張紅建，劉帥光，馬澤威，王青松，田 燕，鄭聯(lián)合,

（1.海南省糧油科學(xué)研究所，海南瓊海 571400；2.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南海口 570100）

青金桔（Citrus microcarpa）為蕓香科柑橘族金柑屬，是寬皮柑橘（Citrus reticulateBlanco）和金桔（Fortunellaspp.）的雜交品種[1]，主要分布于我國海南省、臺灣地區(qū)以及馬來西亞、印度尼西亞、泰國、菲律賓等熱帶及亞熱帶地區(qū)，其產(chǎn)量可達(dá)5～8 噸/年。目前海南省青金桔產(chǎn)量在25 萬噸/年左右，占全國青金桔總產(chǎn)量的90%以上。酚類化合物是植物中普遍存在的次級代謝產(chǎn)物，也是柑橘類水果中主要的功能活性物質(zhì)，具有抗氧化、降血脂、防止肥胖、改善糖尿病等多種生物活性[2-5]。青金桔皮中酚類物質(zhì)含量可達(dá)到1054～1894 mg/100 g[6]，主要以根皮素-3',5'-二-C-β-葡萄糖苷、橙皮苷、川陳皮素、桔皮素等為主[7]。研究表明，以上酚類物質(zhì)具有較好的抗氧化、抑制酪氨酸酶活性[1]，以及降血糖、降血脂、降膽固醇等生理功能[4]。青金桔產(chǎn)量較高，其所含酚類物質(zhì)等具有較好的功能活性，但目前青金桔深加工產(chǎn)品較為缺乏，現(xiàn)主要用于榨汁。并且，榨汁后產(chǎn)生大約45%的皮渣副產(chǎn)物，由于缺乏相應(yīng)的加工技術(shù)，其基本被丟棄，從而造成較大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染[8]。

果蔬自然發(fā)酵是指新鮮果蔬在添加或不添加輔料的條件下，通過果蔬自身攜帶及環(huán)境中的微生物的新陳代謝作用，合成具有多種生物活性的酶類和代謝產(chǎn)物的過程。因其具有設(shè)備投入少、操作簡單、發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味獨(dú)特，能實(shí)現(xiàn)對集中收獲果蔬的快速加工等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為果蔬加工研究的熱點(diǎn)[9]。青金桔富含水、有機(jī)酸、果膠、糖類、維生素以及豐富的微量元素[10]，在不添加任何其他物質(zhì)的條件下，可作為自然發(fā)酵的天然培養(yǎng)基。因此，采用全果漿自然發(fā)酵可實(shí)現(xiàn)青金桔100%全利用，最大程度保留青金桔營養(yǎng)和風(fēng)味。研究表明，微生物發(fā)酵果蔬過程中可產(chǎn)生纖維素酶等[11]，促使植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)水解，促進(jìn)可溶性酚類物質(zhì)釋放，從而改善發(fā)酵產(chǎn)物生理活性[12]。盡管如此，目前針對青金桔酚類物質(zhì)的報(bào)道主要集中在提取及抗氧化性的變化[7,13]，缺乏青金桔酚類物質(zhì)種類系統(tǒng)、全面的研究，關(guān)于青金桔在發(fā)酵前后酚類物質(zhì)的變化情況尚不不清楚，青金桔酚類物質(zhì)對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶等消化相關(guān)酶活性抑制情況也未見報(bào)道，這對青金桔的深加工及綜合利用影響較大。非靶向代謝組學(xué)技術(shù)具有高通量、高靈敏度、檢測范圍廣等特點(diǎn)，可最大程度檢測樣品中的代謝物，從而較為全面地反映樣品的總代謝物特征，其在動(dòng)植物代謝研究方面被廣泛應(yīng)用[14-16]。

為全面、系統(tǒng)地闡明青金桔酚類物質(zhì)種類及自然發(fā)酵對青金桔酚類物質(zhì)變化、消化相關(guān)酶活性抑制情況。本研究對青金桔全果漿進(jìn)行自然發(fā)酵，比較了發(fā)酵前后青金桔可溶性總酚、總黃酮、結(jié)合酚含量及抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活性的變化情況?；诔咝б合嗌V-四極桿/靜電場軌道阱傅里葉轉(zhuǎn)換聯(lián)用質(zhì)譜儀（UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS）代謝組學(xué)技術(shù)，對自然發(fā)酵前后酚類物質(zhì)種類、酚類差異代謝物及其代謝通路進(jìn)行分析，最后利用相關(guān)系數(shù)分析探討酚類差異代謝物與可溶性總酚、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶抑制率的相關(guān)關(guān)系，為自然發(fā)酵在青金桔加工中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

