文章編號：1674-2419（2024）02-0121-06

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（No.32270557）和遼寧省教育廳科研項目（No.LJKZ0990）資助。

作者簡介：劉秀佳（1999-" ），女，碩士研究生。主要從事魚類免疫學(xué)研究。E-mail：liuxiujia3038@163.com。

摘" 要：p21活化蛋白激酶4（p21-activated protein kinase 4， PAK4）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與調(diào)控多種信號通路，在高等脊椎動物免疫應(yīng)答中起重要作用。在低等脊椎動物日本七鰓鰻（ Lampetra japonica）中發(fā)現(xiàn)一個PAK4同源基因（Lja-PAK4），其開放閱讀框長度為2544 bp，編碼一個含有848個氨基酸的蛋白質(zhì)。該分子與高等脊椎動物PAK4序列比對一致性最高，且具有該蛋白家族保守的兩個功能結(jié)構(gòu)域。利用通過原核表達、純化的重組Lja-PAK4蛋白為抗原，成功制備了大鼠抗Lja-PAK4的多克隆抗體。用混合菌刺激七鰓鰻，采用實時熒光定量PCR和免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)， Lja-PAK4的mRNA和蛋白質(zhì)在外周血淋巴細胞和髓樣小體中均顯著性上調(diào)表達。采用B細胞絲裂原LPS和T細胞絲裂原PHA分別對七鰓鰻進行刺激后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)LPS刺激后Lja-PAK4的mRNA和蛋白質(zhì)在外周血淋巴細胞和髓樣小體中呈現(xiàn)出顯著性上調(diào)表達，而它們在鰓囊中的表達受到抑制。以上結(jié)果說明Lja-PAK4參與了LPS介導(dǎo)的七鰓鰻VLRB+淋巴細胞亞群的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：日本七鰓鰻（Lampetra japonica）；p21 活化蛋白激酶；可變淋巴受體；免疫應(yīng)答反應(yīng)

中圖分類號：Q786 文獻標(biāo)志碼：A

p21活化蛋白激酶（p21-activated protein kinases， PAKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該家族目前發(fā)現(xiàn)有2種亞型共6個成員，分別為屬于Ⅰ型的 PAK1，PAK2和PAK3以及屬于Ⅱ型的PAK4，PAK5和PAK6。PAKs有相似的結(jié)構(gòu)域，都含有N端的P21結(jié)合結(jié)構(gòu)域（P21 Binding Domain， PBD）和C末端的絲氨酸/蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域（serine/threonine kinase catalytic domain， S_TKc）。人的PAK4是Ⅱ型PAKs家族成員中最早被發(fā)現(xiàn)，也是被研究最多的成員，其在小鼠胚胎發(fā)育、抑制細胞凋亡以及促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移均起著重要作用。另外，PAK4被發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的巨噬細胞中通過RAS相關(guān)蛋白Rab8a（RAS-related protein rab-8a， Rab8a）途徑介導(dǎo)淋巴細胞激活信號分子相關(guān)蛋白（signaling lymphocytic activation molecule （SLAM）-associated protein， SAP）分泌釋放，從而在T、B淋巴細胞的免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。

作為無頜脊椎動物的代表之一，七鰓鰻是研究無脊椎動物到脊椎動物演化過程中重要的生物。與高等脊椎動物由組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）、TCR和B細胞抗原受體（B-cell receptor，BCR）構(gòu)成的適應(yīng)性免疫應(yīng)答體系不同，七鰓鰻存在著由可變淋巴細胞受體（variable lymphocyte receptor，VLR）介導(dǎo)的另一類型適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，到目前為止，在七鰓鰻中已經(jīng)鑒定出VLRA、VLRB和VLRC三種類型受體。其中，VLRA+和VLRC+淋巴細胞分別類似于有頜脊椎動物的兩個主要T細胞譜系αβ及γδT細胞，對T細胞絲裂原植植物凝血素（phytohaemagglutinin，PHA）的刺激敏感；而VLRB+淋巴細胞類似B細胞，對B細胞絲裂原脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的刺激敏感，當(dāng)VLRB+淋巴細胞激活后，可以通過增殖分化出漿細胞樣淋巴細胞，后者能夠產(chǎn)生具有特異性的多聚 VLRB抗體消滅外來病原體。

