陸一菲，張慧娟，王思文，王國強，李涵睿，陳湘寧,

（1.北京農(nóng)學院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工與品質控制重點實驗室（部省共建），北京 102206；2.北京市裕農(nóng)優(yōu)質農(nóng)產(chǎn)品種植公司，北京 102206；3.上海星河灣雙語學校，上海 201108）

薄荷（Mentha haplocalyxBriq.），又稱留蘭香、銀丹草，屬于唇形科薄荷屬植物[1]，是一味重要的藥食同源的本草藥材，其也可用作調味劑和功能茶，是世界三大香料之一，廣泛在印度、中國等國種植，有“亞洲之香”的美譽[2]。但是目前對于薄荷的研究主要集中于其揮發(fā)油及化學成分上[3-6]，薄荷的采后保鮮技術研究相對較少，而外界溫度、水蒸氣、氧氣、二氧化碳以及微生物的變化都會造成薄荷嚴重的變質和損耗，影響其貨架期。因此，亟需對薄荷采后保鮮開展研究提升薄荷品質。

改善氣調包裝（Modified Atmosphere Packaging，MAP）通過在包裝內(nèi)保持高二氧化碳和低氧濃度的氣體環(huán)境，從而降低果蔬的呼吸速率[7]，減少微生物腐敗和水分流失，延緩果蔬成熟，保持果蔬品質，延長果蔬作物的貯藏和貨架期[8]。例如，84% N2+6%O2+10% CO2的氣調處理可將紫蘇葉貯藏期延長到20 d 左右[9]。與此同時，氣調處理對萵苣葉片貯藏期的張力、破裂力和破裂能沒有顯著影響，保持了萵苣葉片的新鮮度[10]。由于MAP 對蔬菜的保鮮處理操作簡單，性價比高，具有較高的應用價值[11]。但當前對于果蔬氣調保鮮方面還缺少與包裝材料相結合的研究，且用于薄荷采后保鮮的包裝材料較為單一，而包裝材料的性質對食品也起到關鍵的保護作用。比如，透氣性良好是包裝材料需要具備的條件，可在貯藏期內(nèi)維持薄荷的正常呼吸，同時包裝材料的透濕性也十分重要，還需要具有一定的拉伸強度、抗沖擊強度、斷裂伸長率，從而使薄荷采后運輸過程中減少營養(yǎng)物質的流失[12]。

利用呼吸速率模型預測果蔬采后貯藏期間的呼吸速率，使果蔬的呼吸速率保持在較低水平同時不會發(fā)生厭氧呼吸是當下果蔬采后保鮮的研究熱點[13]。氣調包裝呼吸速率模型在很多果蔬的保鮮中被應用，但是由于不同的果蔬之間呼吸速率差異較大[14-15]，在實際應用中需要將經(jīng)驗模型和理論模型結合，共同評價氣調包裝中果蔬呼吸速率，利用多變量或指數(shù)函數(shù)來刻畫不同氣體比例對呼吸強度的影響，在儲藏過程中，以頂空氣體分析儀測量的CO2含量和O2的含量變化為基礎，通過Matlab 進行擬合，得到相應的公式參數(shù)[16]。當前關于薄荷采后MAP 結合呼吸速率模型的研究較少，而基于呼吸速率模型的MAP 貯藏方式對于薄荷采后保鮮具有十分重要的意義。

本文以薄荷為研究對象，通過測定貯藏期間薄荷失重率、葉綠素含量等指標變化，篩選出能保持貯藏期內(nèi)薄荷綜合感官品質較好的包裝材料，在此基礎上，基于二次多項式模型對薄荷呼吸速率進行線性回歸分析，建立薄荷呼吸速率模型，并對貯藏期間薄荷表面微生物菌群結構進行分析，通過對包裝袋內(nèi)薄荷氣體成分變化、薄膜透氣性和呼吸速率模型相關數(shù)據(jù)計算及預測薄荷初始的O2吸收速率和CO2的釋放速率，為薄荷氣調包裝保鮮中使用的包裝材料的研發(fā)提供理論依據(jù)，提高了薄荷采后貯藏技術，延長薄荷貨架期，同時為其他小品種蔬菜采后保鮮技術的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮薄荷葉片 4 cm×2 cm，淡綠色，新鮮無損傷，實驗當天采自北京市大興裕農(nóng)優(yōu)質農(nóng)產(chǎn)品有限公司基地。首先對薄荷葉片進行清洗以及兩次消毒、并進行脫水處理，甩干清洗時多余的水分。挑選葉片挺立飽滿、大小均勻、感官優(yōu)良的薄荷進行實驗；聚乙烯包裝（PE）、鄰苯基苯酚復合聚乙烯包裝（OPP1.8/PE3.5、OPP1.8/PE4.5、OPP2.3/PE4.5）、高密度聚乙烯包裝（HDPE） 北京華正龍?zhí)┛萍加邢薰荆粺o水乙醇、丙酮、氯化鈉、2,6-二氯靛酚、抗壞血酸、草酸 分析純（AR），國藥集團化學試劑有限公司；DNA提取試劑盒 Mo Bio/QIAGEN；Pyrobest DNA Polymerase TaKaRa；Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit Invitrogen；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit Axygen；BlasTaqTM 2×qPCR Mix 試劑盒 愛必信上海生物科技有限公司。