青金桔 海南青金桔食品科技有限公司；甲醇色譜純，德國CNW 公司；甲酸 色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（色譜純）、α-淀粉酶（≥5 units/mg，來源于豬胰）、胰脂肪酶（8×USP）、4-硝基苯基乙酸酯（分析純） Sigma-aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；α-葡萄糖苷酶（≥50 units/mg，來源于酵母）、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖（分析純） 上海源葉生物科技有限公司。

DMM-40 型膠體磨 上海秦碩化工機(jī)械設(shè)備有限公司；LGJ-10NS/GC 型冷凍干燥機(jī) 北京亞星儀科科技發(fā)展有限公司；CenLee16X 臺式高速離心機(jī) 湖南湘立科學(xué)儀器有限公司；PLUS-E2-20TJ 實(shí)驗(yàn)室級超純水機(jī) 南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司；FlexA-200 酶聯(lián)免疫分析儀 杭州優(yōu)米儀器有限公司；UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 超高效液相色譜-四極桿靜電場軌道阱傅里葉轉(zhuǎn)換聯(lián)用質(zhì)譜儀Thermo Fisher Scientific 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 青金桔全果漿發(fā)酵樣品的制備 青金桔清洗晾干后，全果打漿，過篩，放入發(fā)酵罐中自然發(fā)酵10 d。分別在未發(fā)酵（A 組）以及發(fā)酵10 d 后（B 組）取樣，4 個(gè)生物學(xué)重復(fù)分別命名為A1、A2、A3、A4 和B1、B2、B3、B4。取樣后樣品存放于-80 ℃冰箱中12 h，取出冷凍干燥12 h，裝入帶有磨口的棕色瓶中，-18 ℃儲存，備用。

1.2.2 可溶性總酚提取及樣液制備

1.2.2.1 可溶性總酚提取 酚類物質(zhì)提取參考Rodríguez 等[15]的方法，并進(jìn)行了適當(dāng)修改，具體方法如下。準(zhǔn)確稱取冷凍干燥后的樣品0.2 g 于15 mL 離心管中，加入10 mL 70%甲醇浸泡，將樣品置于超聲清洗器中，360 W、50 ℃超聲30 min。樣品提取液用0.22 μm 孔徑濾膜過濾。

1.2.2.2 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 測試樣液制備 取以上部分提取液于1.5 mL 離心管中，-40 ℃靜置1 h，于4 ℃、12000 r/min 下離心15 min。移取200 μL 上清，上機(jī)測定。質(zhì)控樣（quality control samples）由等量A、B 組總酚提取液混合制備而成。

1.2.3 總酚含量的測定 方法參考Lou 等[6]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。具體如下，125 μL 上述提取液或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與125 μL 的福林酚試劑（Folin &Ciocalteu 酚試劑）反應(yīng)3 min?；旌衔锛尤氲?.25 mL 20%的Na2CO3溶液中，室溫條件下、黑暗環(huán)境反應(yīng)30 min，過0.22 μm 孔徑濾膜，取200 μL 于750 nm 處測定吸光值。以70%甲醇溶液為空白，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為沒食子酸（GA）（50～500 μg/mL）。總酚以mgGA 當(dāng)量/100 g 凍干樣品表示。每個(gè)樣品測試4 次，取平均值。

1.2.4 總黃酮測定 方法參考Lou 等[7]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。具體如下，取可溶性總酚提取液500 μL 置于2 mL 離心管中，向其加入30 μL 5% NaNO2溶液，振蕩搖勻，置于室溫條件下5 min；繼續(xù)加入30 μL 的10% AlCl3溶液，振蕩搖勻后置于溫室下放置6 min；加入200 μL 1 mol/L NaOH 溶液，最后用70%甲醇溶液將反應(yīng)混合液總體積定容至1 mL；將溶液再次振蕩混勻，在室溫下反應(yīng)30 min。用酶標(biāo)儀測定其在510 nm 處的吸光度。以70%甲醇溶液作為空白對照，用20.0～100.0 μg/mL 蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)黃酮化合物，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品中總黃酮含量以mg蘆丁/100 g 凍干樣表示。

