葛菲 朱慧 程凱 陸宇 徐建

異煙肼通過抑制細菌細胞壁的合成,能有效地阻止結(jié)核分枝桿菌的生長和繁殖,作為一線抗結(jié)核藥品被廣泛應用于結(jié)核病的治療。異煙肼的代謝被認為與異煙肼介導的肝損傷相關(guān)。異煙肼通過氧化代謝途徑產(chǎn)生的乙酰肼和肼為其主要的毒性代謝物,它們較母藥更易造成肝損傷,其體內(nèi)暴露量與肝損傷明顯相關(guān)[1]。因此,對異煙肼及其代謝物乙酰肼和肼進行血藥濃度監(jiān)測,有助于實施臨床個體化給藥,減少藥物不良反應的發(fā)生。

目前,檢測肼類化合物的方法主要有氣相色譜法[2]、高效液相色譜法(HPLC)[3]、氣相色譜-質(zhì)譜法[4]和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS/MS)[5-8]。臨床應用中,常用于檢測異煙肼血藥濃度的方法主要是HPLC[9-10]。相較于其他方法,HPLC-MS/MS在靶向定量分析領(lǐng)域具有高敏感度、高選擇性、寬線性范圍、高準確性和重現(xiàn)性等顯著優(yōu)勢。依托質(zhì)譜技術(shù),HPLC-MS/MS能夠準確識別目標化合物并進行定量分析,適用于復雜樣品的分析,并拓寬了儀器分析范圍,為臨床治療藥物監(jiān)測提供了可靠的數(shù)據(jù)支持,被廣泛應用于藥物代謝動力學、生物樣品分析等領(lǐng)域[11-14]。但已報道的方法存在前處理流程復雜、不能實現(xiàn)異煙肼及其代謝物同時檢測等問題。因此,仍需要探索更簡單靈敏的方法,可以同時測定人體血漿中的異煙肼及其代謝物乙酰肼和肼。本研究基于HPLC-MS/MS技術(shù),以異煙肼-D4作為同位素標記內(nèi)標,建立了快速、靈敏,可同時檢測血漿中異煙肼及其代謝物乙酰肼、肼濃度的分析方法,并對校準曲線、線性范圍、準確度、精密度、回收率、基質(zhì)效應、穩(wěn)定性進行了方法驗證;同時,應用該方法對臨床104例肺結(jié)核患者進行了異煙肼及其代謝物的治療藥物監(jiān)測,以期為臨床用藥提供指導。

材料和方法

一、材料

1.儀器:UltraLC 110 液相串聯(lián)API 4000 Q-trap 型液-質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)(美國AB Sciex公司);電子分析天平(德國賽多利斯公司,BS110S);漩渦混合器(上海清甫儀器有限公司,SHA-C型);高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司FRESCO21型離心機);超聲波水浴清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)。

2.試劑:異煙肼(美國Sigma公司,批號:MKBW9046V);乙酰肼[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號:P8GWL-NT];肼(美國Sigma公司,批號:MKBV0553V);異煙肼-D4(南京昊綠生物科技有限公司,批號:YYJ0434314TR-HLM);色譜純甲醇(美國賽默飛世爾科技公司,批號:204132);色譜純乙腈(美國賽默飛世爾科技公司,批號:F21LA7202);對甲基苯甲醛(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C10298201);甲酸(北京迪科馬科技有限公司,批號:2142969);甲酸銨(美國Honeywell公司,批號:I2740);乙酸(上海吉至生化科技有限公司,批號:A331384C9)。

3.樣品來源:患者來源于首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院,年齡范圍18～60歲,確診肺結(jié)核,并接受規(guī)范抗結(jié)核治療。服用異煙肼的劑量為1次/d,每次300～500 mg,于服藥后2 h采集靜脈血4 ml,4 ℃ 條件下,3000×g離心10 min,取上層血漿放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。共收?04例肺結(jié)核患者的血漿樣本。本研究得到了首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會的批準(批準號:YJS-2022-16號),所有受試者在試驗前均簽署了知情同意書。

二、方法

1.色譜條件:采用InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z色譜柱(100 mm×2.1 mm,2.7 μm);柱溫