AL204 電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DDS-307A 電導率測定儀 雷磁儀器有限公司；HHSY21-NI4 恒溫水浴鍋 北京精科華瑞儀器有限公司；KQ-500DE 超聲波清洗機 昆山市超聲儀器有限公司；TU-1810 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；CM-700d 色差儀 彩譜科技有限公司；氣體混配器 丹麥丹圣（PBI/ Dansensor A/S）有限公司；CTC CombiPAL 自動頂空進樣裝置、GC-IMS 氣相-離子遷移譜儀 德國G.A.S.公司；7890A-5975C 頂空分析儀 Agilent 公司；DF-101S包材測厚儀 鞏義市英裕儀器公司；FlavourSpec?風味分析儀 北京格林德國際科技有限公司；E6090 熒光分光光度計 Invitrogen；Flx800 酶標儀 BioTek；HDL 超凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；LT-CPS50C 立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司；FW100 粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；QuantStudio 3 qPCR 儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同包裝材料的篩選及其對薄荷品質的影響

1.2.1.1 樣品包裝及貯藏 取新鮮薄荷葉片樣品在5 種不同的包裝材料（PE、OPP1.8/PE3.5、OPP1.8/PE4.5、OPP2.3/PE4.5、HDPE）中進行裝袋包裝，規(guī)格均為245 mm×245 mm。每袋裝入30 g 薄荷，置于4 ℃的冰箱中貯藏，在第0、3、6、9、12、15 和18 d分別測量薄荷的各項理化指標，每個指標至少3 次平行，結果表示為平均值±標準差。

1.2.1.2 失重率的測定 將第0 d 薄荷的重量記錄初始數(shù)據(jù)，之后每天稱量薄荷的質量，通過式（1）計算失重率[17]。

式中：W 為失重率，%；W0為第0 d 鮮重，g；Wn為第n d 鮮重，g。

1.2.1.3 相對電導率的測定 每組取3 片薄荷葉片，每片葉片各取直徑為5 mm 的圓片5 個，共計15 個于錐形瓶中，輕輕沖洗后加入50 mL 蒸餾水測定初始電導率。搖床振蕩3 h 后檢測體系的電導率并記錄。隨后沸水浴5 min，冷卻至室溫后檢測電導率[18]，并按照式（2）計算相對電導率。

式中：C 為相對電導率，%；P0為初始去離子水電導率，S；P1為輕輕振蕩3 h 后的電導率，S；P2為振蕩3 h 后在沸水浴中加熱5 min 冷卻后的電導率，S。

1.2.1.4 色差的測定 采用色差儀測定薄荷在貯藏期間的L*、a*、b*[19]。將色差儀放置在薄荷葉片測試頭上，以儀器白板為標準空白色澤，測量出薄荷的L*，a*和b*，通過公式（3）計算得出ΔE，ΔE越小表示越接近新鮮薄荷。

式中：L*為亮度，表示黑白，0 為黑，100 為白；a*為紅綠，正值為紅，負值為綠，0 為中性；b*為黃藍，正值為黃，負值為藍，0 為中性。

1.2.1.5 感官評價 由10 人組成品評組人員評價薄荷貯藏期內(nèi)感官品質，觀察薄荷在貯藏期間的變化，并從薄荷葉片表面的顏色、萎蔫程度、有無腐爛等幾個方面對薄荷的感官進行打分評定。具體的感官評分標準見表1。

表1 感官評分標準[20]Table 1 Sensory grading scale[20]

1.2.1.6 抗壞血酸含量的測定 采用2，6-二氯靛酚法測定薄荷中抗壞血酸含量。準確稱量10 g 薄荷于研缽中，加入少量2%的草酸研磨成勻漿，然后轉入100 mL 容量瓶中，用2%的草酸定容，搖勻，提取10 min，過濾。吸取10 mL 濾液于100 mL 三角瓶中，用標定好的2，6-二氯靛酚溶液滴定至淡紅色，且15 s 不褪色為終點，平行滴定3 次，同時用2%草酸做空白滴定[21]。計算公式（4）如下：

式中：V 為滴定樣品消耗2，6-二氯靛酚溶液體積，mL；V0為滴定空白消耗2，6-二氯靛酚溶液體積，mL；m 為樣品質量，g；ρ為標定1 mL 2，6 二氯靛酚溶液消耗多少標準維生素C 的質量，mg/mL；V1為提取液總體積，mL；V2為滴定時所取體積，mL。

1.2.1.7 總葉綠素含量的測定 按照NY/T 3082-2017測定薄荷總葉綠素含量。在黑暗條件下使用體積分數(shù)80%丙酮浸提葉片葉綠素，利用分光光度計測定663、645 nm 處吸光度，按式（5）計算葉綠素質量濃度（mg/L），再按公式（6）計算組織中葉綠素質量比，單位為mg·g-1。

式中，A 為分光光度值，OD；V 為提取液體積，mL；N 為稀釋倍數(shù)；m 為樣品鮮重，g。

1.2.1.8 菌落總數(shù)的測定 按照GB 4789.2-2016 方法測定薄荷菌落總數(shù)。取25 g 薄荷加入225 mL 無菌生理鹽水均質2 min，取1 mL 樣液稀釋10 倍，每個稀釋梯度取1 mL 樣液于無菌培養(yǎng)皿中，分別倒入20 mL 平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基，搖晃均勻，冷卻凝固后將平板在37 ℃培養(yǎng)48 h，結果以lg（CFU/g）計。

