楊蓉，趙晨，李端華，饒峻，王輅

(成都大學藥學院，成都 610106)

自1915年Frederick Twort發(fā)現噬菌體[1]，1917年D'Herelle發(fā)現并命名其為“Bacteriophage”[2]以來，噬菌體就被研究用于治療各種細菌引起的感染性疾病。特別是1923年后，歐洲的格魯吉亞Eliava噬菌體、微生物學和病毒學研究所和弗羅茨瓦夫(波蘭)的Hirszfeld研究所通過噬菌體成功治療了許多病原菌引起的感染。盡管20世紀中葉由于抗生素的發(fā)現并大量運用使得噬菌體治療的發(fā)展受阻，但科學家對噬菌體治療的研究從未停止。也正是由于抗生素的大規(guī)模生產及使用，催生出了大量耐藥性細菌，并最終導致多重耐藥菌甚至超級耐藥菌ESKAPE(屎腸球菌，金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌，鮑曼不動桿菌，銅綠假單胞菌和腸桿菌屬)的出現[3]。這時，噬菌體又重新引起了科學家們的興趣。

然而，D'Herelle時期制定的相關噬菌體治療法規(guī)由于受到現代藥物立法的阻礙已經不再適用，這也影響了噬菌體臨床試驗的開展及相關專利的申請。盡管目前尚無完善的噬菌體相關法規(guī)頒布，但在西方國家針對患者的個性化噬菌體治療已被用于同情用藥[4-6][按照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的定義，同情用藥指對于患有嚴重或危及生命疾病的患者，在不能通過現有藥品或入選臨床試驗來得到有效治療時，可以申請在臨床試驗之外使用末經上市許可的試驗用藥物]，在美國和歐洲一些國家已經有噬菌體治療的相關專利被授權[7-9]，并且可在歐洲某些國家的授權藥店購買到人用噬菌體藥物，這些現象都展現了噬菌體具有良好的應用前景。

在我國，藥物制劑需按《藥品生產質量管理規(guī)范》(Good manufacturing practice, GMP)進行制備，但目前我國尚無完善的噬菌體藥物監(jiān)管法規(guī)，多數噬菌體治療還僅限于動物治療。噬菌體具有生物制品的相關特征，因此在制備噬菌體用于研究時可參考我國有關生物制品制定的標準?；谝陨厦枋?，本文嘗試結合我國現行藥典關于生物制品生產、制備及質量控制要求和歐洲藥品管理局(European medicines agency,EMA)近年來對噬菌體治療藥物批準途徑(包括對細胞庫、噬菌體庫的質量控制和噬菌體藥品的管制)的探索為參照，著重對噬菌體庫構建與控制、噬菌體制備與質控和臨床前測試等進行綜述分析。

1 噬菌體庫

噬菌體庫構建是噬菌體治療研究的基礎工作。首先創(chuàng)建噬菌體文庫和高濃度儲存的噬菌體制劑庫，以保證能快速實現噬菌體藥物遞送。前者主要包含相關噬菌體的基本信息，如基因組信息、分類、生命周期和裂解性能等；后者是以穩(wěn)定制劑形式存放的高濃度噬菌體藥物。

1.1 噬菌體庫制備

通常，在噬菌體庫構建時，噬菌體擴增所用的宿主菌選擇、培養(yǎng)基組成以及合適的培養(yǎng)條件對制備和獲得用于治療的高濃度噬菌體至關重要。在生產制備噬菌體的過程中應盡最大可能降低污染和噬菌體降解，并在基因層面上檢查噬菌體，以確定噬菌體基因組中是否具有編碼抗生素抗性、溶原性(如整合酶、轉座酶)、毒性和毒性決定因子的基因。此外，適當的噬菌體/細菌比例[多重感染復數(Multiple infection complex，MOI)]、噬菌體爆發(fā)量和吸附效率對噬菌體生產也起著關鍵作用。對于治療用途的噬菌體，應優(yōu)選吸附率高、爆發(fā)量大和潛伏期短的噬菌體，這樣有利于縮短噬菌體制備周期并快速達到治療目的。最關鍵的是，用于治療的噬菌體應選擇毒性噬菌體(也稱裂解性噬菌體)，而非溫和噬菌體[10]。因為某些溫和噬菌體編碼的基因能將它們所感染的細菌轉化為致病性更強的菌株[11]；其次，溫和噬菌體的存在能在相同或相關噬菌體(具有相同的免疫類型)重復感染時使細菌產生免疫現象；另外，溫和噬菌體還能參與細菌間的轉導[11]，使細菌DNA從一個宿主轉移至另一個宿主，這將可能增加細菌的致病性。