為30 ℃;自動進樣器溫度為4 ℃;流動相A為含0.1%甲酸和5 mmol甲酸銨的水溶液,流動相B為乙腈;梯度洗脫:0～2 min,95% A;2～3 min,95% A～5% A;3～5.5 min,5% A;5.5～6.5 min,5% A～95% A;6.5～8 min,95% A;運行時間8 min;進樣量5 μl;流速0.4 ml/min。

2.質(zhì)譜條件:質(zhì)譜采用電噴霧離子源(ESI),以多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式掃描,正離子模式檢測。電噴霧電壓:5500 V;離子源溫度:500 ℃;入口電壓、出口電壓分別設(shè)置為10 V、10 V;氣簾氣(CUR):30 psi;霧化氣(GS1):50 psi;加熱氣(GS2):50 psi。待測物及內(nèi)標異煙肼-D4衍生物的MRM參數(shù)見表1。

表1 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法的多反應監(jiān)測參數(shù)設(shè)置

3.溶液配制:(1)精密稱取異煙肼、乙酰肼、肼的對照品適量,用甲醇分別配制成濃度均為1 mg/ml的單一成分標準品儲備液,-80 ℃避光保存。(2)精密量取異煙肼-D4溶液100 μl于25 ml量瓶中,用甲醇定容,即得質(zhì)量濃度為100 ng/ml的內(nèi)標工作溶液。(3)精密量取對甲基苯甲醛2 ml于100 ml量瓶中,加入9.8 ml乙酸,用甲醇定容,即得質(zhì)量濃度為20 μg/ml的對甲基苯甲醛溶液。

4.標準溶液配制:以甲醇稀釋待測物儲備液,配制系列濃度的線性混標工作溶液,混標工作溶液Line 1～Line 8中各待測物濃度分別為:(1)異煙肼:1、2、5、10、20、60、100、120 μg/ml;(2)乙酰肼:0.5、1、2.5、5、10、30、50、60 μg/ml;(3)肼:20、40、100、200、400、1200、2000、2400 ng/ml。

取空白血漿95 μl,加入5 μl混標工作液Line 1～Line 8,各待測物在血漿中分別為:(1)異煙肼:50、100、250、500、1000、3000、5000、6000 ng/ml;(2)乙酰肼:25、50、125、250、500、1500、2500、3000 ng/ml;(3)肼:1、2、5、10、20、60、100、120 ng/ml。

5.質(zhì)控樣本工作液配制:各待測物濃度分別為:(1)異煙肼:1、3、50、90 μg/ml;(2)乙酰肼:0.5、1.5、25、45 μg/ml;(3)肼:20、60、1000、1800 ng/ml。

取空白血漿95 μl,加入5 μl混標工作液,各待測物在血漿中濃度分別為:(1)異煙肼:50、150、2500、4500 ng/ml;(2)乙酰肼:25、75、1250、2250 ng/ml;(3)肼:1、3、50、90 ng/ml。

6.血漿樣品處理:將待分析的血漿樣品在室溫下解凍,解凍完全后使用渦旋混合器將樣品充分混勻。取100 μl血漿加入350 μl甲醇,50 μl內(nèi)標異煙肼-D4儲備液(100 ng/ml),渦旋混勻后,12 000×g離心10 min,取上清100 μl加入300 μl衍生化試劑對甲基苯甲醛溶液,充分混勻后室溫超聲反應40 min,取200 μl置于進樣瓶中,上機進樣分析。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、方法建立及驗證

1.專屬性考察:通過對比空白血漿基質(zhì)、空白血漿基質(zhì)+待測物混合對照品工作溶液(定量限濃度)+內(nèi)標和臨床患者血漿+內(nèi)標的MRM色譜圖,判斷體內(nèi)存在的其他內(nèi)源性物質(zhì)是否影響待測物的濃度測定,考察HPLC-MS/MS分析方法的專屬性。結(jié)果顯示,在本實驗確定的檢測條件下,樣品中的內(nèi)源性物質(zhì)不影響待測物及內(nèi)標的分離測定,且待測物與內(nèi)標峰形良好。待測物與內(nèi)標的MRM色譜圖見圖1。