為探討PAK4在無頜類脊椎動物獨特的VLRs組成的免疫系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用，該研究通過在細胞及分子水平探索了PAK4在七鰓鰻免疫防御過程中的生物學(xué)功能，為研究PAK4在無頜類脊椎動物免疫應(yīng)答的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 實驗材料

日本七鰓鰻（L. japonica）采購于黑龍江省佳木斯市。實驗所用的化學(xué)試劑、生化試劑及分子克隆試劑盒均購于生工生物工程（上海）股份有限公司。His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物、組織裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光液購于上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司。組織凍存液和小鼠淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2" 實驗動物免疫

七鰓鰻暫養(yǎng)于恒溫水族箱適應(yīng)１周，分為不作任何處理的空白對照組和經(jīng)混合菌（由無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）和親水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）各1×107 CFU組成）、PHA和LPS處理后的免疫組。首次免疫7 d后進行加強免疫，3 d后再次加強免疫，24 h 后對七鰓鰻進行斷尾取血，分別收集外周血淋巴細胞、鰓囊和髓樣小體等免疫相關(guān)組織，凍存于－80℃超低溫冰柜中。大鼠（R.norvegicus）采購于大連醫(yī)科大學(xué)，飼養(yǎng)及實驗操作嚴格按照《遼寧師范大學(xué)實驗動物管理實施細則》的規(guī)定進行。

1.3" 同源序列對比分析

通過在線生物學(xué)網(wǎng)站NCBI，分別搜索并獲取具有代表性的不同物種的Ⅱ型PAK家族成員（PAK4、PAK5）的氨基酸序列，使用BioEdit軟件與日本七鰓鰻PAK4的序列進行多重序列比對分析。

1.4" Lja-PAK4開放閱讀框的克隆及其重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)本實驗室以往轉(zhuǎn)錄組測序所獲得的注釋序列設(shè)計出克隆Lja-PAK4開放閱讀框（open reading frame，ORF）的引物（表 1）。利用Primer 5.0軟件設(shè)計了用于截短重組表達Lja-PAK4的含有EcoR Ⅰ和Hand III限制性內(nèi)切酶的酶切位點引物（表 1）。具體基因克隆及蛋白重組表達方法參照高陽等的方法。

1.5" 大鼠抗Lja-PAK4多克隆抗體制備及其鑒定

選取8周齡大鼠進行免疫，初次免疫用250 μg抗原加500 μL完全弗氏佐劑乳化后皮下多點注射，加強免疫每次用抗原125 μg加不完全弗氏佐劑500 μL乳化后注射，每2周注射1次，共3次。抗體純化采用親和層析方法，通過免疫印跡實驗檢測大鼠抗Lja-PAK4多克隆抗體的特異性。

1.6" 實時熒光定量PCR

利用實時熒光定量PCR法 （Quantitative Real-time PCR）檢測Lja-PAK4 mRNA的相對表達情況。用RNAiso方法提取實驗所需組織的RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，內(nèi)參為七鰓鰻甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh）基因。qPCR所需引物見表1，反應(yīng)結(jié)果使用ABI 7500軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

1.7" 免疫印跡檢測

將超低溫保存的組織或細胞快速融化，在離心管中按體積比1∶1加入細胞裂解液及蛋白酶抑制劑，冰浴勻漿制備成蛋白質(zhì)樣品。蛋白質(zhì)樣品先經(jīng)過SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜（poly-vinylidene fluoride，PVDF）上。PVDF 膜用5%脫脂奶粉封閉3 h；按照1∶500的比例添加Lja-PAK4抗體，4℃過夜孵育；清洗好的膜孵育二抗（稀釋比例1∶5000）1 h；然后洗膜4次，加入顯影液進行化學(xué)發(fā)光。

1.8" 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗所得數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism5.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差（M±SD）表示，兩組數(shù)據(jù)間比較采用單因素方差分析（One way ANOVA），P＜0.05表示具有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.01表示具有極顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