1.2.5 結(jié)合態(tài)多酚測定 方法參考Multari 等[17]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。具體如下，取上述可溶性總酚提取后剩余濾渣，轉(zhuǎn)入真空冷凍旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，于50 ℃的條件下蒸干。加入10 mol/L NaOH 溶液2 mL（渣:NaOH 溶液=1:10，W/V），室溫條件下水解16 h，溶液再用HCl（10 mol/L）調(diào)整pH 至2.5，釋放的酚類采用5 mL 冷的乙醚（DE）和乙酸乙酯（EA）混合物（DE/EA，1:1，V/V）進(jìn)行振蕩萃取15 min，4000 r/min 離心10 min，以上重復(fù)3 次。合并3 次所得的DE/EA 層，采用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀50 ℃干燥，干燥后樣品溶入一定量色譜級甲醇中，溶液保存于帶有磨口的棕色試劑品中，于-18 ℃儲存待用。后續(xù)測定方法參考本文中1.2.3。

1.2.6 消化相關(guān)酶抑制率的測定

1.2.6.1α-淀粉酶抑制率的測定 方法參考Fu 等[18]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將250 μL、50 U/mL 的豬胰腺α-淀粉酶溶液（溶于20 mmol/L pH6.9 磷酸鹽緩沖液）與200 μL 提取液在37 ℃水浴中孵育10 min，加入1%可溶性淀粉溶液160 μL，于37 ℃水浴條件下反應(yīng)15 min，加入100 μL DNS 溶液終止以上反應(yīng)。以上混合液于沸水浴中反應(yīng)5 min，取出冷卻，取150 μL 于波長540 nm 處測定其吸光值。

式中：IR 表示α-淀粉酶抑制率，%；ABS控制表示酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS控制空白表示不加酶時(shí)底物的吸光值；ABS樣品表示樣品、酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS樣品空白表示樣品與底物反應(yīng)的吸光值。

1.2.6.2α-葡萄糖苷酶抑制率的測定 參考Fu 等[18]的方法，并進(jìn)行適當(dāng)修改。10 μL 提取液與50 μLα-葡萄糖苷酶（1.0 U/mL 溶于0.1 mol/L pH6.8 的磷酸鹽緩沖液中）添加到96 孔板中，振動(dòng)均勻，于37 ℃條件下孵化15 min。然后將50 μL 的pNPG（5 mmol/L溶于0.1 mol/L pH6.8 的磷酸鹽緩沖液中）添加到96 孔板中，振動(dòng)均勻，繼續(xù)于37 ℃條件下孵化15 min。添加150 μL 0.5 mmol/L 的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，于415 nm 處測吸光值。酶活力以從pNPG 中釋放的p-硝基酚表示。

式中：IR 代表α-葡萄糖苷酶抑制率，%；ABS控制代表酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS控制空白表示不加酶時(shí)底物的吸光值；ABS樣品表示樣品、酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS樣品空白代表樣品與底物反應(yīng)的吸光值。

1.2.6.3 胰脂肪酶抑制率的測定 方法參考Pods?dek 等[19]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。配制50 mmol/L 4-硝基苯基乙酸酯，再用純水稀釋至10 mmol/L。豬胰脂肪酶用水溶解為10 mg/mL，13000 r/min 離心5 min，取上清液。反應(yīng)體系如下：10 μL 提取液、50 μL 脂肪酶、140 μL 0.1 mol/L Tris 緩沖液（pH7.4），37 ℃孵育10 min，再加入50 μL 10 mmol/L 的4-硝基苯基乙酸酯。37 ℃反應(yīng)15 min 后于400 nm 處測其吸光度。胰脂肪酶抑制率為：

式中：IR 為胰脂肪酶抑制率，%；ABS控制表示酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS控制空白表示不加酶時(shí)底物的吸光值；ABS樣品表示樣品、酶與底物反應(yīng)的吸光值；ABS樣品空白表示樣品與底物反應(yīng)的吸光值。