注 圖A:空白血漿;圖B:空白血漿+待測物混合對照品工作溶液(定量限濃度)+內(nèi)標;圖C:臨床患者血漿+內(nèi)標;MRM:多反應監(jiān)測

2.線性范圍考察:配制每個濃度的標準曲線樣品,進行處理后,進樣分析,記錄色譜圖、待測物的峰面積(As)及內(nèi)標的峰面積(Ai)。以濃度(C)為橫坐標,待測物與內(nèi)標峰面積的比值(As/Ai)為縱坐標作回歸方程,權(quán)重系數(shù)為1/X2,結(jié)果如表2所示。異煙肼在線性范圍50～6000 ng/ml內(nèi)線性良好,乙酰肼在線性范圍25～3000 ng/ml內(nèi)線性良好,肼在線性范圍1～120 ng/ml內(nèi)線性良好,決定系數(shù)(R2)均>0.99。

表2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定異煙肼、乙酰肼和肼的線性范圍、決定系數(shù)和定量限

3.殘留:制備異煙肼、乙酰肼、肼定量上限(ULOQ)樣品,質(zhì)量濃度分別為4500、2250、90 ng/ml。在每條標準曲線ULOQ樣品后立即進行空白樣品分析,考察高濃度樣品殘留對測定的影響從而計算殘留效應。結(jié)果表明,空白樣品中異煙肼、乙酰肼、肼的信號響應強度分別不超過定量下限(LLOQ)的0.12%、1.33%和2.06%,異煙肼-D4的信號響應強度不超過LLOQ的0.06%。

4.準確度與精密度:制備4個濃度的標準血漿樣品溶液各6份,進行HPLC-MS/MS分析,考察分析方法的批內(nèi)精密度和準確度。在不同時間連續(xù)制備并測定3個分析批次,考察方法的批間精密度和準確度。精密度用質(zhì)控樣品的批內(nèi)和批間相對標準差(relative standard deviation,RSD)表示,準確度用相對誤差(relative error,RE)表示。結(jié)果顯示,異煙肼、乙酰肼、肼的批內(nèi)和批間精密度RSD均≤11.76%,準確度RE絕對值均≤6.43%,符合生物樣品檢測的限度要求(精密度RSD<15%,準確度RE絕對值<15%)。具體見表3。

表3 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定化合物的準確度和精密度結(jié)果

5.回收率和基質(zhì)效應:取空白血漿100 μl,處理操作后得到空白基質(zhì),加入混合對照品工作溶液5 μl,制備未經(jīng)提取的低、中、高3個濃度的對照樣品各6份,制備供試溶液,記錄各待測物峰面積(At);取空白血漿95 μl,加入混合對照品工作溶液5 μl,配制成低、中、高濃度的標準血漿樣品各6份,進行前處理,記錄各待測物峰面積(AS);用起始比例流動相代替空白血漿,同上述方法制備相應濃度的溶液各6份,記錄各待測物峰面積(AB)。

按As/At×100%計算提取回收率。結(jié)果顯示,異煙肼、乙酰肼、肼的提取回收率均≥85.72%,RSD均≤6.02%(表4),符合生物樣本測定要求。按At/AB×100%分別計算待測物和內(nèi)標的基質(zhì)效應。內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應=待測物基質(zhì)效應/內(nèi)標基質(zhì)效應×100%。結(jié)果顯示,異煙肼、乙酰肼、肼的內(nèi)標歸一化基質(zhì)效應為86.05%～111.96%,RSD均≤9.18%(表5),符合生物樣本測定要求(基質(zhì)效應在85%～115%,RSD<15%)。

表4 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定化合物的提取回收率

表5 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定化合物的基質(zhì)效應結(jié)果

6.穩(wěn)定性:取空白血漿配制低、中、高質(zhì)控樣品各3份,分別考察含藥血漿樣品室溫放置24 h、4 ℃冷藏24 h、-80 ℃凍存7 d、-80 ℃凍存14 d、反復凍融3次的穩(wěn)定性及血漿樣品處理后在進樣倉放置24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果表明,待測物在各種條件下放置后,濃度無明顯變化,說明在上述條件下穩(wěn)定性良好(表6)。