1.2.2 響應面試驗優(yōu)化氣體比例對薄荷品質的影響

根據(jù)前期對薄荷氣調保鮮研究結果得出O2濃度為3%～7%，CO2濃度為5%～15%時能保持薄荷較好的感官品質[22]，同時結合上述實驗對5 種不同包裝材料的保鮮效果的篩選，選取對葉綠素影響較大的3 個因素：O2濃度，CO2濃度和包裝材料，各取3 個水平因素分別記為水平-1、0、1，選取的3 種包裝材料分別為：PE、OPP1.8/PE3.5、HDPE。選用葉綠素含量為響應值進行薄荷貯藏期間品質評價，實驗因素水平及編碼設計如表2 所示。運用Design Expert 軟件（V8.0.6.1）進行數(shù)據(jù)分析，建立二次回歸方程。

表2 響應面試驗因素水平設計Table 2 Factor level design of response surface experiment

1.2.3 運用GC-IMS 分析不同氣調包裝中薄荷揮發(fā)性成分 將薄荷樣品分為3 組，分別為氣調包裝A組（3.5% O2+9.4% CO2+87.1% N2處理及HDPE 包裝）、氣調包裝B 組（7% O2+5% CO2+86% N2處理及PE 包裝）和對照組（不氣調處理及HDPE 包裝）。其中A 組為響應面優(yōu)化試驗中預測出的最佳條件，B 組為保鮮效果最差的包裝條件。將三組樣品進行4 ℃保存。

參考張樂等[23]的方法，精確稱取0.500 g 薄荷樣品于20 mL 具有聚四氟乙烯隔墊密封的頂空瓶中，將頂空瓶40 ℃加熱孵化10 min，孵化轉速250 r/min；不分流頂空進樣200 μL。進樣針溫度85 ℃，進樣前清洗時間30 s，進樣后清洗時間6 min[24]。

GC 條件：MXT-5 柱（15 m×0.53 mm，0.53 μm）；色譜柱溫度60 ℃；載氣為高純氮氣（≥99.999%）。載氣流速程序為初始2.0 mL/min，保持2 min，在2～10 min 線性增至10.0 mL/min，在10～20 min 線性增至100.0 mL/min，在20～40 min 線性增至150.0 mL/min，然后停止流動，總運行時間為40 min[23]。

IMS 條件：離子源為氘（6.5 keV）；正離子模式；漂移管長度9.8 cm；管內(nèi)線性電壓500 V/cm；漂移管溫度45 ℃；漂移氣流速150 mL/min（氮氣純度≥99.999%）。

1.2.4 薄荷呼吸速率模型的建立

1.2.4.1 包裝材料厚度和包裝材料氣體透過率的測定 采用隨機抽取的方法獲得需要測定的包裝膜，在包裝膜上選取處于不同方位的十個點使用測厚儀（精度為0.001 mm）測量其厚度，對所獲得數(shù)據(jù)進行平均處理即可得到包裝膜的實際厚度。對于氣體透過率的測定使用小袋注氣法[25]。

1.2.4.2 采用頂空分析儀測定薄荷的呼吸速率 挑選新鮮無損傷的薄荷葉片，經(jīng)過兩次清洗消毒，將薄荷放入包裝袋（長×寬為245 mm×245 mm）中。本文采用密閉系統(tǒng)法進行研究。

密閉系統(tǒng)法：將100 g 樣品放入245 mm×245 mm的包裝袋中，每隔4 h 測定容器內(nèi)CO2和O2的濃度，即細胞組織生產(chǎn)CO2或消耗O2的數(shù)量。通過式（7）和（8）計算呼吸速率[26]。

1.2.4.3 基于二次多項式的呼吸速率模型的建立采用滲透系統(tǒng)方法[27]測量薄荷的呼吸速率，取100 g左右的薄荷，裝入上述包裝袋中，先用包裝機抽真空充入800 mL 左右的空氣并密封，放入冷庫中開始記錄，每隔4 h 用頂空分析儀扎入密封片，測量包裝袋內(nèi)的氣體濃度并記錄數(shù)據(jù)，每個處理重復三次平行。并運用二次多項式方程（式（9））對實驗結果進行回歸分析，擬合出最優(yōu)的薄荷呼吸速率模型。

式中：ai（i=0，1，…，5）為實驗擬合常數(shù)。

1.2.4.4 呼吸速率模型的驗證 另取100 g 左右的薄荷樣品，樣品處理同1.2.4.3，對薄荷樣品進行氣體濃度測定，將所測[O2]、[CO2]濃度代入所建立的呼吸模型，得出薄荷呼吸速率的預測值，并將預測值與實測值R進行比較[28]。

1.2.5 不同氣調及包裝條件下薄荷表面真菌多樣性的測定

1.2.5.1 薄荷樣品分組 將薄荷隨機分為兩組，實驗組1：采用HDPE 包裝及3.5% O2+9.4% CO2+87.1%N2氣調處理的薄荷樣本（編號為A0 和A12）；實驗組2：采用PE 包裝及7% O2+5% CO2+86% N2氣調處理的薄荷樣本（編號為B0 和B12）；對照組：采用HDPE 包裝及不氣調處理的薄荷樣本（編號為C0 和C12），將所有樣本置于4 ℃貯藏，取各組第12 d 樣品進行下一步微生物菌群分析。

1.2.5.2 薄荷樣品處理 分別準確稱量10 g 薄荷樣品加入100 mL 無菌緩沖液，置于搖床200 r/min 振蕩30 min。然后依次用10 μm 和0.22 μm 濾膜過濾去除雜質，過濾后的樣品放入無菌離心管中置于-80 ℃保存。

