何星瑤，王 玉，王君淑，王曉匯，邸 琳，劉新宇，趙宏宇,*，張鳳清

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)，吉林長(zhǎng)春 130012；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院 藥效毒理評(píng)價(jià)中心，吉林長(zhǎng)春 130012；3.敦化市市場(chǎng)監(jiān)督管理局，吉林敦化 133700）

林蛙油（Oviductus Ranae，OR），中藥名哈蟆油，為中國(guó)林蛙（Rana temporaria chensinesisDavid）雌蛙輸卵管干制品，是珍貴的保健品?，F(xiàn)代藥理研究表明，林蛙油中富含多種生物活性物質(zhì)，在抗疲勞、抗氧化、增強(qiáng)免疫力方面有一定的功效[1-2]，在改善女性更年期綜合征方面效果良好[3-4]。動(dòng)物研究中發(fā)現(xiàn)林蛙油對(duì)大鼠體內(nèi)雌激素水平具有顯著提高的作用，并且其作用機(jī)理與卵巢卵泡發(fā)育有著密不可分的關(guān)系[5-7]。

課題組為研究林蛙油的雌激素樣作用已開(kāi)展了幾個(gè)階段的研究：在第一階段研究中發(fā)現(xiàn)[8]林蛙油對(duì)去卵巢大鼠不體現(xiàn)出雌激素樣作用，由此發(fā)現(xiàn)林蛙油的雌激素樣作用功能依賴于卵巢，很可能是調(diào)節(jié)卵巢而產(chǎn)生的作用，且林蛙油的雌激素樣作用與外源雌激素作用不同，是通過(guò)影響卵巢內(nèi)生長(zhǎng)期卵泡發(fā)育程度導(dǎo)致血清雌激素水平提升的結(jié)果。為進(jìn)一步探討林蛙油的雌激素樣機(jī)制，第二階段進(jìn)行了林蛙油對(duì)卵泡發(fā)育障礙大鼠和正常大鼠卵泡發(fā)育的研究，在卵泡發(fā)育障礙模型中發(fā)現(xiàn)[9]，林蛙油能夠促進(jìn)大鼠卵巢PI3K蛋白表達(dá)及Akt 蛋白磷酸化水平，能夠下調(diào)卵泡發(fā)育障礙的大鼠卵巢內(nèi)PTEN mRNA 表達(dá)，上調(diào)PI3K蛋白表達(dá)，促進(jìn)Akt 蛋白磷酸化水平升高。在林蛙油對(duì)卵泡發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)[10]，大鼠連續(xù)灌胃林蛙油8 周后，血清激素、卵巢組織學(xué)變化和懷胎情況，均出現(xiàn)了卵巢過(guò)度刺激進(jìn)而呈現(xiàn)早衰的現(xiàn)象，PI3K/Akt 信號(hào)通路在mRNA 水平上有上調(diào)作用；經(jīng)過(guò)前期一系列研究發(fā)現(xiàn)林蛙油的雌激素樣作用可能是刺激大鼠卵巢并與卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）技術(shù)是一種新型高通量測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面研究，可以同時(shí)測(cè)量數(shù)千個(gè)基因的表達(dá)水平并提供特定的功能途徑與生物過(guò)程[11]。近年來(lái)對(duì)卵巢的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究中發(fā)現(xiàn)了幼鼠與成年鼠卵巢的轉(zhuǎn)錄組差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一些調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育的關(guān)鍵基因與重要的功能通路如細(xì)胞調(diào)亡等[12]；以及應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)探索了環(huán)磷酰胺代謝產(chǎn)物損傷卵巢顆粒細(xì)胞的差異表達(dá)基因與信號(hào)通路的影響等[13]。

