辛交蓮 龍凱澳 鄧 彪，2 李振龍，2▲

胃腸功能障礙（gastrointestinal dysfunction，GID）常出現(xiàn)在危重患者中，且與臨床預(yù)后較差相關(guān)，是一組涉及胃和腸道的功能性疾病，無明顯的器質(zhì)性病變，可涵蓋運(yùn)動(dòng)和/或吸收障礙、免疫屏障受損、微生物組變化和灌注受損等。GID主要癥狀包括腹痛、腹脹、嘔吐、便秘、腹瀉等，甚者出現(xiàn)腸梗阻、應(yīng)激性潰瘍伴出血等。GID發(fā)生機(jī)制尚不明確，可能與神經(jīng)肌肉活動(dòng)失調(diào)、菌群穩(wěn)態(tài)被破壞、免疫系統(tǒng)等相關(guān)，多繼發(fā)于嚴(yán)重感染、神經(jīng)功能障礙等[1-2]。在膿毒癥患者中，其發(fā)病率約為78.8%，病死率過半[3]。目前，GID 的藥物治療主要包括護(hù)胃、抗胃腸痙攣、改善腸道菌群、促進(jìn)胃動(dòng)力恢復(fù)等對癥治療。根據(jù)中醫(yī)辨病方法劃分，GID 歸 屬 于 中 醫(yī) 學(xué)“痞 證”“腹 脹”“胃 痛”“泄 瀉”“痞滿”等范疇，其病機(jī)為氣機(jī)逆亂、升降失常[4，5]，臨床上以老年人最為多見，危重患者尤甚。該病多為本虛標(biāo)實(shí)之證，其中脾胃氣虛為其發(fā)病基礎(chǔ)，疾病早期多以氣滯腑實(shí)為標(biāo)，疾病中期多以瘀熱內(nèi)結(jié)為標(biāo)，疾病晚期多以濕濁內(nèi)阻為標(biāo)，治療上常以補(bǔ)虛為主、瀉實(shí)為輔，健脾和胃貫穿治療的始終[6]。六君子湯出自《醫(yī)學(xué)正傳》，由四君子湯加陳皮、半夏組成，被廣泛用于治療脾胃虛弱所導(dǎo)致的消化不良、食欲不振、腹脹等。本方中以黨參替人參，同樣具有益氣健脾、燥濕化痰的功效，在臨床實(shí)踐中已得到療效證實(shí)[7-9]。

多靶點(diǎn)作用是中草藥治療疾病的特點(diǎn)，其多成分作用的復(fù)雜機(jī)制，可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，構(gòu)建生物分子信息網(wǎng)絡(luò)，更好地詮釋中藥的復(fù)雜作用機(jī)制。分子對接技術(shù)通過模擬相互作用狀態(tài)，以預(yù)測藥物的活性和作用機(jī)制，同時(shí)可節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間和成本。本研究通過結(jié)合使用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，可靈活地實(shí)現(xiàn)不同類型中藥成分作用于不同靶點(diǎn)狀態(tài)的可視化，探究六君子湯治療GID 可能存在的分子作用機(jī)制。

1 方法

1.1 篩選六君子湯藥物活性成分及相關(guān)靶點(diǎn)運(yùn)用R 軟件運(yùn)行程序于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCM-SP，https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索，以口服生物利用度（oral bioavalability，OB）≥30%、分子類藥性（drug like，DL）≥0.18 為限定條件進(jìn)行篩選，獲得六君子湯中6味中藥的活性成分，并根據(jù)所得活性成分在TCM-SP 中找出相應(yīng)靶點(diǎn)。為便于后續(xù)的數(shù)據(jù)分析，在UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）中檢索篩選出的靶點(diǎn)蛋白，即在Uniprot 搜索欄中直接點(diǎn)擊Search，切換界面后于左側(cè)邊欄依次點(diǎn)擊“Human”“Reviewed（Swiss-Prot）”，然后在自定義欄目“Customize columns”中加入限定條件“Gene Names（primary）”，最后“Download”所篩選出靶點(diǎn)蛋白的Excel 表格，使用基因名（gene name）將靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行統(tǒng)一轉(zhuǎn)化，規(guī)范命名。