1.2.7 UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 測定酚類物質(zhì)種類及相對含量 色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫為40 ℃；流速0.3 mL/min；流動(dòng)相組成A：水（0.05%甲酸），B：乙腈（100%）；進(jìn)樣量：5 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃；采用梯度洗脫，程序如下：0～1.0 min，95%A；1～12.5 min，95%～5% A；12.5～13.5 min，5% A；13.5～13.6 min，5%～95% A；13.6～16.0 min，95% A。質(zhì)譜檢測參數(shù)：采用一級全掃描（Full Scan，m/z 70～1050）與數(shù)據(jù)依賴性二級質(zhì)譜掃描（dd-MS2，TopN=10），分辨率：70000（一級質(zhì)譜）&17500（二級質(zhì)譜）；碰撞模式為高能量碰撞解離（HCD）；加熱器溫度300 ℃、毛細(xì)管溫度為350 ℃、鞘氣流速為45 arb、輔助氣流速為15 arb、尾氣流速為1 arb；正離子模式時(shí)電噴霧電壓為3.0 kV、S-Lens RF Level 為30%；負(fù)離子模式時(shí)電噴霧電壓：-3.2 kV、S-Lens RF Level 為60%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

可溶性總酚含量、消化相關(guān)酶抑制率及UPLCQ Exactive Orbitrap-MS 測試均進(jìn)行4 次生物學(xué)重復(fù)，其中可溶性總酚含量及消化相關(guān)酶抑制率結(jié)果均以平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示。

UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 非靶向代謝組學(xué)數(shù)據(jù)分析均在美吉生物云平臺（https://www.majorbio.com/web/www/index）進(jìn)行處理。對單個(gè)峰進(jìn)行過濾，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)。采用最小值二分之一法填補(bǔ)原始數(shù)據(jù)中的缺失值，利用總和法進(jìn)行歸一化。處理后的數(shù)據(jù)通過與HumanMetabolome Database（HMDB）（http://www.hmdb.ca）、Metlin（https://metlin.scripps.edu）、massbank（http://www.massbank.jp/）、mzclound（https://www.mzcloud.org/）等數(shù)據(jù)庫及自建數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，對酚類物質(zhì)進(jìn)行定性。采用正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）對差異酚類物質(zhì)進(jìn)行篩選，差異酚類物質(zhì)上傳至KEGG 網(wǎng)站，進(jìn)行功能通路及通路富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)酵前后青金桔可溶性總酚、總黃酮、結(jié)合酚及抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性變化

α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶是人體中與消化相關(guān)的關(guān)鍵酶，對其活性的抑制可減少膳食中糖脂類物質(zhì)的吸收，對預(yù)防Ⅱ型糖尿病、改善肥胖具有促進(jìn)作用[20]。自然發(fā)酵對青金桔可溶性總酚、總黃酮、結(jié)合酚及抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性的影響結(jié)果見圖1。由圖1 可知，自然發(fā)酵可使可溶性總酚、總黃酮、結(jié)合酚含量及對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的抑制率均顯著上升（P＜0.05），其中總酚含量、總黃酮、結(jié)合酚分別提升9.20%、23.68%、31.18%，α-淀粉酶、α-葡萄糖酶及胰脂肪酶抑制率分別提升11.90%、12.64%、28.50%。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Kim 等[21]、董玉婷等[22]研究結(jié)果一致。發(fā)酵過程中酵母、乳酸菌等微生物，可合成、釋放纖維素酶、β-糖苷酶等水解酶，斷裂酚類與植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)間、糖類及肽類間的化學(xué)鍵，促使不溶性結(jié)合態(tài)多酚轉(zhuǎn)化為可溶性多酚，綴合態(tài)多酚轉(zhuǎn)化為游離態(tài)多酚，增加可溶性總酚含量、提升其功能活性[12,17]。本研究中發(fā)酵后結(jié)合酚含量沒有因轉(zhuǎn)化為可溶性酚類而降低，反而呈現(xiàn)顯著增加（P＜0.05）。其原因可能是發(fā)酵等加工使植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)被破壞，結(jié)合酚更容易被提取，此結(jié)果也與Lou 等[7]、Multari等[17]研究結(jié)果一致。

圖1 自然發(fā)酵前后青金桔可溶性總酚、總黃酮、結(jié)合酚及抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶活性變化Fig.1 Changes of soluble total phenol,total flavone,bound phenol and inhibitory activities of α-amylase,α-glucoase and pancreatic lipase of Citrus microcarpa before and after natural fermentation

