薛蓮 劇猛 黃毅 趙國連 張語豪 王思翰 雷穎 黨麗云 左蕾

結(jié)核病仍然是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的主要傳染病之一,殺滅結(jié)核分枝桿菌是預(yù)防及控制結(jié)核病的重要內(nèi)容之一[1-2]。結(jié)核分枝桿菌生命力頑強,且不易被控制[3],特別是發(fā)生在肺部及皮下組織內(nèi)的局限性結(jié)核病灶不易治療,隨著耐藥結(jié)核病的傳播,此類局限性結(jié)核病灶的治療尤為困難[4]。有研究報道,采用抗結(jié)核藥物配合局部消融治療具有一定的效果[5-6],但僅局限于微波、射頻及激光等消融方法,而低溫等離子消融技術(shù)相較于其他消融方法具有低溫、反應(yīng)輕、療程短及無明顯疼痛等優(yōu)點,目前已應(yīng)用于咽喉部疾病及椎間盤突出等疾病的治療[7-10]。但低溫等離子技術(shù)對于不同結(jié)核分枝桿菌是否具有殺滅作用、殺滅所需時間及殺滅效果等鮮有報道。本研究通過體外實驗探討低溫等離子技術(shù)對不同耐藥類型結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果,旨在為結(jié)核分枝桿菌的殺滅提供新的技術(shù)方法。

材料和方法

一、實驗材料

1.菌株:結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(H37Rv;來源于中國疾病預(yù)防控制中心室間質(zhì)評下發(fā)菌株)、廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌(extensive drug-resistantMycobacteriumtuberculosis,XDR-MTB)菌株、耐多藥結(jié)核分枝桿菌(multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosis,MDR-MTB)菌株。XDR-MTB與MDR-MTB菌株來源于臨床患者,采用中和基因法由BACTEC MGIT 960系統(tǒng)(美國BD公司)進(jìn)行分枝桿菌液體培養(yǎng),再用膠體金標(biāo)記的MPB64蛋白(杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司)單克隆抗體試劑進(jìn)行抗原檢測為MTB復(fù)合群,使用微孔板MIC法進(jìn)行藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)最終確定。

2.試劑:分枝桿菌培養(yǎng)液(美國BD公司)、分枝桿菌營養(yǎng)添加劑(美國BD公司)、羅氏固體培養(yǎng)基(珠海市銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司)。

3.儀器:PLA-600等離子體手術(shù)系統(tǒng)及MC247等離子刀頭(直徑0.9 mm/長度20 cm;成都美創(chuàng)電子科技有限公司);5 ml無菌試管;10 μl接種環(huán)(型號:65-0010,美國Biologix公司);PhoenixSpec比濁儀(美國BD公司);微生物培養(yǎng)箱(型號:SPX-250C;常州中誠儀器制造有限公司);生物安全柜(型號:BSC-1500∥A2-X,中國Biobase公司)。

二、研究方法

1.菌懸液的制備:取多個羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)3周以內(nèi)的H37Rv、XDR-MTB(臨床分離株)、MDR-MTB(臨床分離株)新鮮菌落,經(jīng)超聲分散儀分散后配置0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?后倍比稀釋為3×104菌落形成單位(colony forming units,CFU)/ml試驗用菌懸液備用。

2.等離子體手術(shù)系統(tǒng)調(diào)節(jié):將低溫等離子系統(tǒng)檔位調(diào)節(jié)至9檔(平均功率9 W),安裝等離子刀頭,采用PLACOAG(止血、凝固)模式,此模式平均輸出功率范圍為0～350 W,其通過100 kHz的射頻電場,激發(fā)電解液在電極周圍形成含大量帶電粒子的等離子體薄層,產(chǎn)生能量打開靶組織細(xì)胞的分子鍵。

3.試劑分組:將實驗用菌懸液分為6組,1個對照組和5個實驗組,為減少實驗誤差,每組設(shè)計2份平行樣本,實際試驗樣本量為對照組2份樣本量,實驗組10份樣本量。

