余敏，崔躍，黎鵬飛，謝丹，陳芬

摘要 目的：探究長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）母系表達(dá)基因3（MEG3）對(duì)大鼠心肌H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（H/R）的保護(hù)作用及其與核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（ARE）通路的關(guān)系。方法：將H9c2細(xì)胞分為Control組、H/R組、H/R＋Ad-綠色熒光蛋白（GFP）組、H/R＋Ad-MEG3組、H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組及H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)MEG3表達(dá)；噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞活力；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）法檢測(cè)活性氧（ROS）水平；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化氫酶（CAT）活性；蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）檢測(cè)Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)。結(jié)果：與Control組比較，H/R組細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞中ROS水平及Nrf2、血紅素氧化酶1（HO-1）和醌氧化還原酶-1（NQO-1）蛋白水平均增高，而細(xì)胞活力、細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平、SOD和CAT活性均降低（P＜0.05）。MEG3過(guò)表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)H/R對(duì)H9c2細(xì)胞和Nrf2/ARE通路蛋白的影響（P＜0.05）；敲低Nrf2可削弱MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)H/R損傷的保護(hù)作用（P＜0.05）。結(jié)論：MEG3過(guò)表達(dá)可抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡減輕H/R心肌損傷，可能與激活Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞缺氧/復(fù)氧；長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3；心肌細(xì)胞H9c2；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2024.04.013

Effect of Up-regulated lncRNA MEG3 on Hypoxia/Reoxygenation Injury of Rats Myocardial Cell Lines

YU Min， CUI Yue， LI Pengfei， XIE Dan， CHEN Fen

Wuhan Red Cross Hospital， Wuhan 430015， Hubei， China， E-mail： yumin662@163.com

AbstractObjective：To explore the protective effect of maternal expression of long non-coding RNA（lncRNA） maternally expressed gene 3（MEG3） on hypoxia/reoxygenation（H/R） in rat myocardial H9c2 cells and its relationship with the nuclear factor E2 related factor 2（Nrf2）/antioxidant response element（ARE） pathway.Methods：H9c2 cells were divided into control group，H/R group，H/R＋Ad-Green fluorescent protein（GFP） group，H/R＋Ad-MEG3 group，H/R＋Ad-MEG3＋si-NC group and H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2 group.Real-time fluorescent quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-qPCR） was used to detect MEG3 expression.Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） method was used to detect the viability of cells.Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate.2′，7′-dichlorofluorescent yellow diacetate（DCFH-DA） method was used to detect the level of reactive oxygen species（ROS）.Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the activities of superoxide dismutase（SOD） and catalase（CAT）.Western Blot was used to detect the expression levels of Nrf2/ARE pathway related proteins.Results：Compared with the control group，the H9c2 cell apoptosis rate，cell ROS level and Nrf2，heme oxidase 1（HO-1） and quinone oxidoreductase-1（NQO-1） protein levels increased in the H/R group，while the cell viability，the MEG3 expression level in the cells，SOD and CAT activities reduced（P＜0.05）.MEG3 overexpression partially reversed the effects of H/R on H9c2 cells and Nrf2/ARE pathway proteins（P＜0.05）.Knockdown of Nrf2 could weaken the protective effect of MEG3 overexpression on H/R injury（P＜0.05）.Conclusion：Up-regulating the expression of MEG3 could inhibit oxidative stress and apoptosis to protect H/R myocardial Injury，which may be related to the activation of Nrf2/ARE antioxidant signals.

Keywordshypoxia/reoxygenation; long non-coding RNA maternally expressed gene 3; cardiomyocyte H9c2; experimental study

缺血性心臟病是由冠狀動(dòng)脈閉塞或狹窄引起的，冠狀動(dòng)脈血流恢復(fù)是減輕心肌缺血性損傷的有效干預(yù)措施［1］。但血流的恢復(fù)會(huì)誘發(fā)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生和氧化損傷的恢復(fù)［2］。因此，防止氧化損傷是保護(hù)心臟免受心肌缺血/再灌注損傷的有效途徑之一。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類(lèi)不編碼蛋白質(zhì)的RNA，可參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展［3］。母系表達(dá)基因3（maternally expressed gene 3，MEG3）已被證明參與腫瘤、肺纖維化等多種疾病過(guò)程［4］。已有研究證實(shí)，MEG3可促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷的恢復(fù)［5］。然而其在心肌細(xì)胞缺血/再灌注損傷中的具體作用機(jī)制還未可知。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）通路在缺血/再灌注損傷中發(fā)揮著重要的作用［6］。本研究通過(guò)構(gòu)建心肌H9c2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，探討MEG3在H/R心肌細(xì)胞中的作用及對(duì)Nrf2/ARE通路的影響，以期為進(jìn)一步靶向治療缺血/再灌注損傷提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

