸取5.0 mL 原油和25 μL 濃度為3.30 μg/mL 的 2-辛醇溶液（內(nèi)標(biāo)物）于20 mL 頂空瓶中，在孵化器中于40 ℃平衡15 min，并在40 ℃下用CAR/PDMS 固相微萃取頭頂空萃取30 min。萃取完成后在進(jìn)樣口于250 ℃中解析1 min，完成進(jìn)樣。GC 條件：HP-INNOWax 毛細(xì)色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，程序升溫條件為40 ℃保持5 min，后以5℃/min 升溫至240 ℃，保持15 min。載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min。MS條件：EI 離子源，離子源溫度為250 ℃，電子能量為70 eV，四級桿和傳輸線溫度分別為200 ℃和220 ℃，質(zhì)量掃描范圍為35～500 amu。

1.2.5 感官評定 參考蘇國萬等[13]使用的醬油感官評價方法及標(biāo)準(zhǔn)（表1）進(jìn)行。本實驗邀請了22 位某調(diào)味品公司具有兩年以上醬油鑒評豐富經(jīng)驗的鑒評員（11 位男性和11 位女性，年齡分布在20～40 歲之間）對梯度升溫發(fā)酵樣品和恒溫發(fā)酵樣品進(jìn)行感官評價，并記錄其在各項評定標(biāo)準(zhǔn)上的得分，匯總處理。

表1 發(fā)酵原油感官鑒評評分指導(dǎo)Table 1 Scoring guidance for the sensory evaluation of fermented soy sauce

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實驗重復(fù)三次以上，數(shù)據(jù)使用SPSS Statistics 29.0 進(jìn)行分析，實驗結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，并進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05）；采用 Graph Pad Prism 8.0.1 軟件對實驗數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽分醬醪在不同發(fā)酵溫度過程中微生物菌落計數(shù)變化

醬油的發(fā)酵主要依賴多種耐鹽微生物的協(xié)同作用，微生物菌群在醬油發(fā)酵過程中會隨著營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、環(huán)境的改變和微生物間的相互作用而呈現(xiàn)出動態(tài)變化[14]。圖1 匯總了恒溫和梯度升溫發(fā)酵樣品過程中兩種鹽分濃度中的總菌落數(shù)、總酵母數(shù)和總?cè)樗峋鷶?shù)的變化過程。

圖1 鹽分濃度為12%和18%的醬醪在不同控溫發(fā)酵過程中微生物變化Fig.1 Microbial changes of sauce mash with salt concentrations of 12% and 18% during different temperature-controlled fermentation

其中，如圖1（A）、（B）所示，不同溫度和鹽分的發(fā)酵樣品均呈現(xiàn)總菌落數(shù)隨著發(fā)酵時間延長而逐漸降低的趨勢，由落黃時的6.5 log CFU/g 稍升高后逐漸下降。梯度升溫的TC12 樣品總菌落數(shù)在發(fā)酵至60 d 時仍維持在4.5 log CFU/g 水平，表明在低鹽分醬醪中，發(fā)酵前期較低的溫度或有利于保留微生物在發(fā)酵后期的活性，防止其在后期因營養(yǎng)不足或環(huán)境pH大幅降低而大量死亡的情況[15]。而在高鹽分醬醪中，梯度升溫工藝對總微生物的生長繁殖影響并不明顯，表現(xiàn)為C18 和TC18 的總菌落變化無顯著差異。

在傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)醬油的醬醪發(fā)酵的體系中，酵母主要隨著曲料自然帶入，對醬油風(fēng)味的形成至關(guān)重要[16]。如圖1（C～F）所示，在發(fā)酵前期，乳酸菌對原料中的蛋白質(zhì)和糖類進(jìn)行分解代謝的活動較為活躍，而酵母的增殖主要處于被抑制或較緩慢狀態(tài)。當(dāng)體系中有機酸逐漸積累導(dǎo)致醬醪環(huán)境的酸度逐漸增強后，酵母菌的增殖代謝則有一定提升[17]。到后期，由于體系營養(yǎng)中的成分的消耗和某些有害細(xì)胞代謝物的積累，酵母和其他微生物的生長則再次受到抑制[18]。在本研究中，平板計數(shù)獲得的總酵母數(shù)量隨著醬醪發(fā)酵進(jìn)程的進(jìn)行，基本呈現(xiàn)先增殖后下降的規(guī)律，基本符合文獻(xiàn)報道的醬油酵母的生長規(guī)律。梯度升溫發(fā)酵樣品TC12 比恒溫發(fā)酵樣品檢測到酵母數(shù)在發(fā)酵后期多1.0 log CFU/g 左右，或因梯度升溫工藝有效地控制酵母在前期的快速生長繁殖，后期有較多酵母菌仍保有較高活性[8]。