2.2 自然發(fā)酵前后青金桔酚類物質(zhì)的鑒定

基于UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 對自然發(fā)酵前后青金桔酚類物質(zhì)進(jìn)行測定，利用HMDB、Metlin、massbank、mzclound 及自建數(shù)據(jù)庫對自然發(fā)酵前后青金桔酚類物質(zhì)進(jìn)行定性，發(fā)酵前后總離子流圖如圖2，鑒定到的酚類物質(zhì)種類結(jié)果見表1。在正、負(fù)離子模式下從自然發(fā)酵青金桔中共檢測出52 種酚類物質(zhì)，與未發(fā)酵青金桔酚類物質(zhì)種類一致，即自然發(fā)酵未改變酚類物質(zhì)種類。青金桔酚類物質(zhì)中，黃酮類物質(zhì)種類最多，達(dá)到了18 種，其次為酚酸類8 種，二氫黃酮類7 種，香豆素類6 種，二氫査耳酮類5 種，黃酮醇類2 種，異黃酮、木質(zhì)素類及花青素類均為1 種，其他酚類3 種。Roowi 等[23]基于HPLC-PDA-MS2對青金桔中酚類物質(zhì)進(jìn)行了定性，確定了根皮素-3',5'-二-C-β-葡萄糖苷、橙皮苷、維采寧-2 等7 種酚類物質(zhì)；Lou 等[7]對不同溶劑提取的青金桔酚類進(jìn)行了測定，共檢測到類黃酮物質(zhì)6 種，酚酸類物質(zhì)5 種。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果涵蓋了已報(bào)道青金桔中所有的酚類物質(zhì)種類[1]，并首次在青金桔中發(fā)現(xiàn)了異鼠李素、牡荊素、枇杷苷等30 種酚類物質(zhì)。

表1 自然發(fā)酵前后青金桔中酚類物質(zhì)種類Table 1 Types of phenols in Citrus microcarpa before and after natural fermentation

圖2 青金桔自然發(fā)酵前后酚類提取物總離子流圖Fig.2 TIC of phenolic extract of Citrus microcarpa before and after natural fermentation

2.3 自然發(fā)酵前后青金桔酚類物質(zhì)差異性分析

2.3.1 青金桔酚類物質(zhì)主成分分析 主成分分析（principal component analysis，PCA）得分圖可反映樣品的相似性程度，圖中樣品越聚集，表明樣品相似性越強(qiáng)。由圖3 可知，質(zhì)控樣（quality control samples，QC）樣品聚集性較高，表明儀器設(shè)備運(yùn)行穩(wěn)定、實(shí)驗(yàn)方法可靠、數(shù)據(jù)質(zhì)量高。A、B 組樣品聚集程度都較高，其中A 組樣品分布于PCA 圖中左上角，B 組樣品分布于右上角，且第一主成分（PC1）和第二主成分（PC2）的解釋率分別為83.85%、7.84%，兩者累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到91.69%。因此，A、B 組中各組內(nèi)樣品間重復(fù)性較好，A、B 組間樣品差異顯著，自然發(fā)酵處理可有效改變青金桔酚類物質(zhì)組成。

圖3 自然發(fā)酵前后青金桔酚類物質(zhì)PCA模型的得分圖Fig.3 PCA scores of phenolic substances of Citrus microcarpa before and after natural fermentation

2.3.2 自然發(fā)酵前后青金桔酚類差異代謝物的篩選與分析 以PLS-DA 模型中變量影響投影值（variable influence on projection，VIP）＞1、差異倍數(shù)（fold change）＞1 或＜0.5 且P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，對自然發(fā)酵前后青金桔中酚類差異代謝物進(jìn)行篩選，其結(jié)果見表2。由表2 可知，自然發(fā)酵后共有10 種酚類物質(zhì)發(fā)生顯著變化，占全部酚類物質(zhì)種類的19.23 %，其中包括5 種黃酮類、3 種香豆素類、2 種酚酸類。差異代謝物中，除甲氧沙林下調(diào)外，其余9 種物質(zhì)均上調(diào)，根據(jù)FC 值可以看出，山奈酚上調(diào)倍數(shù)最大，達(dá)到13.82，其次為芹菜素（10.99）、咖啡酸（5.02）、三葉草素（3.06）、芥子酸（2.55）、東莨菪堿（2.17）、7-羥基香豆素（1.24）、川陳皮素（1.15）、牡荊素（1.07）。

