摘 要：目的：建立固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定海產(chǎn)品中7種微囊藻毒素和2種魚腥藻毒素的方法。方法：樣品經(jīng)80%乙腈提取，HLB小柱凈化后，采用MRM模式進(jìn)行分析，外標(biāo)法定量。結(jié)果：7種微囊藻毒素和2種魚腥藻毒素在0.5～50.0 μg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.3 μg·kg-1，回收率為75.5%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～5.4%。結(jié)論：該方法重現(xiàn)性較好、靈敏度高、成本低，可以實(shí)現(xiàn)海產(chǎn)品中的魚腥藻毒素和微囊藻毒素的同時(shí)檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素；魚腥藻毒素；固相萃?。⊿PE）；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）

Simultaneous Determination of Microcystins and Anatoxins in Marine Products by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Solid Phase Extraction

LYU Xiaojing， JU Guangxiu， QU Xin， WANG Yong， YU Hongwei*

（1.Qingdao Municipal Center For Disease Control amp; Prevention/Qingdao Institute of Preventive Medicine， Qingdao 266033， China; 2.Shimadzu （China） Co.， Ltd.， Beijing Branch， Beijing 100020， China）

Abstract： Objective： A method for simultaneous determination of 7 microcystins （MCs） and 2 Anatoxins （AnTXs） in marine products was achieved by solid phase extraction （SPE）-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Method： The sample was extracted with 80% acetonitrile， purified by HLB small column， analyzed using MRM mode， and quantified using external standard method. Result： The linear ranges for 7 MCs and 2 AnTXs were 0.5～50.0 μg·L-1. The limits of detection were 0.3 μg·kg-1. The recoveries of the 7 MCs and 2 AnTXs spiked in blank marine products ranged from 75.5% to 98.8% with the relative deviations of 1.5%～5.4%. Conclusion： The method has the advantages of good reproducibility， high sensitivity and low cost， and can achieve simultaneous detection of fishy algae toxins and microcystins in seafood.

Keywords： microcystin; anatoxin; solid phase extraction （SPE）; high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）和魚腥藻毒素（Anatoxins，AnTXs）是兩種典型的藍(lán)細(xì)菌毒素[1]。微囊藻毒素是藍(lán)藻釋放的次級(jí)代謝產(chǎn)物，由環(huán)七肽和特殊的芳香族氨基酸側(cè)鏈-AD-DA構(gòu)成，100多種異構(gòu)體中MC-RR、MC-LR最為常見。鑒于其毒性和危害，世界衛(wèi)生組織在飲用水標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定了MC-LR的限值為1 μg·L-1，2017年被列入2B類致癌物清單[2]。魚腥藻毒素是一類具有神經(jīng)毒性的小分子生物堿，可造成神經(jīng)傳導(dǎo)阻滯[3]。此外，魚腥藻毒素-A（Anatoxin-a，AnTX-a）與常見的微囊藻毒素MC-LR還會(huì)產(chǎn)生協(xié)同毒性作用[4-5]。

藍(lán)細(xì)菌毒素通過各類水生生物特別是水產(chǎn)品進(jìn)入食物鏈，最終進(jìn)入人體內(nèi)，從而對(duì)人類健康帶來風(fēng)險(xiǎn)。青島地區(qū)海產(chǎn)品食用量大，海產(chǎn)品安全關(guān)系到人們的健康。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確的藍(lán)細(xì)菌毒素檢測(cè)方法，考察藍(lán)細(xì)菌毒素在海產(chǎn)品中的含量及分布具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

貝類和魚類等海產(chǎn)品，購(gòu)于青島大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市。

標(biāo)準(zhǔn)品（First Standard MC-LY：2.5 μg·mL-1；MC-LW：10 μg·mL-1；MC-YR：10 μg·mL-1；MC-LA：2.5 μg·mL-1；MC-LF：10 μg·mL-1；MC-RR：20 μg·mL-1；壇墨質(zhì)檢MC-LR：10 μg·mL-1；Eurofins Abraxis H-ATx：10 μg·mL-1；Canada ATX：5 μg·mL-1）。乙腈、甲酸均為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；Oasis HLB固相萃取小柱（60 mg，3 mL）。

島津LC-MS/MS 8060液質(zhì)聯(lián)用儀；Milli-Q Gradient型超純水器；手動(dòng)固相萃取儀；氮吹儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

各種微囊藻毒素和魚腥藻毒素用甲醇配成50 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別配成0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1、20.0 ng·mL-1和50.0 ng·mL-1的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，臨用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品提取及凈化

提?。簩⒑．a(chǎn)品（購(gòu)于青島大型農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市）可食部分用組織搗碎勻漿機(jī)勻漿，取樣品5 g置于50 mL離心管中，加入20 mL 80%乙腈溶液，渦旋混勻2 min，超聲提取5 min，5 000 r·min-1離心5 min。取10 mL上清液待凈化。