大鼠心肌H9c2細(xì)胞系（美國(guó)ATCC公司）；DEME培養(yǎng)基（上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；LipofectamineTM2000（Invitrogen公司）；總RNA提取試劑、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase linkage reaction，RT-qPCR）試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠（annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）；噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀測(cè)定（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解緩沖液（Bestbio公司）；超氧化物歧化酶（superoside dismutase，SOD）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）ELISA試劑盒（江西艾博因生物科技有限公司）；一抗：Nrf2、醌氧化還原酶-1（quinine oxidoreductase 1，NQO-1）、血紅素氧化酶1（heme oxygenase 1，HO-1）及內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（Abcam 公司）。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的分組及處理

將H9c2細(xì)胞分為Control組、H/R組、H/R＋Ad-綠色熒光蛋白（GFP）組、H/R＋Ad-MEG3組、H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組及H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組。Control組不做任何處理。H/R組構(gòu)建H/R模型，即將H9c2細(xì)胞保存在無(wú)糖無(wú)血清的DEME培養(yǎng)基中，并在5%CO2、94%N2和1%O2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，以模擬缺氧損傷［7］；后更換為正常培養(yǎng)基，并在5%CO2、95%空氣的37 ℃潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在不同的時(shí)間點(diǎn)（12 h、24 h、48 h）收集細(xì)胞。H/R＋Ad-GFP組轉(zhuǎn)染Ad-GFP后進(jìn)行H/R處理；H/R＋Ad-MEG3組轉(zhuǎn)染Ad-MEG3后進(jìn)行H/R處理；H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組轉(zhuǎn)染Ad-MEG3和si-NC后進(jìn)行H/R處理；H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組轉(zhuǎn)染Ad-MEG3和si-Nrf2后進(jìn)行H/R處理。

1.2.2RT-qPCR檢測(cè)MEG3表達(dá)

TRIZOL法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄形成cDNA，并進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，2－ΔΔCt計(jì)算MEG3的相對(duì)表達(dá)。引物序列如下：MEG3正向?yàn)?′-TCGCTCTTCTCCATCGAACCG-3′，反向?yàn)?′-GTAGGGCGACGACTTTGAGT-3′；GAPDH正向?yàn)?′-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3′，反向?yàn)?′-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.2.3MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

將細(xì)胞接種在96孔板中（1×104個(gè)/孔），24 h后添加20 mL MTT（0.5 g/L）孵育1 h，添加二甲基亞砜。檢測(cè)各孔細(xì)胞在490 nm處的吸光度，Control組的吸光度設(shè)置為100%。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

500 mL Annexin V結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，添加Annexin V-FITC和PI孵育5 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.52′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS水平

PBS洗滌細(xì)胞后添加10 mmol/L的DCFH-DA孵育30 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)DCF熒光（488 nm激發(fā)波長(zhǎng)和525 nm發(fā)射波長(zhǎng)）。

1.2.6ELISA檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性

RIPA裂解液制備細(xì)胞裂解物，BCA法測(cè)定蛋白濃度，分別使用SOD和CAT ELISA試劑盒檢測(cè)其活性。

1.2.7蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Nrf2/ARE通路相關(guān)蛋白表達(dá)

使用RIPA裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白，10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5%脫脂奶粉孵育1 h后，加一抗Nrf2、NQO-1、HO-1及β-actin在4 ℃下過(guò)夜孵育，隔日添加二抗孵育2 h后增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL）液顯影，在凝膠成像儀中使條帶可視化，通過(guò)Image-J軟件分析條帶的吸光度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用單因素方差分析和SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1H/R后H9c2細(xì)胞中MEG3表達(dá)水平

與Control組比較，H/R組MEG3表達(dá)水平隨著再?gòu)?fù)氧時(shí)間的增加而降低，故后續(xù)選擇復(fù)氧的時(shí)間均為48 h（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖1。

2.2不同處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中MEG3表達(dá)、細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率的影響

與Control組比較，H/R組細(xì)胞MEG3表達(dá)水平與細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率均增高（P＜0.05）；與H/R＋Ad-GFP組比較，H/R＋Ad-MEG3組H9c2細(xì)胞MEG3表達(dá)水平與細(xì)胞活力增高，細(xì)胞凋亡率均降低（P＜0.05）；與H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組比較，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組細(xì)胞MEG3表達(dá)水平與細(xì)胞活力降低，細(xì)胞凋亡率增高（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖2、圖3。