本次研究中，選用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CTX）造模建立大鼠卵泡發(fā)育障礙模型，依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)選擇林蛙油生物活性較好的灌胃周期，進(jìn)一步通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)角度分析林蛙油的雌激素樣作用對(duì)卵泡發(fā)育的影響并探索除PI3K/Akt 信號(hào)通路以外的可能涉及到的信號(hào)通路，為林蛙油的雌激素樣作用機(jī)制研究提供充足的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Wistar 大鼠 SPF 級(jí)、雌性、體質(zhì)量190±20 g、60 只，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK（遼）2020-0001；林蛙油 通化德正堂野生資源開(kāi)發(fā)有限公司，經(jīng)吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院邸琳主任藥師鑒定為中國(guó)林蛙（Rana chensinesis）雌蛙輸卵管干制品；環(huán)磷酰胺 大連美侖生物技術(shù)有限公司；戊酸雌二醇 DELPHARM Lille SAS；克羅米芬片 塞浦路斯Medochemie Ltd 公司；醋酸甲地孕酮分散片 青島國(guó)海生物制藥有限公司；革蘭氏染色液（快速法） 珠海貝索生物技術(shù)有限公司；雌二醇（Estradiol，E2）、孕酮（Progesterone，P）、促黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、促卵泡生成素（Follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、睪酮（Testosterone，T）放射免疫法試劑盒 北京北方生物技術(shù)研究所有限公司；戊巴比妥鈉 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醛 分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司。

XH 6080 型放免儀 西安核儀器廠；HC-3618R 高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；JA 2003 B 型千分之一電子天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；Y-2000 型電子天平 常熟雙杰測(cè)試儀器廠；L18-Y928 型攪拌機(jī) 九陽(yáng)股份有限公司；CX 23 型光學(xué)顯微鏡 日本Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組與給藥 SPF 級(jí)雌性Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量190±20 g，飼養(yǎng)條件：動(dòng)物室溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度55%～70%，12 h 明/暗循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)屏障系統(tǒng)IVC 籠具內(nèi)，本實(shí)驗(yàn)由吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(guò)（批準(zhǔn)號(hào) JLSZKYDWLL2021-012），符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后行陰道涂片，選擇發(fā)情周期明確且周期在 4～5 d 的大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（C）、模型組（M）、陽(yáng)性藥組（P）、林蛙油低（ORL）、高（ORH）劑量組，每組12 只大鼠。對(duì)照組腹腔注射等體積生理鹽水，除對(duì)照組外，其余大鼠均腹腔注射環(huán)磷酰胺14 d（首日100 mg/kg，后續(xù)10 mg/kg）建立卵巢損傷大鼠模型；造模次日，林蛙油低、高劑量組以200、400 mg/kg 灌胃劑量灌胃林蛙油溶液，陽(yáng)性藥組選用人工周期加促排卵治療方式，每5 d 為一個(gè)治療循環(huán)，前3 d 灌胃戊酸雌二醇溶液0.1 mg/kg、第4 d 灌胃戊酸雌二醇溶液0.1 mg/kg 和醋酸甲地孕酮溶液0.8 mg/kg、第5 d 不給藥。末次給藥前2 d 灌胃枸櫞酸氯米芬溶液10 mg/kg 直至處理；對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水，各組大鼠每次灌胃體積均為20 mL/kg，連續(xù)灌胃14～16 d（依據(jù)處理時(shí)期，灌胃時(shí)長(zhǎng)之調(diào)整），每間隔3 d 稱量體質(zhì)量。

1.2.2 動(dòng)物處理及取材 自造模10 日起各組大鼠每日制作陰道涂片判斷大鼠所在發(fā)情時(shí)期[14]，從而計(jì)算發(fā)情周期。選擇灌胃達(dá)到14 d 以上且同時(shí)處于發(fā)情前期的大鼠處理。末次灌胃2 h 后，大鼠3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉后腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min 離心10 min，取血清-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｕ∽訉m、卵巢，稱量重量計(jì)算器官指數(shù)（器官指數(shù)=器官重量/體質(zhì)量×1000），一側(cè)卵巢及子宮4%多聚甲醛固定保存?zhèn)溆?，另一?cè)卵巢液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 血清性激素檢測(cè) 取大鼠血清，依照放免法試劑盒說(shuō)明書(shū)中步驟操作，測(cè)定其中E2、P、T、FSH、LH 含量。

1.2.4 卵巢及子宮組織病理學(xué)觀察 取于4%多聚甲醛固定48 h 后的卵巢及子宮，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片，蘇木素-伊紅（HE）染色后，中性樹(shù)膠封片。全切片掃描觀察卵巢及子宮組織的形態(tài)學(xué)變化，計(jì)算卵巢的竇前卵泡、竇狀卵泡、成熟卵泡及黃體數(shù)目并測(cè)定各組子宮內(nèi)膜厚度。