凈化：按照Oasis HLB固相萃取小柱的操作條件，進(jìn)行樣品凈化，將收集的洗脫液于40 ℃氮吹至近干，加入1.0 mL流動(dòng)相初始比例復(fù)溶殘?jiān)?，過0.22 μm濾膜，待上機(jī)。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱Shim-pack Scepter C18-120；柱溫：35 ℃；流速：0.35 mL·min-1；流動(dòng)相組成：A-0.1%甲酸水溶液，B-乙腈；梯度洗脫：0～4 min，75%A→15%A；4～5 min，15%A；5～5.1 min，15%A→75%A。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子掃描；加熱氣流量：15 L·min-1；干燥氣流量：3 L·min-1；霧化氣流量：3 L·min-1；接口溫度：350 ℃；脫溶劑管線DL溫度：180 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃。掃描模式：多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件優(yōu)化

以乙腈與0.1%的甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物響應(yīng)值最高，適量的甲酸有利于改善峰型且有助于提高離子化效率。分別考察ACQUITY UPLC BEH ? C18、Shim-pack GIST C18和Shim-pack Scepter C18-120 3種色譜柱的分離效果，發(fā)現(xiàn)用Shim-pack Scepter C18-120色譜柱時(shí)各化合物峰型較好且干擾較小。因此，實(shí)驗(yàn)選用Shim-pack Scepter C18-120色譜柱。

2.2 提取溶劑及超聲時(shí)間的選擇

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[6]，考察了20%、40%、60%和80%的乙腈溶液的提取效率，結(jié)果顯示，當(dāng)乙腈為80%時(shí)，大部分化合物的相對(duì)較高，故選擇80%乙腈溶液為提取溶劑。考察了超聲時(shí)間為5 min、10 min、15 min和20 min的提取效率，結(jié)果表明，超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取效率未見顯著的提高，所以超聲提取確定為5 min。

2.3 固相萃取柱的選擇

文獻(xiàn)報(bào)道顯示[7]，C18固相萃取小柱容易受操作影響，從而導(dǎo)致回收率不穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中考察了HLB柱的提取效果，結(jié)果顯示該柱能有效地對(duì)添加樣品中的兩類毒素進(jìn)行富集和凈化，故選擇Oasis HLB固相萃取小柱。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限

配制一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物的峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，在0.5～50.0 μg·L-1，9種藍(lán)細(xì)菌毒素線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.99以上。以3倍信噪比確定各目標(biāo)化合物的檢出限為0.3 μg·kg-1，定量限為1.0 μg·kg-1。

2.5 回收率與精密度

在陰性樣品花蛤中加入藍(lán)細(xì)菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別進(jìn)行0.8 μg·kg-1、4.0 μg·kg-1和20.0 μg·kg-1加標(biāo)回收率考察，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率在75.5%～98.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～5.4%，精密度和準(zhǔn)確度均較好。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定結(jié)果

購(gòu)買100份海產(chǎn)品（貝類和魚類各50份），按照本方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在一份花蛤樣品中檢出MC-YR，結(jié)果為0.83 μg·kg-1，在一份貽貝中檢出MC-RR，結(jié)果為0.57 μg·kg-1，未有其他藍(lán)細(xì)菌毒素的檢出。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了SPE-HPLC-MS/MS方法分析海產(chǎn)品中藍(lán)細(xì)菌毒素的方法，實(shí)現(xiàn)了魚腥藻毒素和微囊藻毒素的同時(shí)測(cè)定。海產(chǎn)品經(jīng)乙腈提取，HLB小柱凈化，采用MRM測(cè)定，該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單、快速，具有良好的精密度和準(zhǔn)確度，可以為海產(chǎn)品中魚腥藻毒素和微囊藻毒素等藍(lán)細(xì)菌毒素的定性和定量檢測(cè)提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)

[1]王素欽，陶思依，宋立榮，等.高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)魚腥藻毒素的比較研究[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2020，11（12）：3982-3991.

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[6]徐瀟穎，劉柱，毛思浩，等.全自動(dòng)在線固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定螺旋藻中8種微囊藻毒素[J].食品科技，2023，48（4）：305-311.

[7]吳潔珊，倪清泉，任永霞，等.HPLC-高分辨飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定水中多種微囊藻毒素[J].環(huán)境監(jiān)測(cè)管理與技術(shù)，2020，32（6）：54-57.

作者簡(jiǎn)介：呂曉靜（1982—），女，山東青島人，碩士，主管技師。研究方向：理化檢驗(yàn)。

通信作者：于紅衛(wèi)（1971—），女，山東青島人，本科，副主任技師。研究方向：理化檢驗(yàn)。E-mail：fish_yhw@126.com。