2.3不同處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

與Control組比較，H/R組細(xì)胞ROS水平增高，SOD和CAT活性降低（P＜0.05）；與H/R＋Ad-GFP組比較，H/R＋Ad-MEG3組細(xì)胞ROS水平降低，SOD和CAT活性增高（P＜0.05）；與H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組比較，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組H9c2細(xì)胞ROS水平增高，SOD和CAT活性降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖4。

2.4不同處理對(duì)H/R誘導(dǎo)的H9c2細(xì)胞中Nrf2/ARE通路的影響

與Control組比較，H/R組H9c2細(xì)胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表達(dá)水平均增高（P＜0.05）；與H/R＋Ad-GFP組比較，H/R＋Ad-MEG3組H9c2細(xì)胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表達(dá)水平均增高（P＜0.05）；與H/R＋Ad-MEG3＋si-NC組比較，H/R＋Ad-MEG3＋si-Nrf2組H9c2細(xì)胞中Nrf2、HO-1及NQO-1蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖5、圖6。

3討論

ROS是缺血再灌注損傷中的信號(hào)介質(zhì)［8］。血流的快速恢復(fù)增加了組織氧合水平，并導(dǎo)致第2次ROS生成爆發(fā)，通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致組織再灌注損傷［2］。地黃多糖通過(guò)提高細(xì)胞活力和抗氧化酶SOD、CAT等的活性，降低細(xì)胞凋亡率和氧化應(yīng)激損傷，從而對(duì)H/R損傷的心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用［9］。MEG3是一種抑癌因子，研究顯示，MEG3在肝細(xì)胞和組織中下調(diào)，可通過(guò)調(diào)控miR-34a/Nrf2信號(hào)通路保護(hù)肝細(xì)胞免受H/R損傷［10］。本研究結(jié)果顯示，MEG3過(guò)表達(dá)通過(guò)提高抗氧化酶SOD和CAT的活性，抑制氧化應(yīng)激，保護(hù)H9c2細(xì)胞。然而，研究顯示，MEG3通過(guò)抑制miR-7-5p表達(dá)促進(jìn)心肌缺血再灌注損傷［5］，與本研究結(jié)果不同，這種差異可能與H/R造模方式不同、采用檢測(cè)的平臺(tái)不同、細(xì)胞微環(huán)境或?qū)嶒?yàn)操作方法的不同有關(guān)。因此，有必要對(duì)MEG3的作用機(jī)制進(jìn)行深入探究。

ROS可影響包括Nrf2/ARE在內(nèi)的多種信號(hào)通路［11］，Nrf2/ARE處于氧化應(yīng)激的中心地位。減少ROS的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)Nrf2/ARE通路可能是減少與缺血再灌注相關(guān)的組織損傷的新治療策略。研究表明，Nrf2/ARE信號(hào)通路在保護(hù)心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，并可作為治療靶點(diǎn)［6-7］。Nrf2是細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過(guò)兩方面發(fā)揮氧化應(yīng)激作用，1）通過(guò)加速Nrf2 mRNA轉(zhuǎn)錄增加蛋白合成；2）從細(xì)胞質(zhì)中釋放出來(lái)，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，與基因啟動(dòng)子區(qū)域的ARE結(jié)合，包括HO-1和NQO-1，參與氧化還原調(diào)節(jié)［12］。淫羊藿苷調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1通路抑制H/R心肌細(xì)胞損傷［13］。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)MEG3表達(dá)增加了H/R刺激的H9c2細(xì)胞中Nrf2、HO-1及NQO-1表達(dá)水平，下調(diào)Nrf2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)MEG3過(guò)表達(dá)對(duì)H/R心肌細(xì)胞和Nrf2/ARE的影響，推測(cè)MEG3過(guò)表達(dá)激活Nrf2/ARE通路保護(hù)H/R心肌細(xì)胞。

綜上所述，MEG3過(guò)表達(dá)通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡保護(hù)H/R心肌損傷，可能與激活Nrf2/ARE抗氧化信號(hào)有關(guān)。但本研究未在動(dòng)物模型和其他細(xì)胞系中驗(yàn)證MEG3功能，且并未深入探究MEG3如何調(diào)控Nrf2/ARE通路。后續(xù)將針對(duì)以上不足進(jìn)一步完善研究。

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（收稿日期：2022-06-22）

（本文編輯鄒麗）