1.2.5.3 DNA 提取 使用DNA 提取試劑盒從樣品中提取真菌DNA。用2%瓊脂糖凝膠對提取獲得的DNA 樣品質量進行檢測，使用無菌無酶水將樣品DNA 稀釋至1 ng/μL。

1.2.5.4 PCR 擴增及測序 根據(jù)PCR 反應體系，對真菌ITS1 區(qū)域擴增。所有PCR 混合液加入15 μL Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix（New England Biolabs）、0.2 μmol/L 引物和10 ng 基因組DNA模板，在98 ℃下進行1 min 的第一次變性，然后在98 ℃（10 s）、50 ℃（30 s）和72 ℃（30 s）下進行30 次循環(huán)，最后在72 ℃下保持5 min。PCR 產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；對檢測合格的PCR 產(chǎn)物進行磁珠純化，采用酶標定量，根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，對目的條帶使用通用型DNA 純化回收試劑盒（TianGen）回收產(chǎn)物。

1.2.5.5 測序數(shù)據(jù)處理 使用DAN Library Kit for Illumina 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經(jīng)過Qubit 定量和文庫檢測，合格后，使用MiSeq 進行上機測序。測得的原始數(shù)據(jù)在Illumina 平臺（北京諾禾致源科技股份有限公司）經(jīng)過拼接、過濾除去干擾數(shù)據(jù)，得到有效數(shù)據(jù)，然后進行豐度、多樣性指數(shù)等分析，挖掘樣品間物種組成差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗至少重復3 次，結果表示為平均值±標準差，并使用SPSS 24.0 統(tǒng)計軟件通過t檢驗進行統(tǒng)計分析。運用Design Expert.V8.0.6.1 軟件設計響應面試驗。試驗數(shù)據(jù)使用Matlab7.1 軟件進行非線性擬合得到擬合曲線。

2 結果與分析

2.1 不同包裝材料的篩選及其對薄荷品質的影響

包裝材料的透氣性能是氣調包裝保鮮領域今后研究的首要主題。表3 為PE、OPP1.8/PE3.5、OPP 1.8/4.5、OPP2.3/PE4.5、HDPE5 種不同包裝材料的技術參數(shù)，該參數(shù)為進一步篩選可延長薄荷保鮮期的包裝材料和分析薄荷呼吸速率提供數(shù)據(jù)支撐。

表3 不同包裝材料技術參數(shù)Table 3 Technical parameters of different packaging materials

失重率是評價葉類蔬菜飽和度、脆性和商品價值的重要指標，失重率下降越大品質越壞。圖1 表示的是貯藏期間不同包裝材料對薄荷品質的影響，其中薄荷在貯藏期間失重率變化見圖1（a），整體呈現(xiàn)不同上升趨勢，貯藏前期，OPP1.8/PE3.5 和HDPE 組失重率較為緩慢，PE 和OPP1.8/PE4.5 兩組失水迅速。貯藏至第12 d，OPP1.8/PE4.5 組薄荷萎蔫程度最大，失重率為29.56%，失重率最小的為HDPE 包裝的薄荷，失重率是19.23%，低于其他4 種包裝材料。結果表明，在OPP1.8/PE4.5 包裝條件下薄荷失水率最高，可能由于果蔬在貯藏期間進行呼吸作用和蒸騰作用導致水分含量逐漸流失，而該膜的CO2透過率最小，導致薄荷進行無氧呼吸，從而出現(xiàn)萎蔫現(xiàn)象[29]。

圖1 貯藏期內(nèi)不同包裝材料對薄荷失重率（a）、相對電導率（b）、色差（c）、感官評價（d）、VC 含量（e）、葉綠素含量（f）和菌落總數(shù)（g）的影響Fig.1 Effects of different packaging materials on weight loss (a),relative conductivity (b),color difference (c),sensory evaluation (d),VC content (e),chlorophyll content (f) and total number of colonies (g) of peppermint during storage

相對電導率與植物組織的細胞膜完整性與衰老程度有很大的關系，當細胞膜受損時，細胞膜的選擇透過性功能被削弱，細胞內(nèi)物質可自由通過，導致相對電導率增大[30]。圖1（b）所示的是貯藏期間不同包裝對薄荷相對電導率的影響，隨著貯藏時間的延長，5 種不同包裝材料內(nèi)的薄荷相對電導率都在逐漸升高。在貯藏第9 d，OPP2.3/PE4.5 組增加了6.8%，PE組增加了4.26%，OPP1.8/PE3.5 組增加了4.35%、OPP1.8/PE4.5 組增加了5.04%?？梢?，PE、OPP1.8/PE3.5 組相對電導率維持較低水平，增量較少，對于保護薄荷細胞膜完整性效果最好。

新鮮蔬菜的外部顏色是決定消費者對該產(chǎn)品的接受程度的最重要因素之一[31]。圖1（c）表示的是薄荷在貯藏期間的色差變化，薄荷顏色變化隨著貯藏時間的增長呈現(xiàn)增加趨勢，表明薄荷色澤逐漸變深，隨著時間增加薄荷的新鮮度降低。對比5 種不同的包裝材料可看出，薄荷貯藏至第18 d 時OPP1.8/PE3.5 組色差為18.76，低于OPP1.8/PE4.5 組和OPP2.3/PE4.5組，主要是由于OPP1.8/PE3.5 的氧氣透過率以及水蒸氣透過率較其余四種包裝材料高，從而減少薄荷在包裝袋中產(chǎn)生水氣，降低薄荷腐爛速度，從而保持薄荷色澤。因此選擇OPP1.8/PE3.5 包裝材料可以更好地保持薄荷原有的顏色，維持薄荷的感官品質。