表6 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定化合物濃度的穩(wěn)定性

二、臨床應用

用上述方法檢測104例肺結(jié)核患者血漿中異煙肼及其代謝物。根據(jù)隨行標準曲線計算樣本中待測物的濃度。異煙肼的濃度范圍為359.41～5866.71 ng/ml,乙酰肼的濃度范圍為667.11～2997.79 ng/ml,肼的濃度范圍為4.38～112.66 ng/ml(表7)。

表7 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測臨床血漿樣本中異煙肼、乙酰肼、肼的濃度

討 論

最近,一項病例對照研究顯示,異煙肼與藥物性肝損傷之間存在明確關(guān)聯(lián),這再次強調(diào)了在異煙肼治療期間進行治療藥物監(jiān)測的必要性[15]。事實上,近年來異煙肼誘導肝毒性的潛在機制受到廣泛關(guān)注。越來越多的證據(jù)表明,其毒性代謝物的形成觸發(fā)肝毒性和肝細胞凋亡[16-17]。本研究開發(fā)并驗證了一種新的HPLC-MS/MS方法,用于同時定量人血漿中的異煙肼及其毒性代謝物乙酰肼和肼,并成功應用于臨床,這將為異煙肼的藥物警戒提供支持。

目前已有關(guān)于采用HPLC-MS/MS檢測異煙肼的研究報道,這進一步證實了該方法在臨床應用中分析異煙肼的有效性和可行性[18-20]。文獻中對異煙肼的檢測往往與其他抗結(jié)核藥物同時進行,而同時檢測異煙肼的代謝物并未受到足夠關(guān)注。既往研究中在檢測異煙肼血藥濃度的同時也同時檢測了代謝物乙酰異煙肼,但未檢測其毒性代謝物乙酰肼和肼的血藥濃度[18-19]。Gao等[20]研究中,建立了4種一線抗結(jié)核藥物同時檢測的方法,但異煙肼的定量范圍較窄,而臨床中所用劑量不同和個體差異會導致藥物濃度范圍更寬。

本研究建立的HPLC-MS/MS法具有以下優(yōu)勢:(1)本方法不僅可以檢測異煙肼,還能同時分析與藥物性肝損傷有關(guān)的代謝物乙酰肼和肼,為異煙肼的治療藥物監(jiān)測提供了更全面的支持。(2)本方法采用同位素內(nèi)標具有出色的分辨率和高度準確的檢測能力,能夠有效地分離和鑒定異煙肼及其代謝物,從而確保結(jié)果的準確性和可靠性。(3)本方法能夠在更寬的濃度范圍內(nèi)檢測異煙肼及其代謝物,提高了方法的適用性和可靠性。

由于乙酰肼和肼的弱保留性,通常很難通過HPLC-MS/MS直接檢測,故采用衍生化法對乙酰肼和肼進行前處理后進行分析,以提高檢測性能。文獻中報道的異煙肼及其代謝物的血藥濃度測定方法將異煙肼與乙酰肼和肼分開檢測,采用不同的前處理方法和分析方法,這大大增加了前處理及分析的流程和時間[8]。本研究將異煙肼、乙酰肼和肼同時進行衍生化,成功實現(xiàn)了異煙肼及其代謝物乙酰肼和肼在同一前處理條件下的同時測定。

本研究選擇對甲基苯甲醛為衍生化試劑,對待測物進行衍生化,并對衍生化條件進行了摸索和優(yōu)化;選擇室溫超聲作為反應條件,考察了不同反應時間(10、20、30、40、50 min)對信號響應的影響,選擇最佳反應時間為40 min。針對待測物經(jīng)對甲基苯甲醛衍生化后,在HPLC-MS/MS分析時存在衍生反應還未到反應終點問題,影響了定量結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性的問題,本研究采取加大衍生化試劑對甲基苯甲醛的用量,并于衍生化反應體系中加入適量乙酸,使反應進行完全。在反應過程中引入超聲波以提高分子碰撞的概率,從而提高反應產(chǎn)率。與加熱衍生化方法相比,超聲水浴可以獲得微米和納米級的聚集體,縮短反應時間,提高反應效率[21]。通過使用超聲波,本研究的樣品預處理流程簡單,無需額外的加熱和純化程序。