1.2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析 提取各組大鼠卵巢組織（每組隨機(jī)選取3 只）總RNA，經(jīng)檢測(cè)合格后用于RNA-seq。構(gòu)建cDNA 文庫(kù)，利用Illumina Nova-Seq 6000 型測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序，F(xiàn)astQC 評(píng)估原始測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量，過(guò)濾得到Clean reads。使用TopHat2 的升級(jí)版HISAT2（http://ccb.jhu.edu/software/hisat2/index.shtml）軟件將過(guò)濾后的 Reads 比對(duì)到參考基因組上。隨后進(jìn)行參考基因比對(duì)、冗雜序列分析、均一性分布及基因覆蓋率等分析。樣本處理、上機(jī)測(cè)序及數(shù)據(jù)可視化分析均由上海派森諾生物科技股份有限公司協(xié)助完成。

1.2.6 差異表達(dá)基因（Differentially expressed genes，DEGs）篩選 采用DESeq 基于負(fù)二項(xiàng)分布對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，篩選差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)差異倍數(shù) |log2FoldChange|＞1，顯著性P＜0.05。篩選后分別得到模型組與對(duì)照組DEGs、陽(yáng)性藥組與模型組DEGs，林蛙油低、高劑量與模型組DEGs。利用派森諾基因云繪制火山圖，韋恩圖及熱圖。

1.2.7 GO 功能和KEGG 富集分析 基于基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（Gene Ontology，GO）與京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG），進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，找出與整個(gè)基因組背景相比，差異基因顯著富集的GO term 與KEGG pathway；并綜合分析結(jié)果，以確定差異基因行使的主要生物學(xué)功能。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本均數(shù)間比較采用Oneway ANOVA，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠一般情況觀察

如表1 所示，對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)敏捷，皮毛光滑，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠隨造模時(shí)間延長(zhǎng)，活動(dòng)減少，多數(shù)時(shí)間呈蜷縮狀，精神萎靡，皮毛黯淡，與對(duì)照組相比，體質(zhì)量極顯著減輕（P＜0.01）；陽(yáng)性藥組大鼠給藥一段時(shí)間后，反應(yīng)較敏捷，皮毛稍有光澤，暴躁易怒，體質(zhì)量與模型組相比無(wú)顯著性差異；林蛙油低、高劑量組大鼠給藥一段時(shí)間后，精神狀態(tài)良好，皮毛光滑，活動(dòng)量相對(duì)增多，體質(zhì)量相比模型組有上升趨勢(shì)但無(wú)顯著性差異。

表1 各組大鼠體質(zhì)量（，n=12）Table 1 Body weight of rats in each group (,n=12)

表1 各組大鼠體質(zhì)量（，n=12）Table 1 Body weight of rats in each group (,n=12)

注：與對(duì)照組大鼠比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組大鼠比較，#P＜0.05，##P＜0.01；表2～表4同。

2.2 林蛙油對(duì)大鼠卵巢、子宮濕重及器官指數(shù)的影響

如表2 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠卵巢、子宮質(zhì)量以及卵巢指數(shù)均降低，具有極顯著差異（P＜0.01），子宮指數(shù)顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，陽(yáng)性藥組大鼠子宮質(zhì)量以及子宮指數(shù)均升高，具有極顯著差異（P＜0.01）；林蛙油低劑量組大鼠子宮質(zhì)量以及子宮指數(shù)均顯著升高（P＜0.05），林蛙油高劑量組大鼠子宮質(zhì)量以及子宮指數(shù)均升高，具有極顯著差異（P＜0.01）。

表2 各組大鼠卵巢、子宮濕重及器官指數(shù)（，n=12）Table 2 Ovarian,uterine wet weight and organ index of rats in each group (,n=12)

表2 各組大鼠卵巢、子宮濕重及器官指數(shù)（，n=12）Table 2 Ovarian,uterine wet weight and organ index of rats in each group (,n=12)