表2 自然發(fā)酵前后青金桔中顯著差異的酚類物質(zhì)Table 2 Significant difference of phenolic substances in Citrus microcarpa before and after natural fermentation

Hu 等[12]對固態(tài)發(fā)酵條件下不同菌種發(fā)酵柑橘果渣后酚類物質(zhì)變化情況進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌P10、枯草芽孢桿菌BF2 等單獨(dú)或混合發(fā)酵均能使得糖苷類黃酮如柚皮苷、橙皮苷及苷元類黃酮如橙皮素、柚皮素、川陳皮素等含量顯著增加。這一結(jié)果與本研究基本一致。而Kim 等[21]采用自然發(fā)酵劑對柑橘副產(chǎn)物進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)，僅橙皮素、柚皮素等苷元類黃酮增加，而蘆丁、柚皮苷等糖苷類黃酮減少。這可能與發(fā)酵方式及微生物所產(chǎn)酶種類有關(guān)，采用固態(tài)發(fā)酵或半固態(tài)發(fā)酵時(shí)，發(fā)酵基質(zhì)等流動(dòng)性差，微生物只能利用周邊營養(yǎng)物質(zhì)，故迫使其多產(chǎn)纖維素酶、木聚糖酶等[24]，促進(jìn)結(jié)合態(tài)多酚與植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)分離，糖苷類、苷元類酚類物質(zhì)均增加。而液體發(fā)酵過程中，微生物可能優(yōu)先產(chǎn)β-糖苷酶等，促使糖苷類黃酮上與葡萄糖等糖類物質(zhì)鏈接的O-糖苷或C-糖苷等斷裂，糖苷類黃酮轉(zhuǎn)化為苷元類黃酮，導(dǎo)致糖苷類黃酮減少，苷元類黃酮增加[25]。

2.3.3 青金桔酚類差異代謝物通路富集分析 為明確哪些代謝通路在自然發(fā)酵過程中對青金桔酚類物質(zhì)變化產(chǎn)生影響，本研究對自然發(fā)酵前后青金桔中酚類差異代謝物的代謝通路進(jìn)行了富集分析，具體的代謝通路及相應(yīng)的代謝物見圖4 及表3。圖4 中每個(gè)氣泡表示一條代謝通路，氣泡的大小代表該通路中富集到差異代謝物種類的多少，氣泡越大，表示該通路中酚類差異代謝物種類越多。氣泡所在位置和顏色表示P值大小，P值越小，顏色越紅，富集程度越顯著。由圖4 及表3 可知，自然發(fā)酵影響青金桔酚類物質(zhì)變化的代謝通路有6 條，其中顯著富集的有4 條，分別為苯丙烷類化合物的生物合成通路、黃酮和黃酮醇生物合成通路、類黃酮生物合成通路及多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成Ⅰ通路。該研究結(jié)果與張子潔等[26]研究結(jié)果一致。

表3 顯著差異酚類物質(zhì)參與的代謝途徑Table 3 Metabolic pathways involved in significant differences of phenolic substances

圖4 自然發(fā)酵前后青金桔中差異酚類物質(zhì)的KEGG 富集圖Fig.4 KEGG enrichment of differential phenolic substances in Citrus microcarpa before and after natural fermentation

植物中酚類物質(zhì)以糖代謝中部分中間體為前體物質(zhì)，經(jīng)由莽草酸途徑產(chǎn)生苯丙氨酸，再經(jīng)苯丙烷代謝途徑產(chǎn)生香豆酰-CoA、黃酮代謝途徑合成査耳酮、二氫查耳酮。二氫查耳酮作為其他黃酮類化合物的主要前體物質(zhì)，經(jīng)過不同的分支合成途徑，最終生成黃酮、黃酮醇、異黃酮、黃烷酮和花青素等[27]。本研究富集到的顯著代謝通路中包含了苯丙烷代謝途徑、黃酮代謝途徑及其分支代謝通路，涉及到酚類代謝差異物質(zhì)有7-羥基香豆素、芹菜素、山奈酚、東莨菪堿、咖啡酸、芥子酸、牡荊素、三葉草素。本研究中未富集到莽草酸途徑，可能是其核心代謝物質(zhì)莽草酸、香豆酰-CoA 等作為非酚類物質(zhì)未被鑒定。