感官評價可直觀地反映果蔬采后的生理變化，直接影響葉菜類新鮮程度的是黃化或腐爛。其中圖1（d）所示的是不同包裝對薄荷感官評分的影響。隨著貯藏時間的增加，薄荷的感官評分都呈現(xiàn)下降的趨勢，表明薄荷的感官品質在逐漸下降。HDPE 組的薄荷新鮮程度較好，出水少，輕微褐變，貯藏第12 d時還保持一定商品性，而PE 組在貯藏前期評分穩(wěn)定下降速度較緩慢，在貯藏至第9 d 時，葉片失水、變黃、開始失去挺立狀態(tài)。因此，針對感官評價指標來說，5 種不同包裝方式中：HDPE 包裝的保鮮效果顯著高于其他四種材料，可能是因為HDPE 包裝能更好地抑制腐爛菌的繁殖生長，避免其遭受微生物的侵染，減少腐爛的發(fā)生，同時能更好地減緩薄荷水分流失和生理代謝速率，保持營養(yǎng)價值和品質[32]。

VC是一種非酶抗氧化物質，它是評估薄荷質量好壞的重要指標之一，對減少活性氧的積累具有一定的作用[33]。圖1（e）所示的是貯藏期間不同包裝對薄荷抗壞血酸含量的影響，隨著貯藏時間的延長，5 組不同包裝材料中的薄荷抗壞血酸含量均有所降低，其中OPP1.8/PE3.5 下降幅度明顯小于OPP2.3/PE4.5組，OPP1.8/PE3.5 組在貯藏第9 d，仍保持較高抗壞血酸含量，為6.365 mg/100 g，與第0 d 相比下降了30.7%，而OPP2.3/PE4.5 組在第12 d 明顯低于其他四組，這是由于抗壞血酸在貯藏過程中又很容易被空氣氧化，而OPP1.8/PE3.5 包裝材料透氧性較高，呼吸強度較高，因此抗壞血酸含量下降也比其他四種包裝材料小。

葉綠素含量通常作為綠色蔬菜是否新鮮的重要指標，與蔬菜的感官品質和營養(yǎng)價值聯(lián)系緊密。圖1（f）所示的是貯藏期間不同包裝對薄荷葉綠素含量的影響，隨貯藏時間增加，各組薄荷總葉綠素含量均在下降，在貯藏第12 d，PE 和HDPE 包裝的葉綠素含量均保持較高水平，分別為0.55 mg/g 和0.52 mg/g，為OPP1.8/PE3.5 組的1.14 倍和1.08 倍。該葉綠素變化趨勢與趙潔所研究的貯藏菜心葉綠素含量變化趨勢較為一致[34]。因此，對于5 種不同包裝材料內(nèi)的薄荷來說，經(jīng)PE 材料包裝后，薄荷中的總葉綠素含量損失較低，這是由于該包裝氣體透過率較高，薄荷呼吸作用產(chǎn)生的氣體可較快散發(fā)出去，從而減緩葉綠素的分解，可以有效地阻止總葉綠素含量快速損失，更好保護薄荷葉片的色澤。

微生物的污染和增殖會導致薄荷的感官品質下降，降低其商業(yè)價值。圖1（g）所示的是貯藏期間不同包裝對薄荷菌落總數(shù)的影響，貯藏期內(nèi)薄荷的微生物數(shù)量均呈上升趨勢，貯藏至第12 d 時，PE 和HDPE包裝抑制微生物效果最好，細菌平均對數(shù)仍低于6 lg（CFU/g）。由于PE 和HDPE 包裝氧氣透過率和水蒸氣透過率較高，薄荷在貯藏期間進行的呼吸作用以及蒸騰作用產(chǎn)生的氣體可以較好地與外界氣體環(huán)境進行交換，從而保持包裝袋內(nèi)較好的貯藏環(huán)境，降低微生物的污染和增殖，保持薄荷較好的品質特性[35]。

通過該實驗研究，篩選出保鮮效果較好的PE、OPP1.8/PE3.5、HDPE 三種包裝材料，同時結合前期預實驗得出的最佳氣體濃度結果，即O2濃度為3%～7%，CO2濃度為5%～15%。將這三個因素設定三個水平進行后續(xù)實驗。