1.2 GID 相關(guān)靶點(diǎn)檢索在DisGeNET 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org/）、GeneCards 數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）和OMIM 數(shù) 據(jù) 庫（https：//www.omim.org/）中，以“Gastrointestinal Dysfunction”為關(guān)鍵詞檢索，將所得靶點(diǎn)蛋白存入Excel進(jìn)行合并去重，獲得GID的疾病作用靶點(diǎn)。

1.3 獲取六君子湯-GID 交集靶點(diǎn)通過上述步驟得到藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)后進(jìn)行整合，然后導(dǎo)入VENNY 2.1 網(wǎng) 站（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny） 獲取交集靶點(diǎn)，可通過繪制韋恩（Venn）圖以實(shí)現(xiàn)交集靶點(diǎn)的可視化。

1.4 六君子湯-成分-靶點(diǎn)蛋白-GID 互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及PPI 網(wǎng)絡(luò)分析上述篩選出的藥物活性成分及其靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.10.0 軟件，構(gòu)建“六君子湯-成分-靶點(diǎn)蛋白-GID”網(wǎng)絡(luò)圖，即藥物活性成分-靶點(diǎn)蛋白-疾病互作圖。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析首先由韋恩圖所得靶點(diǎn)上傳至STRING網(wǎng)站后，勾選“最低要求的互動(dòng)分?jǐn)?shù)（minimum required interaction score）”為“high confidence（0.9）”，其他設(shè)置選擇默認(rèn)，然后進(jìn)行分析，再導(dǎo)出PPI 互作網(wǎng)絡(luò)分析圖及tsv 文件，最后利用Cytoscape 3.10.0中Network Analyzer 分析PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選其中的重要靶點(diǎn)。

1.5 基因本體和京都基因與基因組百科全書通路富集分析利用六君子湯及GID交集靶點(diǎn)，對所得的核心靶點(diǎn)通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）進(jìn)行通路富集分析，將核心靶點(diǎn)上傳至微生信網(wǎng)絡(luò)分析平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/），分析后可得分子功能（molecular functions，MF）、細(xì)胞組成（cellular components，CC）、生物過程（biological processes，BP）和KEGG 富集通路，導(dǎo)出可視化結(jié)果。

1.6 分子對接由pymol 軟件將配體和受體進(jìn)行修飾，運(yùn)用AutoDock（一種分子建模模擬軟件）進(jìn)行半柔性對接，以反向驗(yàn)證六君子湯藥物活性成分與核心靶點(diǎn)之間的作用關(guān)系，以實(shí)現(xiàn)計(jì)算機(jī)的虛擬驗(yàn)證。此外，分子對接存在虛擬篩選的作用，通過虛擬對接所需的結(jié)合能以判斷分子的結(jié)合活性。進(jìn)行分子對接之前，需依據(jù)上述所得藥物活性成分、核心共靶點(diǎn)結(jié)果，進(jìn)行再次篩選后方可實(shí)行分子對接，在TCM-SP中進(jìn)行查詢并獲得活性成分的mol 2 結(jié)構(gòu)；在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫（protein data bank，PDB）中檢索核心靶點(diǎn)，選擇并保存其pdb 格式文件。準(zhǔn)備對接前的配體和受體，首先由AutoDock 軟件對藥物活性成分進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷等操作，處理成配體，接下來用pymol 對核心靶點(diǎn)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行去配體、加氫、去水等操作，處理蛋白成受體，設(shè)置Atoms為Assign AD4 type，處理好的文件均保存為pdbqt格式。采用拉馬克遺傳算法準(zhǔn)備docking 文件，進(jìn)行柔性對接，最后用pymol 將所得配體與受體進(jìn)行分子對接可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 六君子湯藥物活性成分及靶點(diǎn)蛋白篩選運(yùn)用R 軟件實(shí)現(xiàn)在TCM-SP 中收集六君子湯活性成分，完成篩選后共獲得：黨參活性成分17個(gè)，茯苓活性成分6個(gè)，白術(shù)活性成分4個(gè)，陳皮活性成分5個(gè)，半夏活性成分11 個(gè)，甘草活性成分88 個(gè)。將所有活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重，統(tǒng)一基因名后得到潛在靶點(diǎn)蛋白218個(gè)。