2.3 林蛙油對(duì)大鼠血清性激素含量的影響

如表3 所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中FSH、LH 含量顯著上升，P、T、E2含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性藥組大鼠血清中FSH、LH 含量顯著降低（P＜0.05），P、T 含量顯著上升（P＜0.05），E2含量上升，差異有極顯著性（P＜0.01）；林蛙油低劑量組大鼠血清中FSH、LH 含量顯著降低（P＜0.05），P、T、E2含量顯著上升（P＜0.05）；林蛙油高劑量組大鼠血清中FSH 含量顯著降低（P＜0.05），P 含量顯著上升（P＜0.05），E2含量上升，差異有極顯著性（P＜0.01）。

表3 各組大鼠血清性激素含量（,n=8）Table 3 Serum sex hormone levels of rats in each group(,n=8)

表3 各組大鼠血清性激素含量（,n=8）Table 3 Serum sex hormone levels of rats in each group(,n=8)

綜合表2、表3 數(shù)據(jù)可知，環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致大鼠的FSH、LH 水平上升，P、E2水平降低，可能因其直接的靶器官毒性導(dǎo)致卵巢萎縮以及子宮無(wú)法響應(yīng)周期而增厚，表明腹腔注射環(huán)磷酰胺致卵巢損傷模型造模成功；陽(yáng)性藥組通過(guò)外源激素補(bǔ)充的方式提高了大鼠血清中孕激素和雌激素含量，從而對(duì)子宮起到了保護(hù)作用但對(duì)于卵巢沒(méi)有明顯改善，而林蛙油組表現(xiàn)出與陽(yáng)性藥類似的子宮保護(hù)作用，同時(shí)對(duì)卵巢也有一定的保護(hù)作用。

2.4 林蛙油對(duì)大鼠卵巢、子宮組織病理形態(tài)的影響

如表4、圖1、圖2 所示，對(duì)照組大鼠卵巢可見(jiàn)皮質(zhì)髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，皮質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)不同發(fā)育階段的各級(jí)卵泡和新鮮黃體，顆粒細(xì)胞飽滿豐富，髓質(zhì)層內(nèi)可見(jiàn)豐富血管；子宮切片鏡下可見(jiàn)子宮內(nèi)膜較厚，子宮腔大，腺體及結(jié)締組織豐富。

圖1 林蛙油對(duì)大鼠卵巢病理的影響（HE，40×）Fig.1 Effect of Oviductus Ranae on ovarian histopathology in rats (HE,40×)

圖2 林蛙油對(duì)大鼠子宮病理的影響（HE，400×）Fig.2 Effect of Oviductus Ranae on uterine histopathology in rats (HE,400×)

表4 各組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)量及子宮內(nèi)膜厚度（,n=6）Table 4 Number of follicles at each level and endometrial thickness in each group of rats (,n=6)

表4 各組大鼠各級(jí)卵泡數(shù)量及子宮內(nèi)膜厚度（,n=6）Table 4 Number of follicles at each level and endometrial thickness in each group of rats (,n=6)

與對(duì)照組相比，模型組大鼠卵巢切片鏡下可見(jiàn)卵巢體積明顯萎縮，卵泡發(fā)育不良，無(wú)成熟卵泡，顆粒細(xì)胞排列稀疏，竇前、竇狀卵泡、黃體數(shù)量顯著減少（P＜0.05）；子宮切片鏡下可見(jiàn)腺體數(shù)量減少，子宮內(nèi)膜呈單層立方上皮，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度變薄，差異有極顯著性（P＜0.01），基質(zhì)中血管少，基質(zhì)細(xì)胞數(shù)量少、子宮間質(zhì)萎縮，結(jié)締組織不豐富。表明環(huán)磷酰胺對(duì)卵泡數(shù)量及子宮均有負(fù)面影響，本實(shí)驗(yàn)卵巢損傷模型成立。

與模型組相比，大鼠卵巢切片鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性藥組和林蛙油低劑量組竇前、竇狀卵泡、黃體數(shù)量顯著增多（P＜0.05），林蛙油高劑量組竇前卵泡、黃體數(shù)量顯著增多（P＜0.05）；大鼠子宮切片鏡下可見(jiàn)陽(yáng)性藥組、林蛙油低、高劑量組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞厚度均增加，差異有極顯著性（P＜0.01）；表明陽(yáng)性藥及林蛙油均能改善環(huán)磷酰胺所致的卵泡與子宮的發(fā)育障礙，促進(jìn)竇前、竇狀卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，改善子宮組織結(jié)構(gòu)。陽(yáng)性藥組大鼠的竇前、竇狀卵泡數(shù)量的顯著提升提示可能與實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诮o予的枸櫞酸氯米芬刺激卵泡發(fā)育有關(guān)。