在本研究的醬醪發(fā)酵過程中，乳酸菌一直是其中的優(yōu)勢群體，尤其是在發(fā)酵前期，總?cè)樗峋嫈?shù)高達(dá)6.0 log CFU/g 以上。在高鹽醬油發(fā)酵中，常見的乳酸菌如噬鹽四聯(lián)球菌等在發(fā)酵前期生長代謝十分活躍，參與原料的蛋白質(zhì)和糖類的分解，同時通過自身代謝途徑降解氨基酸，生成相應(yīng)的風(fēng)味有機酸和香氣物質(zhì)等[19]。在醬醪發(fā)酵后期，由于營養(yǎng)物質(zhì)的消耗、環(huán)境酸度的增加和細(xì)胞代謝物的積累，體系中的乳酸菌的生長逐漸受到抑制[20]。在本實驗中，乳酸菌的計數(shù)最終降至約2.5～3.5 log CFU/g 水平。在本研究中，梯度升溫和恒溫發(fā)酵醬醪的乳酸菌計數(shù)變化規(guī)律較為相似，或因梯度升溫工藝對醬醪發(fā)酵乳酸菌的生長代謝的影響并不顯著。

2.2 不同鹽分醬醪在不同發(fā)酵溫度過程中理化指標(biāo)的變化

不同鹽分醬醪在恒溫和梯度升溫工藝下，樣品的pH、還原糖和氨基酸態(tài)氮的變化如圖2 所示?？梢?，醬醪在落黃時的pH 大致為5.8，并隨著發(fā)酵的推進(jìn)而逐漸下降。高鹽分組的pH 在發(fā)酵結(jié)束時下降至5.0 左右，而低鹽分組的pH 則大幅下降至約4.5。整體來講，梯度升溫發(fā)酵的樣品pH 下降速率較恒溫發(fā)酵樣品低，表明在發(fā)酵前期的低溫調(diào)控或有效地抑制了部分產(chǎn)酸微生物的增殖，防止低鹽體系中的環(huán)境變酸過快。

圖2 鹽分濃度為12%和18%的醬醪在不同控溫發(fā)酵過程中各項理化指標(biāo)的變化Fig.2 Changes of physicochemical index of sauce mash with salt concentrations of 12% and 18%during different temperature-controlled fermentation

四組樣品的還原糖含量均出現(xiàn)稍升高后下降的情況。在低鹽分組中，恒溫發(fā)酵的C12 樣品還原糖含量由初始的4.0 g/100 g 左右到第5 d 先升高至4.5 g/100 g，然后下降至發(fā)酵結(jié)束時約1.3 g/100 g 水平；梯度升溫發(fā)酵的TC12 的還原糖含量則在第15 d 升高至峰值約5.1 g/100 g，然后下降至發(fā)酵結(jié)束時的1.5 g/100 g 水平。在高鹽分組中，C18 和TC18 樣品的還原糖含量分別在第5 d 內(nèi)升高至4.2和4.4 g/100 g 左右，后逐漸下降至發(fā)酵結(jié)束時的約1.6 g/100 g。還原糖含量在發(fā)酵過程中是一個不斷生成和被消耗的動態(tài)過程[21]。還原糖含量在發(fā)酵初期的短暫升高可能是由于曲料中的淀粉酶在發(fā)酵前期依然具有較高活性，將原料中的淀粉降解成葡萄糖等，導(dǎo)致測定的還原糖含量升高[22]。同時，微生物在發(fā)酵前期也在逐漸開始消耗還原糖，但由于發(fā)酵前期還原糖的生成速率比消耗速率更高，于是出現(xiàn)了還原糖含量短暫升高的情況[21]。因為高濃度鹽分對米曲霉的酶活具有一定的抑制作用，因此出現(xiàn)低鹽分組樣品在前期的還原糖生成率比高鹽分組更高的情況[1]。