2.2 GID 相關(guān)靶點(diǎn)篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)，其中，DisGeNET 中獲得15 個(gè)靶點(diǎn)，GeneCards 所得數(shù)據(jù)在Excel 中經(jīng)過三次中位數(shù)卡值后獲得1362 個(gè)靶點(diǎn)，OMIM中經(jīng)去重后獲得44個(gè)靶點(diǎn)，將所有疾病靶點(diǎn)合并去重后得到1376個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

2.3 六君子湯-成分-靶點(diǎn)蛋白-GID 交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)輸入Venny2.1.0 網(wǎng)絡(luò)平臺，得到交集靶點(diǎn)Venn 圖（見圖1），共108 個(gè)交集靶點(diǎn)；用108 個(gè)靶點(diǎn)輸入STRING 庫，選擇minimum required interaction score 為0.9，得PPI 圖（見圖2），圖中包含108 個(gè)節(jié)點(diǎn)、451 條邊，平均節(jié)點(diǎn)度值8.35，PPI富集P值＜1.0e-16；由Cytoscape 3.10.0 軟件綜合分析得到六君子湯-成分-靶點(diǎn)蛋白-GID交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（見圖3）；導(dǎo)出網(wǎng)絡(luò)分析文件，由度值降序排列選取前10 個(gè)成分為藥物核心成分，即槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等（見表1）；再由所得PPI 網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)出tsv 文件，經(jīng)Cytoscape 3.10.0 中Network Analyzer分析PPI網(wǎng)絡(luò)，最終獲得79個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)（見圖4A），選取2 次Degree 中位數(shù)7、11.5 進(jìn)行篩選，最終獲得PPI 中28 個(gè)靶點(diǎn)作為核心作用靶點(diǎn)（見圖4B），分 別 為：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1、RELA、MAPK14、IL6、TNF、IL10、MYC、MAPK8、ESR1、CREB1、EGFR、HIF1A、CDKN1A、STAT1、VEGFA、RB1、CCND1、CASP3、IL4、IL1B、CAV1、BCL2L1、IL2、BCL2。其中，度值排名靠前的5個(gè)靶點(diǎn)作為分子對接目標(biāo)，分別為：STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1。

表1 六君子湯藥物核心活性成分

圖1 六君子湯與GID靶點(diǎn)交集韋恩圖

圖2 六君子湯與GID交集靶點(diǎn)蛋白PPI圖

圖3 六君子湯-成分-核心靶點(diǎn)-GID互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 六君子湯與GID核心交集靶點(diǎn)蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化圖

2.4 富集分析進(jìn)入微生信網(wǎng)絡(luò)分析平臺（https：//www.bioinformatics.com.cn/），選擇GO-KEGG 富集分析，提交79 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[選擇物種為“人類（Human，has）”]，獲得富集分析圖，根據(jù)P值（校正后P值）選取與GID 相關(guān)的前10 條。KEGG 富集分析中，主要包括：脂質(zhì)與粥樣硬化通路（Lipid and atherosclerosis）、乙型肝炎（Hepatitis B）、前列腺癌（Prostate cancer）、糖尿病并發(fā)癥通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、卡波西肉瘤相關(guān)病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、丙型肝炎（Hepatitis C）、人巨細(xì)胞病毒感染（Human cytomegalovirus infection）、膀胱癌（Bladder cancer）、IL-17 信號通路（IL-17 signaling pathway）、弓形蟲病（Toxoplasmosis）等（見圖5）。