2" 結(jié)果

2.1" Lja-PAK4的ORF區(qū)分子克隆

通過鑲嵌PCR方法成功克隆到完整的Lja-PAK4的ORF區(qū)序列，其ORF區(qū)全長2544 bp，共編碼848個氨基酸。將Lja-PAK4的氨基酸序列與人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）及斑馬魚（Danio rerio）的PAK4分子的序列進行了同源比對分析（圖1）。Lja-PAK4與人、小鼠及斑馬魚的PAK4的序列一致性分別為44.8%、45.0%和46.5%。而且，Lja-PAK4不僅具有Ⅱ型PAK家族分子所共有的保守結(jié)構(gòu)域PBD和S_TKc，而且具有PAK4所獨有的GID結(jié)構(gòu)域。以上結(jié)果說明，在無頜類脊椎動物七鰓鰻中也存在PAK4分子的同源基因。

2.2" 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達及抗體鑒定

通過構(gòu)建Lja-PAK4-pET-32a（+）重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至E.coli Rosetta感受態(tài)細胞中進行誘導(dǎo)表達，菌液經(jīng)電泳后在49.2kD位置出現(xiàn)了特異性條帶（圖2A），說明成功實現(xiàn)了原核表達。通過離子親和層析法，經(jīng)過咪唑的梯度洗脫，在70 mmol/L的濃度下得到了單一條帶純度的Lja-PAK4重組蛋白（圖2B）。

選取E.coli Rosett感受態(tài)細胞、未誘導(dǎo)Lja-PAK4菌液和誘導(dǎo)Lja-PAK4菌液制作蛋白樣本，用免疫印跡方法檢測了抗體的純化效果及特異性（圖2C）。實驗結(jié)果顯示與未轉(zhuǎn)化表達載體的感受態(tài)細胞菌液相比，誘導(dǎo)后的菌液在49.2 kD處有清晰的條帶且無雜帶，說明Lja-PAK4鼠源多克隆抗體特異性較高。

2.3" 多種抗原免疫刺激下，Lja-PAK4的mRNA和蛋白質(zhì)的表達譜

混合菌刺激后，在外周血淋巴細胞和髓樣小體中Lja-PAK4 mRNA的表達量分別顯著上調(diào)2倍和4倍（P＜0.01），而在鰓囊中的表達量卻顯著降低（P＜0.01）（圖3 A）；同時，Lja-PAK4蛋白質(zhì)在外周血淋巴細胞和髓樣小體中顯著性上調(diào)5.5倍和1.5倍（P＜0.01），在鰓組織中其表達量在混合菌刺激后雖有上調(diào)但其表達水平遠遠低于其他兩個組織的表達水平（圖3 B，圖3 C）。以上結(jié)果表明，Lja-PAK4主要在外周血淋巴細胞和髓樣小體中參與了日本七鰓鰻的抗菌免疫應(yīng)答反應(yīng)。

T細胞絲裂原PHA刺激七鰓鰻后，與對照組相比， Lja-PAK4 mRNA在外周血淋巴細胞和髓樣小體中的表達量顯著性升高約2.1倍（P＜0.01）和2.2倍（Plt;0.01），在鰓組織中表達水平受到抑制（圖3A）；經(jīng)PHA刺激后Lja-PAK4在外周血淋巴細胞、鰓囊和髓樣小體中均沒有出現(xiàn)顯著的差異性表達（圖3B，C）。以上結(jié)果說明，Lja-PAK4沒有參與PHA介導(dǎo)的鰓中類T淋巴細胞亞群（VLRA+和VLRC+淋巴細胞亞群）的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

然而，經(jīng)B細胞絲裂原LPS刺激后，與對照組相比，Lja-PAK4 mRNA在外周血淋巴細胞和髓樣小體中顯著性上調(diào)表達約2.2倍（P＜0.01）和1.9倍（P＜0.05）（圖3 A），并且在蛋白水平上也分別上調(diào)表達了約1.2倍（P＜0.05）和2.2倍（P＜0.05）（圖3 B，圖3 C）；而Lja-PAK4 mRNA和蛋白質(zhì)在鰓中的表達水平與用混合菌刺激的結(jié)果一樣都遠遠低于其在其他兩個組織的表達水平（圖3 B，圖3C）。這個結(jié)果說明Lja-PAK4可能參與了由LPS介導(dǎo)的七鰓鰻的VLRB+淋巴細胞亞群的免疫應(yīng)答反應(yīng)。