2.2 氣體比例對薄荷品質的影響

2.2.1 葉綠素模型建立與分析 包裝材料對果蔬貯藏期間感官品質的影響較大，薄荷等葉菜在貯藏期間導致其變質腐敗的主要原因為包裝材料的透氣性能，而用透氣性能較好的包裝材料可減少薄荷貯藏期間呼吸作用和蒸騰作用產(chǎn)生的水汽[36]，例如前人將蘋果與果箱間緩沖材料作為影響因素進行響應面優(yōu)化試驗，可較好地明確運輸時蘋果損傷的體積最小的最佳緩沖材料種類[37]。本研究采用相同模式進行試驗設計，將包裝材料種類作為影響因素，根據(jù)包裝材料篩選實驗結果，以及前期對薄荷氣調保鮮研究結果得出的O2濃度為3%～7%，CO2濃度為5%～15%時能保持薄荷較好的感官品質[22]，利用Box-Behnken 設計法，以Design-ExpertV 8.0.6 軟件設計三因素三水平的響應面試驗。在綠葉蔬菜貯藏保鮮中，葉綠素含量通常作為蔬菜新鮮與否的重要指標，其分解程度對薄荷色澤及感官品質有較大影響，例如Oliveira 等[38]將葉綠素含量作為響應值優(yōu)化菠菜葉片的最佳包裝溫度和濕度，因此本研究選用葉綠素含量為響應值，通過設計響應面優(yōu)化薄荷最佳保鮮工藝參數(shù)，設計與結果如表4 所示。通過葉綠素含量（Y）與O2濃度（A）、CO2濃度（B）、包裝材料（C）之間建立回歸模型，對表4 中響應面試驗結果進行多次回歸擬合，得到葉綠素模型及回歸系數(shù)的回歸分析結果（表5）。采用軟件進行非線性回歸的二次多項式擬合，得到回歸方程：Y=0.65-0.058A-0.00525B-0.052C+0.046AB-0.03AC-0.016BC-0.028A2-0.11B2-0.019C2。

表4 響應曲面優(yōu)化薄荷氣調包裝條件的試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results of response surface optimization for modified atmosphere packaging conditions of peppermint

表5 葉綠素模型及回歸系數(shù)的回歸分析結果Table 5 Regression analysis results of chlorophyll model and regression coefficient

2.2.2 模型顯著性檢驗及響應面交互作用分析 葉綠素模型及回歸系數(shù)的回歸分析結果如表5 所示，模型達到極顯著水平（P＜0.0001），通過上述數(shù)據(jù)可以看到，該模型擬合程度較高，繼續(xù)對回歸方程的相應回歸值進行預測，得到其模型回歸系數(shù)R2=0.9790，調節(jié)后的R2=0.9521，因此可說明95.21%的數(shù)據(jù)均可使用此模型進行說明，且該方程可靠性較高。通過對各個因素F值進行分析后得到其主效應關系為：A＞C＞B，即O2濃度＞包裝材料＞CO2濃度。

將模型中A、B 和C 三因素在方差分析的基礎上固定在中間水平上，以葉綠素含量作為響應指標，得出其他兩個因素交互作用模型，并根據(jù)該模型繪制等高線圖與3D 圖，得到一個理論最大值。響應面圖投影面為等高線圖，等高線彎曲程度反映了兩因素之間的交互作用大小[39]。圖2 是兩因素交互作用影響薄荷葉綠素含量的響應面效果圖。

圖2 兩因素交互作用薄荷葉綠素含量的影響Fig.2 Effect of interaction of two factors on chlorophyll content of peppermint

O2和CO2的交互作用影響薄荷中的總葉綠素含量趨勢如圖2（a）所示，AB 交互曲面中，當CO2增加時，薄荷中的總葉綠素含量的變化坡度呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，將CO2處于較低水平時，隨著O2的增加，薄荷中的總葉綠素含量呈現(xiàn)出線性增加的趨勢；將CO2處于較高水平時，隨著O2的增加，薄荷中的總葉綠素含量變化不顯著；在只考慮二者交互作用的前提下，將O2水平處于3%～5%左右、CO2水平處于7%～11%左右時，薄荷中的葉綠素達到最大值，曲面圖與表5 方差分析的結果一致。

O2和包裝材料的交互作用對薄荷中的總葉綠素含量的影響如圖2（b）所示，AC 交互曲面中，當包裝材料為HDPE 和OPP1.8/PE3.5 時，當O2水平不斷升高，葉綠素的變化坡度呈現(xiàn)出先增加后平緩的趨勢，將包裝材料處于較高水平，薄荷中的總葉綠素含量的變化坡度隨O2的增加呈線性增加的趨勢；將O2處于較低水平時，總葉綠素含量隨包裝材料的增加呈先平緩后降低的趨勢；當O2較高時，葉綠素隨包裝材料的增加呈線性增加的趨勢，因此得到氧氣和包裝材料之間存在十分顯著的交互作用；在僅考慮二者交互作用的條件下，將O2水平處于3%～5%左右，包裝材料為OPP1.8/PE3.5 或HDPE 時，葉綠素達到最大值，方差分析和曲面圖所呈現(xiàn)的趨勢也十分符合。

二氧化碳和包裝材料的交互作用對葉綠素的影響如圖2（c）所示，BC 交互曲面中，當包裝材料增加時，薄荷中的總葉綠素含量的變化坡度呈現(xiàn)出線性降低的趨勢，當CO2增加時，薄荷中的總葉綠素含量呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，在僅考慮二者交互作用的條件下，在CO2為7%～11%左右，包裝材料為OPP1.8/PE3.5 或HDPE 時，其葉綠素達到最大值，曲面圖與表5 方差分析的結果也是相符合的。

由圖2 及表5 可看出二次項交互作用AB 對薄荷中的總葉綠素含量具有極顯著的影響（P＜0.01），AC 對葉綠素的影響顯著（P＜0.05），BC 對葉綠素的影響不顯著（P＞0.05）。即氧氣和二氧化碳氣體比例、氧氣濃度和包裝材料種類對薄荷貯藏期間葉綠素含量影響顯著，而二氧化碳濃度和包裝材料對葉綠素含量則影響不顯著。