氨基酸態(tài)氮的含量是評價發(fā)酵醬油質(zhì)量高低的重要指標(biāo)之一[23]。我國釀造醬油標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，醬油中氨基酸態(tài)氮指標(biāo)≥0.8 g/100 mL（對應(yīng)為≥1.0 g/100 g）可評價為特級醬油[24]。如圖2（E）、（F）所示，發(fā)酵至60 d 時，低鹽分發(fā)酵樣品C12、TC12 和高鹽分發(fā)酵樣品C18、TC18 的氨基酸態(tài)氮含量分別為1.06、1.14 g/100 g 和1.07、1.10 g/100 g，均達(dá)到特級醬油的等級。氨基酸態(tài)氮的升高主要由米曲霉中的酶系對原料中的蛋白質(zhì)、多肽等進(jìn)行水解的結(jié)果；而另一方面，微生物代謝和體系中的美拉德反應(yīng)也會消耗掉一部分氨基酸態(tài)氮，導(dǎo)致其含量下降[22]。在低鹽分組中，恒溫和梯度升溫樣品的氨基酸態(tài)氮的含量呈均勻上升趨勢，兩者在氨氮的生成速率方面并無顯著差異。在高鹽分組中，梯度升溫組TC18 中的氨基酸態(tài)氮在30 d 前生成速率低于恒溫組C18，但在30 d 后則開始快速生成甚至速率超過恒溫樣品。這個現(xiàn)象和KUANG 等[25]在他們的研究中提及的情況相似，推測為在高鹽分的條件下，米曲霉的酶活受到一定抑制，而生成氨基氮的微生物在恒溫條件下發(fā)酵初期生長良好；而到后期，營養(yǎng)的缺乏或是造成恒溫發(fā)酵組氨基酸態(tài)氮生成速率降低的原因。

2.3 不同鹽分醬醪發(fā)酵到期樣品中的游離氨基酸含量

恒溫和梯度升溫發(fā)酵到期樣品（60 d）和未發(fā)酵醬醪（0 d）的游離氨基酸對比情況匯總于表2。如表2 所示，經(jīng)過60 d 發(fā)酵后的四個樣品的氨基酸含量都較未發(fā)酵樣品顯著增高（P＜0.05），其中，梯度升溫發(fā)酵的TC12 和TC18 樣品的氨基酸總量比未發(fā)酵樣品高出2 倍以上。其中，TC18 的總鮮味氨基酸含量最高，達(dá)20.07 g/L，占該樣品總游離氨基酸比例約32.4%；而TC12 的總甜味氨基酸最高，為19.32 g/L，約占29.7%?？梢姲l(fā)酵前期的低溫調(diào)控能有效地保留了部分水解力較強的微生物在發(fā)酵后期的活性，能在發(fā)酵后期更充分地生成有利風(fēng)味的物質(zhì)[8]。不同鹽分的恒溫發(fā)酵樣品（C12 和C18）在60 d 時的各個類別氨基酸含量占總游離氨基酸的比例并無顯著差異（其中鮮味、甜味和苦味氨基酸占比分別為31%、27%和42%左右），推測可能因為醬醪中營養(yǎng)物質(zhì)有限，在足夠長的發(fā)酵時間內(nèi)，不同鹽分濃度下的微生物基本都能水解原料生成相似含量的氨基酸[26]。

表2 鹽分濃度為12%和18%的醬醪在不同控溫發(fā)酵后游離氨基酸的含量（g/L）Table 2 Free amino acid contents of sauce mash with salt concentrations of 12% and 18% after different temperature-controlled fermentation (g/L)

