摘 要：為驗(yàn)證醬油中食品添加劑是否符合國家標(biāo)準(zhǔn)限量要求，本文建立了高效液相色譜法測(cè)定市售醬油中安賽蜜、苯甲酸、檸檬黃、山梨酸、糖精鈉、莧菜紅、咖啡因和日落黃等8種食品添加劑的含量。結(jié)果表明，8種食品添加劑在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于等于0.999 0；平均加標(biāo)回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%；5種醬油中8種食品添加劑含量均符合國家限量要求。本方法操作簡單、反應(yīng)速度較快，且準(zhǔn)確性較高，可用于食品添加劑快速篩查。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；醬油；食品添加劑；含量測(cè)定

Application of High Performance Liquid Chromatography in the Determination of Soy Sauce Food Additives

ZHAO Qianru

（Weishan County Inspection and Testing Center， Jining 277600， China）

Abstract： In order to verify whether food additives in soy sauce meet the national standard limit requirements， a HPLC method was established to determine the contents of 8 food additives in soy sauce， such as acesulfame， benzoic acid， lemon yellow， sorbic acid， saccharin sodium， amaranth red， caffeine and sunset yellow. The results showed that the 8 food additives had good linear relationships in their linear ranges， and the correlation coefficients were all greater than or equal to 0.999 0; the average recoveries were 93.58%～98.27%， RSD＜2%; the contents of 8 food additives in 5 kinds of soy sauce all meet the national limit requirements. This method has the advantages of simple operation， fast reaction speed and high accuracy， and can be used for rapid screening of food additives.

Keywords： high performance liquid chromatography; soy sauce; food additives; content determination

醬油也叫豉油，是由小麥、大豆、食用鹽等原料經(jīng)過發(fā)酵等工序制作而成的一種調(diào)味品，因其獨(dú)特的風(fēng)味、色澤以及豐富的營養(yǎng)價(jià)值，已成為人們飲食制作中極為重要的調(diào)味品之一。醬油以咸味為主，有提香、提鮮等作用，成分比較復(fù)雜，包括食用鹽、氨基酸、糖類和各種有機(jī)酸類、色素等，用以改變菜肴色澤、提升菜肴味道[1-2]。

近些年，由于人們對(duì)食品安全問題關(guān)注度的提升，食品中添加劑的使用也已經(jīng)成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中針對(duì)食品添加劑的使用種類、條件等進(jìn)行了明確規(guī)定，且為保證人們的身體健康，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各種食品添加劑的最大允許使用量也進(jìn)行確切要求，一旦食品添加劑含量超過國家標(biāo)準(zhǔn)要求，則很有可能引發(fā)食品安全問題。例如，苯甲酸防腐劑有抑制細(xì)菌、真菌和霉菌生長等作用，但當(dāng)其含量超標(biāo)時(shí)，會(huì)影響人體對(duì)維生素、鈣的吸收，并引發(fā)腎功能異常、肝臟代謝功能紊亂等，對(duì)人體骨骼生長產(chǎn)生不良影響。

目前，常采用氣相色譜法、液相色譜法、紫外-可見分光光度法、液相色譜-質(zhì)譜法以及氣質(zhì)聯(lián)用法等進(jìn)行食品添加劑測(cè)定，其中高效液相色譜法不僅操作簡單方便，還具有分析速度快、質(zhì)譜靈敏度較高、分離效率較高等優(yōu)點(diǎn)[3-4]。鑒于此，本文通過建立高效液相色譜法，對(duì)醬油中8種食品添加劑含量進(jìn)行測(cè)定，旨在保證市場醬油食品安全和品質(zhì)提供技術(shù)保障和支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙醇（色譜純，美國Fisher公司）；乙酸銨、山梨酸和苯甲酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；安賽蜜、苯甲酸、檸檬黃、山梨酸、糖精鈉、莧菜紅、咖啡因和日落黃（上海源葉生物科技有限公司）；市售5種醬油；實(shí)驗(yàn)室自制超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

1100 series高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；5510OE-DTH超聲波清洗儀（上海必能信超聲有限公司）；3-18KS高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；TE612-L電子天平（賽多利斯公司，感量0.01 g）；TU-1810PC紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技發(fā)展有限公司）；PALL Cascada LS型超純水系統(tǒng)（美國PALL公司）；PHS-3C精密pH計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；CW-2000超聲波協(xié)同萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 配制標(biāo)準(zhǔn)溶液

分別稱取10 mg苯甲酸、落日黃和山梨酸，20 mg莧菜紅、安賽蜜和咖啡因，100 mg糖精鈉，60 mg檸檬黃，經(jīng)超純水溶解后，定容至100 mL容量瓶，于4 ℃環(huán)境貯存?zhèn)溆?，配制質(zhì)量濃度為1 000 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各40 μL。

分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成20.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1和1.25 μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液，于4 ℃環(huán)境貯存?zhèn)溆?。根?jù)譜圖中的保留時(shí)間對(duì)其進(jìn)行定性分析，通過峰面積對(duì)其進(jìn)行定量分析，每個(gè)稀釋梯度各測(cè)定3次，取平均值，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品前處理

分別取各醬油樣品2 mL，將其添加到10 mL容量瓶內(nèi)，使用95%乙醇進(jìn)行定容，搖勻后靜置10 min，將各樣品醬油中的添加劑進(jìn)行振蕩提取10 min、超聲提取10 min，使用濾紙過濾。各取5 mL過濾液，放置于10 mL容量瓶內(nèi)，向其中加入超純水進(jìn)行稀釋定容，使用0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾，留存待測(cè)。