2.2.3 驗證實驗結果 通過對回歸方程模型的分析，以最大程度的減少葉綠素損失為優(yōu)化目標，得到預測的最優(yōu)條件為：O2為3.5%、CO2為9.4%、包裝材料為HDPE。在此最優(yōu)條件下經(jīng)3 次平行實驗，得到其葉綠素含量為0.693±0.057 mg/g，與預測值總葉綠素含量為0.691 mg/g 相差在5%范圍內(nèi)，證實了實驗值和預測值之間相關性很高，實驗結果較精準。

2.3 不同氣調包裝中薄荷揮發(fā)性成分評價

2.3.1 三種不同氣調包裝中薄荷揮發(fā)性化合物的分析 使用Reporter 軟件生成了不同貯藏天數(shù)薄荷中揮發(fā)性化合物的GC-IMS 二維俯視圖，如圖3 所示，橫坐標1.0 處紅色豎線為反應離子峰（經(jīng)歸一化處理），反應離子峰右側的每一個點代表一種揮發(fā)性化合物，顏色表示單個化合物的信號強度[40]。紅色代表高強度，藍色代表低強度。在貯藏期內(nèi)，圖3（A）中紅色部分較其余兩組明顯，說明A 組氣調包裝中薄荷揮發(fā)性化合物直至第12 d 仍保持較高水平。而在圖3（C）中貯藏至第12 d 時白色部分較為明顯，則薄荷揮發(fā)性化合物損失較大，圖3（B）中白色部分也明顯小于圖3（C）中所示。表6 所示的是貯藏第12 d時A 組氣調包裝處理的薄荷主要揮發(fā)性化合物，所以A 組氣調包裝更加適合薄荷貯藏，能夠更好地保存薄荷中的揮發(fā)性化合物，維持薄荷香氣。

圖3 氣調包裝A 組（A）、氣調包裝B 組（B）和對照組（C）中薄荷揮發(fā)性化合物變化三維譜圖Fig.3 Three dimensional spectra of changes of volatile compounds of peppermint in modified atmosphere packaging group A (A),modified atmosphere packaging group B (B) and control group (C)

表6 貯藏第12 d 時薄荷主要揮發(fā)性化合物定性結果Table 6 Qualitative results of main volatile compounds of peppermint at the 12th day of storage

2.3.2 不同氣調包裝中揮發(fā)性化合物指紋圖譜對比進一步地，為了更直觀且定量地比較不同氣調包裝對薄荷樣品中每種揮發(fā)性化合物的影響差異，采用GalleryPlot 軟件生成不同貯藏天數(shù)薄荷中揮發(fā)性成分的指紋圖譜，如圖4 所示。薄荷葉片中主要揮發(fā)性成分為萜烯類、醇類、酮類、酯類、酸類等化合物[41]。由圖4 可知薄荷中的揮發(fā)性化合物種類豐富，不同氣調包裝中薄荷的揮發(fā)性化合物在貯藏期內(nèi)的變化也不同。隨著貯藏時間增加萜烯類物質呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在貯藏初期D-檸檬烯含量較多，貯藏至第9 d 時，薄荷中的揮發(fā)性化合物明顯降低，但是A 組氣調包裝和其他兩種氣調包裝相比仍保持較高水平。薄荷中醇類物質隨著葉片成熟而產(chǎn)生，隨著葉片衰老而增加。芳樟醇是醇類物質中的主要成分，到貯藏第9 d 時，A 組氣調包裝中芳樟醇含量明顯小于其余兩組，可見A 組處理可有效抑制醇類物質的增加。D-香芹酮是薄荷揮發(fā)性化合物中主要成分，到貯藏第12 d 時，A 組氣調包裝中D-香芹酮含量與其余兩組相比仍處于較高水平。因此，HDPE 包裝及3.5% O2+9.4% CO2+87.1% N2處理可較好地延緩薄荷葉片的衰老，使葉片揮發(fā)性化合物保持較高含量。

圖4 所有檢測的薄荷樣品中揮發(fā)性有機物的指紋圖譜Fig.4 Fingerprints of volatile organic compounds in all peppermint samples examined

2.4 包裝膜參數(shù)及薄荷呼吸速率模型的建立

2.4.1 包裝膜參數(shù) 果蔬的氣調包裝十分關注包裝材料對O2和CO2的滲透性能，包裝材料的透氣性對氣調包裝保鮮至關重要[42]。對HDPE 膜測得的實際厚度和相關參數(shù)如表3 所示。從上表可以看出N2透過率最高，表明在薄荷保鮮的過程中，需要保證N2最大程度滲出包裝，且薄膜的透氧性良好、厚度適中，才能保證薄荷在有氧呼吸的條件下，保持較低的呼吸速率，減少營養(yǎng)成分的損失，達到保鮮效果。

2.4.2 呼吸速率模型的建立

2.4.2.1 薄荷呼吸速率變化的規(guī)律 采用頂空分析儀對薄荷進行氣體濃度的測定，袋內(nèi)O2和CO2含量變化如圖5 所示。在4 ℃下，由于薄荷的呼吸作用，在貯藏期間袋內(nèi)的CO2含量上升，O2含量不斷下降，最后在44 h 左右不再變化。將CO2、O2濃度代入式中，計算得出在密閉系統(tǒng)內(nèi)薄荷的CO2生成速率和O2消耗速率[43]，如圖6。由圖6 可以看出，在貯藏開始階段，O2消耗速率和CO2的生成速率都呈現(xiàn)下降趨勢。實驗剛開始4 h 時，CO2生成速率為20.8 mL/（kg·h）、O2消耗速率為19.69 mL/（kg·h）。到40 h 時CO2生成速率下降為9.28 mL/（kg·h），下降55.38%、O2消耗速率下降為8.46 mL/（kg·h），下降57.03%。從44 h 之后氣體生成速率和消耗速率變化都趨于平緩。薄荷的呼吸速率都是先迅速下降后變化緩慢，說明隨著貯藏時間增加，薄荷的新鮮程度下降，這可能是由于本實驗是在密閉系統(tǒng)中測定薄荷呼吸速率，在密閉容器內(nèi)，隨著放置時間的增加，容器內(nèi)O2的含量越來越低，CO2的含量越來越高，高CO2濃度抑制了薄荷的呼吸作用。