游離氨基酸在醬油原油中貢獻(xiàn)了鮮、甜、酸等味覺感受，是醬油獨特滋味的重要呈現(xiàn)物質(zhì)之一[1]?？梢?，梯度升溫發(fā)酵的TC12 和TC18 在鮮甜這些讓人愉悅口感的呈現(xiàn)上或有一定優(yōu)勢。另一方面，游離氨基酸也是后期原油維溫?zé)崽幚碇邪l(fā)生美拉德反應(yīng)的重要前提物之一，對最終醬油的風(fēng)味形成至關(guān)重要[27]。例如，含硫氨基酸半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met），雖然在單體水溶液中呈現(xiàn)苦味，但能在美拉德反應(yīng)中和還原糖（特別是戊糖類）反應(yīng)生成各類含硫的“醬香、燒烤和鮮咸香氣”的揮發(fā)性物質(zhì)，如2-糠硫醇（2-furfurylthiol）、5-甲基噻吩-2-甲醛（5-methyl-2-thiophenecarboxaldehyde）和甲硫基丙醛（3-（methylthio）propionaldehydel）等，對醬油成品的整體特征風(fēng)味的構(gòu)成十分重要[28]。梯度升溫發(fā)酵的TC12 和TC18 中較多的Cys 和Met 含量或有利于原油后期熱處理階段的“醬香、焦香”等風(fēng)味的進(jìn)一步生成，對醬油產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)具有較強的提升作用。

2.4 不同鹽分醬醪發(fā)酵到期樣品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量

表3 呈現(xiàn)了在恒溫與梯度升溫發(fā)酵工藝下不同鹽分濃度發(fā)酵到期原油的揮發(fā)性成分的含量。顯然，發(fā)酵后的醬醪中總揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量均顯著提升，原油風(fēng)味明顯增強。作為酵母最重要的代謝產(chǎn)物之一，揮發(fā)性乙醇的含量在發(fā)酵后整體增加2～3 倍。低鹽分組中梯度升溫的TC12 樣品中乙醇含量最高，達(dá)到491.69 μg/L 左右；C12 樣品中乙醇含量約為403.71 μg/L。高鹽分組的乙醇含量相對較少，均為330 μg/L 左右。可見，低鹽分的稀態(tài)醬醪發(fā)酵體系中的較低滲透壓對體系中的微生物特別是酵母的生長代謝有利，不僅有利于進(jìn)一步提升原油的“酒香和醬香”，還對低鹽分原油的腐敗菌防控有一定的幫助[18]。與乙醇的形成相似的是，低鹽分發(fā)酵原油中酯類含量比高鹽分原油要更高，如苯乙酸乙酯和棕櫚酸乙酯，在TC12 組中含量分別約為6.15 和74.84 μg/L，而在對應(yīng)的高鹽分組TC18 中含量約為1.89 和51.93 μg/L。“花香、果香型和奶香”型的酯類的生成為酵母的代謝的特征性揮發(fā)性成分之一，再次驗證了本研究中低鹽分發(fā)酵樣品的酵母生長代謝對風(fēng)味形成的優(yōu)勢[29]。3-甲硫基丙醛（10.22 μg/L）和苯甲醛（19.49 μg/L）等與“燒烤、焦香”有關(guān)的揮發(fā)性化合物同樣在低鹽分組（TC12）中含量也較高，其中，3-甲硫基丙醛和苯甲醛等的增多推測均為酵母或乳酸菌對苯丙氨酸等相關(guān)氨基酸通過Ehrlich 路徑的代謝的產(chǎn)物，是構(gòu)成醬油香氣的重要揮發(fā)性物質(zhì)之一[19-20,22]。然而，與醬油的“煙熏、醬香”有關(guān)的酚類物質(zhì)如愈創(chuàng)木酚和甲基麥芽酚等，在高鹽分組含量更多（在TC18 中含量分別約為2.47 和7.96 μg/L）。這或和其中嗜鹽微生物如魯氏接合酵母、噬鹽四聯(lián)球菌等在高鹽分體系中占據(jù)主導(dǎo)發(fā)酵地位有關(guān)[1,14]。LIU 等[22]曾在高鹽稀態(tài)醬醪發(fā)酵初期接入魯氏接合酵母，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵到期的原油中愈創(chuàng)木酚含量顯著增高，醬油的風(fēng)味明顯提升。本研究中其他常見的揮發(fā)性化合物如苯乙醛、苯乙醇、異戊醛和2-甲基丁醛等，在不同鹽分條件下生成的含量無顯著差異。可見，降低醬醪發(fā)酵環(huán)境中的鹽分濃度或能導(dǎo)致發(fā)酵到期原油的風(fēng)味從原來的更具“焦香、煙熏和醬香”的風(fēng)味型轉(zhuǎn)變?yōu)槠盎ㄏ?、蜜香和酯香”更濃郁的風(fēng)味型。