2.5 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組樣本可比對(duì)到參考基因組上的序列占總序列的比例均大于96%，Q30（測(cè)序質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于30 的堿基占所有堿基的百分?jǐn)?shù)）均大于93%，表明測(cè)序質(zhì)量良好，測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。見(jiàn)表5。

表5 Clean reads 的質(zhì)量與比對(duì)結(jié)果Table 5 Quality of Clean reads and comparison results

2.6 分析差異表達(dá)基因

如圖3A 所示，與對(duì)照組相比，模型組DEGs共1024 個(gè)，其中458 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，566 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。如圖3B 所示，與模型組相比，陽(yáng)性藥組DEGs 共353 個(gè)，其中190 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，163 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。如圖3C 所示，與模型組相比，林蛙油低劑量組DEGs 共738 個(gè)，其中233 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，505 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。如圖3D 所示，林蛙油高劑量組DEGs 共572 個(gè)，其中276 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，296 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。結(jié)果提示其可能為林蛙油對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育的作用靶點(diǎn)。

圖3 林蛙油對(duì)卵巢損傷大鼠差異表達(dá)基因（DEGs）的影響Fig.3 Effect of Oviductus Ranae on differentially expressed genes (DEGs) in ovarian-injured rats

如圖3E、3F 所示，對(duì)各組差異基因進(jìn)行韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)，四對(duì)差異比較中的共同交集基因共有71 個(gè)，對(duì)照/模型組與林蛙油低劑量/模型組和林蛙油高劑量/模型組之間成對(duì)的差異基因的共同交集基因分別有173、108 個(gè)，而對(duì)照/模型組與陽(yáng)性藥/模型組之間成對(duì)的差異基因的共同交集基因分別有28 個(gè)，這說(shuō)明林蛙油不同劑量之間以及陽(yáng)性藥對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡保護(hù)作用中，所調(diào)控的基因表達(dá)存在差異，而這種差異可能是作用的機(jī)制所在。

2.7 差異表達(dá)基因的GO 生物學(xué)功能分析

基因本體（Gene Oncology，GO）生物數(shù)據(jù)庫(kù)用于對(duì)基因及其蛋白功能進(jìn)行注釋，主要分為生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組件（cellular component，CC）和分子功能（moelcular function，MF）三個(gè)類別[15]。將各實(shí)驗(yàn)組DEGs 進(jìn)行富集分析，結(jié)果如下。

如圖4A 所示，對(duì)照組與模型組DEGs 共富集到1767 個(gè)GO 條目，其中在BP 中共富集到1357條，主要富集在免疫反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、對(duì)其他生物的反應(yīng)、防御反應(yīng)、對(duì)外部生物刺激的反應(yīng)等途徑；在CC 中共富集到159 條，主要富集在細(xì)胞外區(qū)、活動(dòng)纖毛、細(xì)胞表面等途徑；在MF 中共富集到251 條，主要富集在2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、鈣離子結(jié)合等途徑。

圖4 差異表達(dá)基因GO 富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of differentially expressed genes

如圖4B 所示，陽(yáng)性藥組與模型組DEGs 共富集到1268 個(gè)GO 條目，其中在BP 中共富集到1023條，主要富集在免疫系統(tǒng)過(guò)程、免疫反應(yīng)、對(duì)外部生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)等途徑；在CC 中共富集到85 條，主要富集在細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、質(zhì)膜等途徑；在MF 中共富集到160 條，主要富集在受體配體活性、信號(hào)受體激活劑活性、信號(hào)受體調(diào)節(jié)活性等途徑。

如圖4C、4D 所示，林蛙油低、高劑量組與模型組DEGs 分別共富集到1790、1616 個(gè)GO 條目，在BP 中分別富集到1416、1291 條，主要富集在免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)、免疫系統(tǒng)過(guò)程、對(duì)外部生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞黏附等途徑；在CC 中分別富集到153、128 條，主要富集在細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外圍、細(xì)胞外間隙等途徑；在MF 中分別富集到221、197 條，主要富集在細(xì)胞因子受體活性、免疫受體活性、2'-5'-寡腺苷酸合成酶活性、鈣離子結(jié)合等途徑。