4.低溫等離子實驗方法:于生物潔凈安全柜內(nèi),分別取2.0 ml 3×104CFU/ml菌懸液樣品置于無菌試管中,調(diào)節(jié)等離子刀頭約距離試管底部10 mm后對其進(jìn)行處理。將刀頭垂直放入裝有菌懸液的5組實驗組試管中央,作用時間分別為3、6、9、12、15 s,每次刀頭在試管內(nèi)作用后,均經(jīng)過含有75%酒精的無菌紗布擦拭充分滅菌。為防止氣溶膠的產(chǎn)生,實驗開機(jī)前需于試管口等離子刀頭旁使用棉球防止氣溶膠逸散。

5.菌落培養(yǎng):低溫等離子實驗完畢后,即將實驗組及對照組試驗用菌懸液吸取10 μl接種于羅氏培養(yǎng)基上,置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)21 d后計算菌落數(shù)。各時間點重復(fù)上述操作等離子體處理,處理后取樣測定菌落數(shù)量。

三、觀察指標(biāo)

分別計算上述3種結(jié)核分枝桿菌菌懸液在低溫等離子不同作用時間點的菌落數(shù),分別計算并比較3組結(jié)核分枝桿菌菌懸液在不同作用時間點的各組殺菌對數(shù)值及殺菌率。殺菌對數(shù)值=對照組平均活菌量對數(shù)值―實驗組平均活菌量對數(shù)值;殺菌率=(對照組平均活菌量―實驗組平均活菌量)/對照組平均活菌量×100%。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

一、3種菌株行低溫等離子不同作用時間的殺菌對數(shù)值比較

H37Rv菌株(F=20.313,P=0.003)、XDR-MTB菌株(F=13.956,P=0.006)及MDR-MTB菌株(F=20.355,P=0.006)不同作用時間殺菌對數(shù)值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;3種菌株均于作用15 s時殺菌對數(shù)值達(dá)到最大值。3種菌株在作用9 s時殺菌對數(shù)值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=61.603,P=0.004),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;在作用12 s及15 s時3種菌株比較殺菌對數(shù)值差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.383,P=0.375;F=8.301,P=0.060)。見表1。

表1 3種不同結(jié)核分枝桿菌行低溫等離子消融不同處理時間的殺菌對數(shù)值比較

二、3種菌株行低溫等離子不同作用時間的殺菌率比較

H37Rv菌株(F=10.458,P=0.012)、XDR-MTB菌株(F=10.945,P=0.011)及MDR-MTB菌株(F=9.424,P=0.015)不同作用時間殺菌率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義;3種菌株均于作用15 s時殺菌率達(dá)到最大值。3種菌株在作用9 s時殺菌率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=287.890,P<0.001),其中XDR-MTB菌株最低,H37Rv菌株居中,MDR-MTB菌株最高;3種菌株于作用12 s和15 s比較,殺菌率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.264,P=0.400;F=0.805,P=0.525)。見表2,圖1。

注 XDR-MTB:廣泛耐藥結(jié)核分枝桿菌;MDR-MTB:耐多藥結(jié)核分枝桿菌

表2 3種不同結(jié)核分枝桿菌行低溫等離子消融不同處理時間的殺菌率比較

討 論

由于結(jié)核分枝桿菌特有的細(xì)胞壁成分,其生命力持久,不易被消滅[11],發(fā)生在肺部及皮下組織內(nèi)局限結(jié)核病灶的治療尤為困難?；瘜W(xué)消毒劑對皮膚黏膜具有強烈的刺激性,不宜用于臨床治療[12];而藥物配合局部微波或射頻消融治療具有一定療效,但消融區(qū)產(chǎn)生的局部高溫具有明顯灼熱疼痛感[13-14]。因此,尋找一種有效、無明顯疼痛的治療方法已成為臨床研究的重要方向。