3" 討論

無頜脊椎動物七鰓鰻存在的另一種適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，是由富含亮氨酸的重復(fù)序列構(gòu)成的可變淋巴細胞受體VLR用于識別外來抗原。在七鰓鰻中的三個VLR基因中，VLRA和VLRC分別由在鰓部胸腺樣組織中分布的VLRA+和VLRC+類T細胞樣淋巴細胞譜系組裝及表達產(chǎn)生的；而VLRB則是在七鰓鰻幼體的腸溝螺旋瓣及成體的髓樣小體組織中分布的VLRB+類B細胞樣淋巴細胞譜系中進行組裝及表達的。該研究采用兩種水體中常見的G+菌和G-菌制作成混合抗原對健康的七鰓鰻成體進行了免疫刺激。qPCR和免疫印跡結(jié)果顯示，在混合菌免疫刺激后，外周血淋巴細胞和髓樣小體中Lja-PAK4在mRNA和蛋白水平均呈現(xiàn)出了不同程度的顯著上調(diào)表達，初步證明在七鰓鰻的抗菌免疫應(yīng)答反應(yīng)中有Lja-PAK4的參與。在高等脊椎動物中，目前PAK4只有間接證據(jù)證明可能通過參與促進巨噬細胞SAP的分泌來調(diào)控T、B細胞的相互作用。從這點上看，PAK4分子可能在無頜類脊椎動物中的生物學(xué)功能可能與其在高等脊椎動物中所發(fā)揮的作用有所不同。

為了探究Lja-PAK4究竟與哪種類淋巴細胞亞群免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)，該研究分別用T細胞絲裂原PHA與B細胞絲裂原LPS刺激七鰓鰻，在mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測Lja-PAK4的表達情況。結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后Lja-PAK4的mRNA和蛋白質(zhì)在外周血淋巴細胞和髓樣小體中均呈現(xiàn)出上調(diào)表達的趨勢，而在鰓囊中的表達受到不同程度的抑制；而在PHA刺激后，只有Lja-PAK4的mRNA在外周血淋巴細胞和髓樣小體中有上調(diào)表達，在蛋白水平均沒有檢測到差異性表達現(xiàn)象。由此證明，LPS介導(dǎo)的七鰓鰻VLRB+淋巴細胞免疫應(yīng)答反應(yīng)過程確實有Lja-PAK4的參與。該研究結(jié)果為進一步深入探索Lja-PAK4參與七鰓鰻VLRB+類淋巴細胞免疫應(yīng)答的分子機制提供了一定的線索。

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Lampetra japonica PAK4" participates in LPS-mediated immune response of VLRB＋ lymphocyte subset

LIU Xiujia1， CHAI Mengqi1，2， HAN Yinglun1， LIU Xin1

（1.Lamprey Research Center， School of Life Sciences， Liaoning Normal University， Liaoning Dalian 116029， Liaoning China; 2. Chaoyang County Mongolian Middle School， Liaoning Chaoyang 122000， Liaoning China）

Abstract：P21 activated protein kinase 4 （PAK4） is a serine/threonine protein kinase that participates in regulating multiple signaling pathways and plays an important role in the immune response of higher vertebrates. The PAK4 homologous gene was also found in the lower vertebrate Lampetra japonica. The open reading frame of the lamprey PAK4 gene （Lja-PAK4） is 2544 bp， encoding a protein containing 848 amino acids. Through homologous sequence alignment， it was found that it has the highest sequence identity with higher vertebrates PAK4s and has two conserved functional domains of PAK protein family， indicating the existence of PAK4 homolog in lampreys. A polyclonal antibody against Lja-PAK4 in rats was successfully prepared using the recombinant Lja-PAK4 protein as the antigen which was expressed and purified through prokaryotic expression. After stimulation with mixed bacteria， the mRNA and protein of Lja-PAK4 were significantly upregulated in lamprey peripheral blood lymphocytes and supraneural myeloid bodies by real-time fluorescence quantitative PCR and immunoblotting methods， respectively. After stimulation with B cell mitogen LPS and T cell mitogen PHA， it was found that the mRNA and protein of Lja-PAK4 were significantly upregulated in peripheral blood lymphocytes and supraneural myeloid bodies after LPS stimulation， while their expression in the gills was inhibited. These results indicate that Lja-PAK4 is involved in the LPS mediated immune response of the VLRB+ lymphocytes in lamprey subsets in Lampetra japonica.

Keywords：Lampetra japonica；P21 activated protein kinase；Variable lymphoid receptor；Immune response