2.8 差異表達(dá)基因的KEGG 代謝與信號(hào)通路分析

對(duì)照組與模型組DEGs 的KEGG 富集分析結(jié)果如圖5A 所示，涉及到43 個(gè)信號(hào)通路，富集的重要信號(hào)通路主要包括丙型肝炎、細(xì)胞黏附分子、病毒蛋白與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體的相互作用、甲型流感等。陽(yáng)性藥組與模型組DEGs 的KEGG 富集分析結(jié)果如圖5B 所示，涉及到32 個(gè)信號(hào)通路，富集的重要信號(hào)通路主要包括JAK/STAT 信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常、IL-17 信號(hào)通路等。林蛙油低、高劑量組與模型組DEGs 的KEGG 富集分析結(jié)果如圖5C、5D 所示，分別涉及到47、35 個(gè)信號(hào)通路，富集的重要信號(hào)通路主要包括PI3K/Akt 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、病毒性心肌炎、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路、IgA 產(chǎn)生的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、抗原處理和呈遞、炎癥性腸病、吞噬體等。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG 富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

綜合GO 及KEGG 富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，林蛙油能夠通過(guò)參與機(jī)體的代謝調(diào)節(jié)進(jìn)而保護(hù)受損卵巢的功能及卵泡的發(fā)育，通過(guò)免疫反應(yīng)、防御反應(yīng)激活細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞表面上受體靶標(biāo)等保護(hù)卵巢，進(jìn)而通過(guò)細(xì)胞因子、黏附因子、分泌因子等介導(dǎo)卵巢內(nèi)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育，各組間比較得出的富集重要信號(hào)通路（如PI3K/Akt、B 細(xì)胞受體信號(hào)通路等）提示其可能為林蛙油對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育作用的關(guān)鍵調(diào)控通路。

3 討論

近年來(lái)化療所致的女性性腺損害在臨床上已達(dá)成共識(shí)[16]。在化療藥物類別中，環(huán)磷酰胺在臨床中對(duì)卵巢的毒性很具代表性，并具有劑量依賴性效應(yīng)[17-18]，使用環(huán)磷酰胺造模為好的選擇，因此本實(shí)驗(yàn)選用環(huán)磷酰胺為造模用藥[19]，并且在預(yù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)環(huán)磷酰胺的劑量進(jìn)行了篩選，確定了100 mg+10 mg 為最佳給藥劑量，該造模劑量下，大鼠體重及器官指數(shù)下降明顯，且無(wú)死亡率，可保證一定的進(jìn)食飲水等生活狀態(tài)。

目前關(guān)于林蛙油提升血清雌激素水平功能的研究，主要集中在林蛙油中的雌激素樣物質(zhì)上，多數(shù)研究認(rèn)為服用后雌激素水平升高是通過(guò)外源性攝入林蛙油中的雌激素樣物質(zhì)所起的作用，關(guān)于外源激素制備大鼠高雌激素血癥模型的研究中[20]發(fā)現(xiàn)從外源激素機(jī)制考慮，林蛙油中的雌二醇不足以將服用者血清雌二醇含量顯著提升。前期實(shí)驗(yàn)室研究[8]已證實(shí)正常大鼠服用林蛙油后血清雌二醇顯著上升，但各器官指數(shù)卻沒(méi)有顯著的變化，并不符合使用外源雌激素的結(jié)果。提示林蛙油確實(shí)有作用于性腺軸中“垂體－卵巢”部分的內(nèi)源途徑來(lái)提升機(jī)體雌激素。