圖5 六君子湯與GID的KEGG富集分析結(jié)果圖

GO功能分析中，生物過程主要包括：細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、外源性凋亡信號通路（extrinsic apoptotic signaling pathway）、對活性氧的反應(yīng)（response to reactive oxygen species）、氧化應(yīng)激反應(yīng)（response to oxidative stress）等；細(xì)胞組成主要包括：膜筏（membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（membrane microdomain）、膜區(qū)（membrane region）、小凹（caveola）等；分子功能主要包括：細(xì)胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（DNA-binding transcription factor binding）、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合（ubiquitin-like protein ligase binding）等（見圖6）。

圖6 六君子湯與GID的GO功能分析結(jié)果圖

2.5 分子對接結(jié)果依據(jù)“藥物-成分-核心靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)中的度（degree）值，選取degree值排名靠前的5個(gè)活性成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及“通路-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)篩選核心靶點(diǎn)，本次研究選取槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚分別與STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行分子對接，結(jié)合能情況見表2。結(jié)果顯示普遍結(jié)合能小，結(jié)合活性高，結(jié)合能均小于-5 kal/mol，其中豆甾醇與核心靶點(diǎn)AKT1對接效果最好；而7-甲氧基-2-甲基異黃酮與核心靶點(diǎn)STAT3對接效果最差。分子對接過程中，選取部分可視化對接結(jié)果，見圖7。

表2 六君子湯與GID 分子對接結(jié)合能

圖7 六君子湯與GID分子對接部分可視化結(jié)果圖

3 討論

六君子湯用于治療危重癥中GID脾虛證患者，具有限制機(jī)體炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、改善腸道菌群等臨床療效[9，10]。本次分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與治療GID 相關(guān)的主要活性成分包括：槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等化合物。其中槲皮素度值最高，表明其參與并作用的靶點(diǎn)最豐富，有研究表明其在機(jī)體內(nèi)可通過調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT 和JUK 信號通路抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6 和IL-1β）釋放[11，12]；或通過激活PI3K/AKT/mTOR 通路，改善膿毒癥小鼠心肌炎癥以及氧化應(yīng)激反應(yīng)[13，14]；并可促進(jìn)糖原合成，發(fā)揮降糖作用[15]；還可調(diào)控MAPK 信號通路，促進(jìn)修復(fù)被破壞的腸道黏膜屏障，增強(qiáng)腸道免疫[16，17]，有效維護(hù)機(jī)體腸道穩(wěn)態(tài)。由此可見，中藥成分中單一化合物可通過多種途徑實(shí)現(xiàn)抗炎、抗感染、促免疫調(diào)節(jié)等作用，與槲皮素作用靶點(diǎn)多的結(jié)果相符合，同樣反映出六君子湯治療GID時(shí)作用于多靶點(diǎn)的復(fù)雜機(jī)制。具有抗炎作用的還有豆甾醇、木犀草素等成分，其中，豆甾醇通過與MAPK3等靶點(diǎn)結(jié)合參與抗炎[18]；木犀草素則通過激活SIRT1信號通路，抑制NFκB 相關(guān)炎癥反應(yīng)，改善胃腸道功能[19]。由此可推測，針對GID 相關(guān)的炎癥反應(yīng)，無論炎癥是原因還是結(jié)果，六君子湯應(yīng)用在GID的抗炎治療中具有一定的臨床指導(dǎo)意義。一方面，木犀草素和黃芩素能與CYP1A1 蛋白結(jié)合，而CYP1A1 基因的高表達(dá)能破壞機(jī)體免疫防御能力，其中黃酮類成分能抑制該蛋白活性[20]；黨參中的多糖、黃酮和皂苷等成分已被證明與改善機(jī)體免疫相關(guān)，是否與調(diào)節(jié)GID 免疫相關(guān)，其機(jī)制及療效尚不明確，但卻為后續(xù)的免疫相關(guān)研究指出了前進(jìn)方向。另一方面，木犀草素還能通過PI3KAKT、MARK 和TNF 等信號通路，調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì)表達(dá)，修復(fù)屏障，改善腸動(dòng)力[21]；同時(shí)柚皮素與川陳皮素同樣具有促進(jìn)胃腸動(dòng)力的作用[22]，表1顯示，川陳皮素的OB 和DL 均較高，說明口服給藥治療GID 可達(dá)到較好的療效。β-谷甾醇作為參與治療GID的主要活性成分，發(fā)揮著降低血脂、退熱消炎、抗氧化應(yīng)激、增強(qiáng)免疫等作用[23，24]。六君子湯在這些化學(xué)成分的共同作用下，通過調(diào)節(jié)不同通路實(shí)現(xiàn)治療目的，因此，其成分的探明為新藥的設(shè)計(jì)提供了新思路。