本研究通過體外實驗證實了低溫等離子技術(shù)對H37Rv、XDR-MTB及MDR-MTB均具有快速且明顯的滅活效果。H37Rv、MDR-MTB從作用3 s時菌落數(shù)均明顯減少,在作用15 s時殺菌率可分別達(dá)到99.26%和100.00%。而XDR-MTB于作用9 s時菌落數(shù)明顯減少,與H37Rv、MDR-MTB菌組比較,XDR-MTB殺菌率在作用12 s、15 s時明顯升高,在作用12 s以后差異無統(tǒng)計學(xué)意義,在作用15 s可達(dá)到96.35%,意味著對于XDR-MTB,需要更長的作用時間方能提高殺菌率。

結(jié)核分枝桿菌對高溫具有一定的耐受力[15],且微波和射頻等熱消融會引起患者不同程度的疼痛感[16-17],冷凍消融最低溫度為―196 ℃,單個循環(huán)時間為5～15 min[18],患者會出現(xiàn)冷休克風(fēng)險。低溫等離子消融是將射頻刀頭與組織之間的電解液轉(zhuǎn)化成50～100 μm厚度的等離子薄層,強大的電場使等離子薄層中的帶電粒子獲得足夠動能,從而打斷靶組織分子鍵,使靶組織細(xì)胞裂解、萎縮、破壞,繼而脫落[7-10],其單個循環(huán)持續(xù)時間一般為15 s,并可將溫度精確控制在40～70 ℃,其熱損傷深度為0.5 mm,對正常鄰近組織的創(chuàng)傷很小[10],因此更適用于鄰近重要組織臟器、血管、神經(jīng)及位于淺表的病灶,患者的治療時間短,疼痛感輕,且不易發(fā)生皮膚灼傷。本研究通過體外實驗表明,低溫等離子消融技術(shù)對上述3種結(jié)核分枝桿菌僅需要15 s就能達(dá)到顯著的殺滅效果,通常情況下結(jié)核分枝桿菌對高溫具有一定的耐受能力,在62～63 ℃高溫需持續(xù)15 min,或100 ℃需要5 min才能殺滅[19]。因此,考慮低溫等離子消融對結(jié)核分枝桿菌的殺滅作用為高速運動的離子動能打斷靶組織的分子鍵,從而快速引起病菌結(jié)構(gòu)的破壞和損傷,達(dá)到殺滅病菌的目的,而非完全依賴于溫度的改變,其具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究。

本研究結(jié)果表明,低溫等離子技術(shù)對3種常見結(jié)核分枝桿菌均具有快速且有效的殺滅作用,并且隨著作用時間的延長,其殺菌率也逐漸升高,且3種不同結(jié)核分枝桿菌的殺滅效果在不同作用時間有所不同,因此需要制定個體化的策略。

本研究存在一定局限性,本次研究僅是通過體外試驗證實了低溫等離子技術(shù)對3種類型結(jié)核分枝桿菌具有快速、明顯的殺滅效果,但還缺乏相應(yīng)的殺菌原理的實驗驗證,其他的影響因素,以及其在在體實驗是否具有相同的殺滅效果等。因此,下一步將考慮行局部結(jié)核分枝桿菌感染性病灶的低溫等離子在體動物實驗,探討其治療效果、影響因素及治療機(jī)制,以期為結(jié)核性病變的臨床研究及治療提供一種新的技術(shù)方法。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)薛蓮和劇猛:醞釀和實驗設(shè)計、實施研究、采集數(shù)據(jù)、起草文章、支持性貢獻(xiàn);趙國連、張語豪、王思翰和雷穎:采集數(shù)據(jù)、實施研究、協(xié)助整理數(shù)據(jù);黃毅、黨麗云和左蕾:醞釀和實驗設(shè)計、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)或材料支持、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作評價性審閱、指導(dǎo)、支持性貢獻(xiàn)