因此，除多種次生代謝產(chǎn)物的生物合成Ⅰ通路因涉及甲氧沙林降解而可能引起可溶性總酚下降外，苯丙烷類化合物的生物合成通路、黃酮和黃酮醇生物合成通路、類黃酮生物合成通路等都與自然發(fā)酵過程中青金桔酚類物質(zhì)增加有關(guān)。

2.4 青金桔酚類差異代謝物與生物活性相關(guān)性研究

α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶作為主要存在于小腸中影響人體糖脂類物質(zhì)消化、吸收的關(guān)鍵酶，抑制其活性對防止肥胖、改善糖尿病等代謝紊亂癥具有顯著作用。本研究利用Spearman 相關(guān)系數(shù)分析了青金桔中酚類差異代謝物與其抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活性間的互作關(guān)系。相關(guān)性分析熱圖見圖5。由圖5 可知，除甲氧沙林外，其余9 種差異代謝物均與可溶性總酚含量及抑制消化相關(guān)酶活性呈正相關(guān)。其中，7 種酚類差異代謝物與抑制胰脂肪酶活性呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.6 且P＜0.05），物質(zhì)分別為川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚、7-羥基香豆素、芥子酸、東莨菪堿；6 種酚類差異代謝物與抑制α-葡萄糖苷酶活性呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.7 且P＜0.05），物質(zhì)分別為川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚、牡荊素、三葉草素；6 種酚類差異代謝物與抑制α-淀粉酶活性呈顯著正相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.6 且P＜0.05），物質(zhì)分別為川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚、牡荊素、東莨菪堿。而以上10 種酚類差異代謝物與可溶性總酚含量均未表現(xiàn)出顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

圖5 青金桔酚類差異代謝物與生物活性相關(guān)性熱圖Fig.5 Thermal map of correlation between phenolic differential metabolites and biological activity of Citrus microcarpa

本研究中川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚等四種酚類對抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活性均呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），由此可推測以上四種物質(zhì)對消化相關(guān)酶活性具有一定抑制作用。相關(guān)研究表明，芹菜素[28]、山柰酚[28]、咖啡酸[29]對胰脂肪酶抑制的IC50值分別為4.53×10-4mol/L、2.29×10-4mol/L、0.88 mg/mL。酚類物質(zhì)主要通過與酶結(jié)合，誘導(dǎo)酶結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而發(fā)揮抑制作用。酚類物質(zhì)種類不同，其與酶結(jié)合的作用力也不同。Yan等[30]研究發(fā)現(xiàn)川陳皮素主要通過氫鍵與胰脂肪酶結(jié)合，而芹菜素與胰脂肪酶結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)力是范德華力和氫鍵，山柰酚[28]、咖啡酸[29]為疏水作用力；芹菜素對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶抑制的IC50值分別為21.66、1.43×10-5mmol/L，抑制類型均為非競爭抑制，與α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶之間僅有一個(gè)或一類結(jié)合位點(diǎn)[31]。以上研究證實(shí)，川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚等均能有效抑制消化相關(guān)酶活性，但其在青金桔多酚中對消化相關(guān)酶具體抑制率的貢獻(xiàn)大小及是否對消化相關(guān)酶活性存在協(xié)同抑制作用等仍需進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本研究基于UPLC-Q Exactive Orbitrap-MS 代謝組學(xué)研究了自然發(fā)酵對青金桔酚類物質(zhì)變化及其抑制α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胰脂肪酶活性的影響。結(jié)果表明：自然發(fā)酵可促進(jìn)青金桔中可溶性總酚、總黃酮釋放，顯著提升以上三種消化相關(guān)酶抑制率（P＜0.05）；青金桔中共檢測到酚類物質(zhì)52 種，自然發(fā)酵未改變酚類物質(zhì)種類，但可使川陳皮素、咖啡酸、牡荊素等9 種酚類物質(zhì)含量顯著增加（P＜0.01），其中川陳皮素、芹菜素、咖啡酸、山奈酚等四種酚類差異代謝物對抑制以上三種消化相關(guān)酶活性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。因此，自然發(fā)酵可作為青金桔加工的一種有效手段。青金桔中酚類物質(zhì)種類較多，含量相差較大，下一步將探討酚類物質(zhì)在發(fā)酵過程中絕對含量的變化情況，及川陳皮素、芹菜素等對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、胰脂肪酶的具體抑制率的貢獻(xiàn)大小及協(xié)同抑制效果。

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