1.3.3 儀器條件

色譜柱：Diamon?sil Plus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1，pH=7.0）；檢測(cè)波長：230 nm；梯度洗脫，洗脫程序見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 波長確定

根據(jù)HPLC檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HPLC紫外檢測(cè)波長為230 nm時(shí)，8種食品添加劑出峰效果理想，且能夠完全分離；波長為220 nm、250 nm時(shí)，苯甲酸、糖精鈉和安賽蜜有重疊情況，分離度比較差，故本文選擇230 nm作為檢測(cè)波長。

2.1.2 確定色譜柱和柱溫

為驗(yàn)證最佳色譜條件，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、ZORBAX Extend-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）、ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）和HC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），進(jìn)樣量均為5 μL，配備紫外檢測(cè)器，分別進(jìn)行HPLC測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用Diamonsil PIus-C18柱時(shí)，8種食品添加劑可呈對(duì)稱峰型，能夠完全分離，且保存時(shí)間理想，其他色譜柱存在色譜峰拖尾、峰型不對(duì)稱、保留時(shí)間較長等現(xiàn)象，故本文選擇Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）作為實(shí)驗(yàn)色譜柱。

本文對(duì)比柱溫分別為20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃和40 ℃時(shí)對(duì)檢測(cè)效果的影響。發(fā)現(xiàn)柱溫為30 ℃時(shí)，峰型良好，食品添加劑可完全分離，無拖尾現(xiàn)象，其余柱溫下分離效果較差、有峰重疊、保留時(shí)間較短、基線漂移以及噪音增大等現(xiàn)象，故選擇30 ℃作為實(shí)驗(yàn)柱溫。

2.1.3 確定流動(dòng)相

考察流動(dòng)相分別為甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1）、甲醇-磷酸二氫鉀（20 mmol·L-1）、乙腈-乙酸銨（20 mmol·L-1）、乙腈-磷酸二氫鉀（20 mmol·L-1）時(shí)對(duì)分離效果的影響。結(jié)果表明，甲醇-乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)，峰型較好、分離速度較快，其余分離效果不理想，物質(zhì)保留時(shí)間較短，有峰重疊，故本文選擇甲醇-乙酸銨作為流動(dòng)相。

2.1.4 確定洗脫方式

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于流動(dòng)相中甲醇體積分?jǐn)?shù)的增加，物質(zhì)保留時(shí)間有所下降，當(dāng)采用等度洗脫方式時(shí)，山梨酸、糖精鈉無法被有效分離[5]，而當(dāng)降低甲醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)，雖然能夠?qū)⒍叻蛛x，但洗脫時(shí)間超過60 min。因此，本文選用梯度洗脫方式，洗脫程序見表1。

2.1.5 確定緩沖溶液pH值

配制濃度為20 mmol·L-1的磷酸二氫鉀和乙酸銨緩沖溶液，在不同pH（4.5、5.5、6.0、6.6和7.0）緩沖液下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)[6]。pH值為7.0時(shí)，8種食品添加劑分離效果理想，峰型較好，無拖尾現(xiàn)象。故本文選擇pH值為7.0。

2.1.6 確定流速

考察流速為0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1時(shí)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1時(shí)分離效果較為理想，因此本次試驗(yàn)最終選擇的流速為1.0 mL·min-1。

2.2 線性關(guān)系、檢出限、定量限

為避免和減小誤差，在最佳色譜條件下，重復(fù)多次進(jìn)樣，計(jì)算8種食品添加劑的檢出限、定量限和線性范圍，得出各食品添加劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)（表2）。其中，方法檢出限和定量限根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》（GB/T 27417—2017）中相關(guān)要求，采用信噪比法進(jìn)行確定，測(cè)定10次，取平均值，檢出限平均測(cè)定結(jié)果信噪比（S/N）均＞3，定量限平均測(cè)定結(jié)果信噪比（S/N）均＞10。由表2可知，8種食品添加劑在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.999 0。

2.3 加樣回收實(shí)驗(yàn)

根據(jù)1.3.3處理，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算加標(biāo)回收率。由表3可知，8種食品添加劑的加標(biāo)回收率在93.58%～98.27%，RSD在0.8%～1.3%，說明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較高，穩(wěn)定性理想，可用于醬油中食品添加劑含量的日常測(cè)定工作。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

采用上述方法對(duì)5種醬油樣品中的8種食品添加劑含量進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表4。根據(jù)我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》（GB 2760—2014）中關(guān)于食品添加限量要求，5種醬油樣品中食品添加劑的含量均在國標(biāo)允許范圍內(nèi)，未出現(xiàn)超標(biāo)的現(xiàn)象。

3 結(jié)論

本文采用高效液相色譜法測(cè)定醬油中8種食品添加劑含量，其最佳測(cè)定條件為Diamonsil PIus-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、流動(dòng)相為甲醇-乙酸銨（20 mmol·L-1，pH=7.0），檢測(cè)波長230 nm。該條件下各添加劑在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率在93.58%～98.27%，RSD＜2%，且5種醬油樣品中食品添加劑含量均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求，未發(fā)現(xiàn)超標(biāo)情況。說明高效液相色譜法可用于多種食品添加劑測(cè)定，操作簡單、準(zhǔn)確性較高。

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作者簡介：趙倩薷（1990—），女，山東微山人，本科，助理工程師。研究方向：食品檢測(cè)。