圖5 薄荷在氣調包裝下氣體濃度的變化Fig.5 Changes of gas concentration of peppermint in modified atmosphere packaging

圖6 薄荷在氣調包裝下呼吸速率的變化Fig.6 Changes of respiration rate of peppermint in modified atmosphere packaging

2.4.2.2 薄荷呼吸速率模型的建立 利用滲透系統(tǒng)方法[30]測量了薄荷的呼吸速率，并運用二次多項式方程方法，對試驗結果進行了回歸分析，并在現(xiàn)有的果蔬呼吸速率模型的基礎上，對其進行了改進，最終擬合出了最優(yōu)的薄荷呼吸速率模型。表7 展示了薄荷二次多項式模型的參數(shù)估值。

表7 薄荷二次多項式模型的參數(shù)估值Table 7 Parameter estimation of peppermint quadratic polynomial model

將實驗測量的包裝袋中O2和CO2的含量的改變，并結合程序計算出的O2消耗率（）和CO2生成率（），運用Matlab 對其進行了非線性擬合，得出了二次多項式模型的參數(shù)估值如下：

2.4.3 呼吸速率模型的驗證 為對比上述模型的預測效果，重新進行薄荷樣品貯藏期間氣體濃度測定，分別將模型對比實驗數(shù)據(jù)代入相關模型，計算呼吸速率預測值，如圖7 所示。根據(jù)氣體濃度變化表達式直接計算后，得出計算模型的計算值；根據(jù)時間和氣體濃度的關系式擬合后，得出多元回歸模型的預測值。薄荷貯藏過程48 h 內(nèi)，多元回歸模型的預測值變化趨勢與實驗值總體一致，相對誤差為10%～20%，結果表明實驗與預測較為吻合。上述研究可為薄荷氣調貯藏提供理論依據(jù)。

圖7 薄荷呼吸速率模型與實測值比較Fig.7 Comparison of respiration rate model and measured value of peppermint

2.5 不同氣調及包裝條件對薄荷表面真菌多樣性的影響

對貯藏12 d 不同處理組薄荷表面微生物菌群分析如圖8 所示。子囊菌門和霉菌門是導致薄荷葉片衰老腐爛的腐敗菌[44]。從圖8 可看出，A 處理組的子囊菌門（Ascomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）占比明顯小于其余兩組，如鏈格孢屬（Alternaria）和被孢霉屬（Mortierella），與B 組和CK 組相比，其相對豐度明顯下降?？ǘ魉咕S希尼克氏酵母可在貯藏期內(nèi)抑制薄荷葉片表面腐敗菌的生長，保持薄荷較好感官品質。由圖8（B）可看出，A 組處理組中卡恩斯維希尼克氏酵母（Vishniacozyma）相對豐度高于其余兩組。由此可見，HDPE 包裝及3.5% O2+9.4% CO2+87.1% N2處理可較好地抑制葉片腐敗菌生長，有利于優(yōu)勢菌群的增加，延緩薄荷葉片衰老，對薄荷保鮮有較好的效果。

圖8 貯藏12 d 不同處理薄荷真菌在門（A）和屬（B）水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.8 Histogram of relative species abundance of menthol fungi at phylum (A) and genus (B) levels under different treatments after 12 days of storage

3 結論

本研究通過對薄荷的感官評分、失重率、色差、相對電導率、抗壞血酸含量、總葉綠素含量和菌落總數(shù)進行測定和分析，篩選出對薄荷保鮮效果較好的PE、OPP1.8/CPP3.5 和HDPE 包裝材料，并在已篩選出的最適包裝材料中，通過響應面優(yōu)化法在低氣體比例范圍內(nèi)（3%～7% O2和5%～15% CO2），對HDPE包裝的薄荷進行氣調包裝，以葉綠素含量為評價指標，篩選出保鮮效果最好的氣體比例3.5% O2+9.4%CO2。該包裝方式可顯著降低葉綠素損失，將薄荷的保鮮期由7～9 d 延長至10～12 d。利用GC-IMS 對最佳氣調組和最差氣調組貯藏期內(nèi)薄荷香氣成分的含量及變化進行測定，該部分結果表明：薄荷內(nèi)檢出主要揮發(fā)性有機物有61 種，主要為萜烯類、醛類、酮類物質，且HDPE 包裝的薄荷樣品在第12 d 時揮發(fā)性物質含量仍保持在較高水平。基于以上實驗建立能夠更準確預測氣調包裝下的薄荷二次多項式呼吸速率模型，并能有效的抑制薄荷葉片表面腐敗菌的生長，延緩薄荷腐敗，這對于果蔬氣調包裝的保鮮設計有一定的指導作用，在氣調包裝中，可以通過合理的氣體配比和最佳的包裝材料來延長果蔬的保鮮期，也為薄荷氣調包裝提供理論依據(jù)。

? The Author(s) 2024.This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).