此外,同位素內(nèi)標與目標分析物具有相似的理化性質(zhì),能夠顯著減少待測樣品的基質(zhì)效應等因素對測定結(jié)果的影響,從而提高回收率和方法的穩(wěn)定性,還可以校正預處理引入的偏差和進樣系統(tǒng)中的誤差導致的數(shù)據(jù)偏離[22]。文獻中異煙肼代謝物的血藥濃度測定普遍采用外標法[7]及惰性內(nèi)標法[8]進行定量,這些方法均有一定的局限性。本研究選用異煙肼同位素標記物異煙肼-D4對異煙肼、乙酰肼、肼進行內(nèi)標法定量,實驗結(jié)果表明,以異煙肼-D4作為內(nèi)標,基質(zhì)對檢測結(jié)果的影響較小,提取回收率均>85%,且具有較高的準確度和重現(xiàn)性。

異煙肼是目前廣泛應用于結(jié)核病治療的抗結(jié)核藥物之一。然而,其代謝物存在潛在的肝毒性,這一點在臨床應用中需要引起高度重視。本研究檢測了異煙肼給藥后2 h臨床血漿樣本中異煙肼及其代謝物乙酰肼和肼的濃度水平,結(jié)果顯示,患者體內(nèi)的異煙肼和代謝物乙酰肼和肼的濃度存在較大的個體間差異。Song等[7]檢測了異煙肼末次給藥24 h后患者體內(nèi)異煙肼及肼的濃度,結(jié)果表明,長期服用異煙肼后,患者體內(nèi)殘留有乙酰肼和肼。而乙酰肼和肼的殘留量在不同患者中差異較大。因此,需要對臨床服用異煙肼的患者進行血藥濃度監(jiān)測,對于血藥濃度明顯增高的患者,需要密切關(guān)注其藥物不良反應情況;而對于血藥濃度偏低的患者,建議醫(yī)生調(diào)整給藥劑量。臨床應結(jié)合患者的個體特征和治療目標,從療效和肝毒性兩方面考慮,制訂最佳的個體化給藥方案,適當調(diào)整異煙肼劑量,以達到最佳的治療效果。

對于服用標準劑量異煙肼的患者,異煙肼的推薦峰值濃度(Cmax)為3～6 mg/L[23-24],若Cmax<2 mg/L,可增加異煙肼劑量,若Cmax>6 mg/L,則提示可能會有肝損傷風險,應密切關(guān)注肝功能情況。在本研究中,組內(nèi)各檢測指標數(shù)值差異較大,目前尚無確定的代謝物正常值參考范圍。同時,關(guān)于什么濃度可以提示對肝臟有損傷及是否停藥的指導作用的問題,需要更多的臨床數(shù)據(jù)和病例支持才能做出準確的結(jié)論。由于筆者目前缺乏肝損傷患者的病例數(shù)據(jù),尚無法得出明確的結(jié)論,因此,會在接下來的研究中收集相關(guān)數(shù)據(jù),以便更全面地分析和探討這些問題。

綜上所述,本研究建立了一種快速靈敏的HPLC-MS/MS方法,可用于測定人體內(nèi)異煙肼及其代謝物乙酰肼、肼的血藥濃度,通過對方法專屬性、標準曲線、精密度、準確度、基質(zhì)效應、回收率和穩(wěn)定性等的驗證,本研究建立的方法準確度高、專屬性強,已應用于異煙肼及其代謝產(chǎn)物的臨床監(jiān)測。該方法有助于臨床優(yōu)化異煙肼的個體化給藥,從而減少異煙肼引起的肝損傷的發(fā)生。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻葛菲:醞釀和設(shè)計實驗、實施研究、起草文章、統(tǒng)計分析;朱慧:采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導;程凱:分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、支持性貢獻;陸宇:分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、行政/技術(shù)/材料支持、指導;徐建:醞釀和設(shè)計實驗、分析/解釋數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、獲取研究經(jīng)費、行政/技術(shù)/材料支持、指導