表3 鹽分濃度為12%和18%的醬醪在不同控溫發(fā)酵后揮發(fā)性化合物的含量（μg/L）Table 3 Contents of volatile compounds in sauce mash with salt concentrations of 12% and 18% after different temperature-controlled fermentation (μg/L)

2.5 感官鑒評

本研究根據(jù)不同發(fā)酵工藝獲得的四款發(fā)酵原油在經(jīng)過短時間熱處理滅菌后，共邀請22 名對醬油產(chǎn)品感官鑒評有豐富經(jīng)驗的從業(yè)者，采取評分法對樣品進(jìn)行感官鑒評。其中醬油原油的評分標(biāo)準(zhǔn)參考表1所示指導(dǎo)表進(jìn)行[13]。本次評分鑒評結(jié)果匯總于圖3。結(jié)果顯示，在高鹽分發(fā)酵條件下，梯度升溫發(fā)酵（TC18）和恒溫發(fā)酵組（C18）樣品在色澤、香氣、滋味、體態(tài)及綜合喜愛度的得分都十分接近，其中香氣的得分最高約為3.6，而滋味的得分最低只有2.45 水平。表明高鹽分發(fā)酵原油在“醬香”的生成方面較好，而滋味方面或由于樣品過咸、口感偏苦澀而抑制了其鮮甜醇厚味的呈現(xiàn)，導(dǎo)致評分降低[30]。另一方面，梯度升溫發(fā)酵的樣品TC12 樣品的滋味、香氣、色澤和綜合喜好得分均高于恒溫發(fā)酵樣品。其中，TC12 中更高的色澤評分或由于發(fā)酵過程中微生物并未過度消耗還原糖，使得部分還原糖能參與到后期熱反應(yīng)的美拉德反應(yīng)中，形成更深的醬油色[31]。TC12 中更好的香氣和滋味得分或得益于梯度升溫發(fā)酵工藝下，酵母和乳酸菌等功能性微生物在后期仍保有較高活性，繼而持續(xù)生成和積累更多的香氣和滋味物質(zhì)，形成更好的原油風(fēng)味[8]。綜上，梯度升溫發(fā)酵工藝有效地改善了低鹽分發(fā)酵原油的風(fēng)味不足的問題。

圖3 鹽分濃度分別為12%和18%的發(fā)酵原油感官鑒評得分Fig.3 Sensory scores of fermented soy sauce with salt concentrations of 12% and 18%

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用梯度升溫工藝的低鹽分醬醪樣品（TC12）的酵母計數(shù)在發(fā)酵到期時比恒溫對照組（C12）要高1.0 log CFU/g 左右，且該組發(fā)酵原油中檢測氨基酸態(tài)氮高達(dá)1.14 g/100 g，醬油品質(zhì)較高；其中，TC12 中的鮮味（19.03 g/L）和甜味氨基酸（19.32 g/L）含量較高，呈現(xiàn)較好的鮮甜滋味。揮發(fā)性物質(zhì)檢測同樣指出TC12 中的乙醇、苯乙酸乙酯、棕櫚酸乙酯、3-甲硫基丙醛和苯甲醛等含量較高，其中TC12 中的苯乙酸乙酯和棕櫚酸乙酯含量較TC18 組高出1.5～3 倍，整體呈現(xiàn)強烈的“水果甜香和酯香”。但該低鹽升溫發(fā)酵工藝產(chǎn)出的原油與傳統(tǒng)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中的“焦香、醬香”型風(fēng)味特征仍有一定差距。因此，在將來的研究中，可考慮在梯度升溫工藝的基礎(chǔ)上，向低鹽醬醪中添加部分耐鹽酵母（如魯氏接合酵母等）和耐鹽乳酸菌（如噬鹽四聯(lián)球菌等），增加低鹽醬醪中呈“焦香、醬香”等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的形成，進(jìn)一步縮小低鹽發(fā)酵原油與傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵原油的風(fēng)味差距。

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