本研究結(jié)果顯示，林蛙油及陽(yáng)性藥均能改善造模對(duì)大鼠子宮指標(biāo)的影響，對(duì)卵巢指標(biāo)也有改善的趨勢(shì)；病理方面提示林蛙油及陽(yáng)性藥的干預(yù)能緩解卵泡因發(fā)育不完整而導(dǎo)致閉鎖無(wú)法正常排卵，導(dǎo)致雌激素減少這一進(jìn)程，從而保護(hù)卵巢與子宮功能，且林蛙油的干預(yù)效果更趨近于正常對(duì)照組；激素水平方面提示林蛙油和陽(yáng)性藥干預(yù)后大鼠血清中 FSH、LH 含量下降，P、E2含量上升，進(jìn)一步證明了林蛙油對(duì)卵巢功能及卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用，以上指標(biāo)均證明環(huán)磷酰胺對(duì)卵巢功能的影響，提示卵巢損傷模型復(fù)刻成功，同時(shí)驗(yàn)證了林蛙油對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育的促進(jìn)作用，與前期研究階段結(jié)果一致。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)方面GO 及KEGG 富集結(jié)果可證實(shí)林蛙油及陽(yáng)性藥對(duì)卵巢保護(hù)作用的途徑存在不同，與對(duì)照組相比，模型組富集結(jié)果說(shuō)明環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠細(xì)胞產(chǎn)生了烷化作用，可能導(dǎo)致細(xì)胞的RNA 發(fā)生改變[21]，使胞外功能出現(xiàn)障礙，抗病毒的能力下降從而導(dǎo)致免疫能力下降，從而導(dǎo)致各個(gè)器官的發(fā)育障礙；與模型組相比，林蛙油低、高劑量組富集結(jié)果提示林蛙油可能通過(guò)免疫系統(tǒng)反應(yīng)和防御反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞外區(qū)、免疫受體活性、細(xì)胞因子活性等功能對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育有促進(jìn)作用，且PI3K/Akt、B 細(xì)胞受體、抗原處理和呈遞等通路可能為其作用的主要調(diào)控機(jī)制。陽(yáng)性藥組富集結(jié)果提示陽(yáng)性藥通過(guò)參與大鼠體內(nèi)的免疫系統(tǒng)過(guò)程，進(jìn)而影響細(xì)胞外區(qū)功能及改善受體配體活性來(lái)改善卵巢損傷情況，JAK/STAT、IL-17 等信號(hào)通路可能為其作用的主要調(diào)控機(jī)制。

體內(nèi)各種細(xì)胞因子、內(nèi)分泌因子的調(diào)控作用是必不可少的，它們共同作用決定卵母細(xì)胞及不同發(fā)育階段卵泡的存活或凋亡[22]；機(jī)體中有兩條經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑，分別是細(xì)胞外途徑和細(xì)胞內(nèi)途徑[23-24]。卵巢+局部多因子調(diào)節(jié)系統(tǒng)和網(wǎng)絡(luò)以旁分泌、自分泌形式參與卵巢周期性優(yōu)勢(shì)卵泡選擇、排卵、性激素合成等[25]。黏附因子通過(guò)介導(dǎo)卵巢內(nèi)細(xì)胞間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用進(jìn)而影響卵泡的發(fā)育[26]。PI3K作為細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，PI3K 蛋白在卵巢內(nèi)的表達(dá)含量能夠反映卵巢的發(fā)育狀態(tài)[27-28]。Akt 能夠激活細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中調(diào)控蛋白，增強(qiáng)抗凋亡基因的表達(dá)，通過(guò)磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，抑制凋亡基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)[29-30]。本研究中林蛙油組在PI3K/Akt 信號(hào)通路有顯著富集，由此認(rèn)為PI3K/Akt、B 細(xì)胞受體等信號(hào)通路可能為林蛙油雌激素樣作用的主要調(diào)控機(jī)制，林蛙油的雌激素樣作用可能通過(guò)免疫系統(tǒng)反應(yīng)和防御反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞外區(qū)、免疫受體活性、細(xì)胞因子活性等功能對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育起到保護(hù)作用，且該結(jié)論與前階段實(shí)驗(yàn)相一致。

4 結(jié)論

綜上所述，林蛙油能有效改善環(huán)磷酰胺所致的卵巢損傷大鼠的血清性激素水平、卵巢卵泡發(fā)育情況、子宮內(nèi)膜萎縮等情況，其分子機(jī)制可能與PI3K/Akt、B 細(xì)胞受體等通路及基因有關(guān)。本研究從整體水平揭示了林蛙油對(duì)卵巢損傷大鼠卵泡發(fā)育改善情況的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，為林蛙油的雌激素樣作用機(jī)制提供了理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了研究基礎(chǔ)。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).