靶點(diǎn)蛋白中STAT3 是人體細(xì)胞中信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，研究表明受STAT3 調(diào)節(jié)的神經(jīng)肽，可隨STAT3 的下調(diào)，而調(diào)節(jié)胃腸激素，進(jìn)一步改善胃腸運(yùn)動(dòng)[25]。AKT1 屬于蘇氨酸蛋白激酶家族，廣泛存在于組織細(xì)胞中，參與機(jī)體細(xì)胞的增殖、生長、代謝等過程，是PI3K-AKT 通路中重要的調(diào)節(jié)分子，具有調(diào)控胃腸動(dòng)力的能力[14]。靶點(diǎn)蛋白的存在使得藥物活性成分能夠準(zhǔn)確地配對，知曉其作用位點(diǎn)，將調(diào)控信息向下游傳導(dǎo)，以達(dá)到治療疾病的效果。

KEGG 富集分析中，糖尿病并發(fā)癥通路富集了較多的核心靶點(diǎn)蛋白，同時(shí)該信號通路與腸道炎癥相關(guān)[26]；卡波西肉瘤相關(guān)病毒感染信號通路則表現(xiàn)出促炎性作用，誘導(dǎo)宿主細(xì)胞釋放過量的vIL-6、IL-6 和IL-10細(xì)胞因子，加重機(jī)體免疫反應(yīng)[27]，由此可推測這兩條信號通路可能是控制GID炎性發(fā)展的重要通路，至于藥物成分具體作用于何靶點(diǎn)及如何調(diào)節(jié)信號通路，可在未來進(jìn)行進(jìn)一步的通路分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

分子對接中，結(jié)合能越小說明兩者分子間契合度越高，結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。分子對接結(jié)果顯示，豆甾醇與AKT1結(jié)合能最小，結(jié)合活性最高，代表二者分子之間結(jié)合越緊密和穩(wěn)定，存在較強(qiáng)的相互作用。結(jié)合能最小的結(jié)果不是預(yù)想中度值排名最靠前的槲皮素和STAT3，抑或是表1 中OB、DL 較高的活性成分，說明分子對接的結(jié)果是否良好與上述三個(gè)因素相關(guān)性不大，而是可能與活性成分分子結(jié)構(gòu)、靶標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)及分子間作用力相關(guān)。由表2可知AKT1與各藥物活性成分結(jié)合能普遍較低，因此可推測六君子湯治療GID時(shí)主要在改善胃腸動(dòng)力方面的作用較穩(wěn)定。

綜上所述，六君子湯可能是通過槲皮素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等有效成分，作用于STAT3、TP53、MAPK3、AKT1、MAPK1 等靶點(diǎn)，參與糖尿病并發(fā)癥通路、卡波西肉瘤相關(guān)病毒感染等信號通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮改善胃腸動(dòng)力、抗炎、增強(qiáng)免疫、修復(fù)腸道屏障等作用，從而改善GID 患者預(yù)后。這符合中草藥經(jīng)多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同治療疾病的特點(diǎn)。本研究的不足之處在于數(shù)據(jù)挖掘不夠全面，分子對接屬虛擬驗(yàn)證層面，藥理作用機(jī)制有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行驗(yàn)證。