1.2 文庫質量控制

噬菌體文庫構建時的質量控制對治療的有效性、安全性及可追溯性具有重要作用。應對包括噬菌體形態(tài)、基因組特征信息及活性進行檢測。

1.2.1 形態(tài)學鑒定

1940年Ruska首次使用電子顯微鏡(Electron microscope，EM)觀察到噬菌體[12]，自此開啟了對噬菌體進行形態(tài)學分類的研究[13-14]。根據尾部形態(tài)，科學家們將噬菌體分為三個科：具有短而不收縮的尾巴(Podoviridae)、具有長而不收縮的尾巴(Siphoviridae)和具有長而可收縮尾巴(Myoviridae)[15]。

如今隨著檢測技術的發(fā)展，國際病毒分類委員會(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)對各噬菌體家族進行了匯編(http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)，使得噬菌體分類得到了擴展，主要包括根據宿主范圍、結構、衣殼大小和形狀、基因組類型(單鏈/雙鏈DNA或RNA)、基因組大小和對有機溶劑的耐受能力等進行分類。

1.2.2 基因組特征分析

Hershey等[16]在1952年對大腸埃希菌噬菌體T2的研究結果證明了噬菌體的遺傳物質是DNA，而非蛋白質，并經研究表明噬菌體的遺傳物質可以是任何一種核酸類型。隨后，基因組測序和限制性內切酶消化作為噬菌體分類和治療過程中的分子工具一直被沿用。隨著基因測序所需成本降低，該項技術逐漸成為新噬菌體鑒別的重要依據?；驕y序技術在噬菌體上的應用將噬菌體基于形態(tài)學分類轉變至基于基因和蛋白質之間的關系這種更精確的方式進行分類，為新噬菌體的發(fā)現提供了可靠的依據。

基因測序在研究菌株對噬菌體產生抗性方面也提供了很大幫助。如Ishino等[17]和Jansen等[18]在細菌基因組中發(fā)現了CRISPR/Cas基因，并證明了這是一種噬菌體抗性機制。此外，噬菌體在感染細菌時具有導致有害或有毒基因在細菌群體中傳播的風險[19]，因此在噬菌體用于治療前應先通過基因測序檢測其轉導能力。

盡管近年來由于基因測序技術的發(fā)展使得噬菌體相關的研究得到許多突破，但關于噬菌體如何識別宿主、如何將有害基因轉至宿主細菌以及如何應對宿主細菌產生抗性等問題仍需進行深入探索。

1.2.3 活性檢測

為保證噬菌體文庫治療的有效性，活性測定是必不可少的，包括宿主范圍和生長周期等[20]。

噬菌體的宿主范圍是其能感染宿主菌的分類多樣性，與宿主表面受體結構相關，由于細菌間表面受體的差異使得噬菌體具有特異性感染宿主菌的特征，這也是噬菌體宿主范圍窄的一個重要原因[21-22]。目前，在作為治療手段時，通常將具有不同窄宿主范圍的噬菌體進行混合，以擴展其應用范圍并提高治療效果[23]。

雖然噬菌體宿主范圍窄，但隨著技術的發(fā)展，已有研究表明可通過對噬菌體進行基因層面的改造來擴展其宿主范圍[22]，這為噬菌體的應用提供了重要參考。

而對于其生長周期的測定，一步生長曲線[The one-step growth (OSG) curve]可使噬菌體的生長以數據的形式可視化。噬菌體的OSG曲線最早由Ellis[24]于1939年提出，作為新分離噬菌體活性測定的一部分，用于表征噬菌體的生長周期。噬菌體的生長周期主要包含7個步驟：(1)噬菌體與敏感菌碰撞；(2)噬菌體附著；(3)噬菌體核酸攝入；(4)噬菌體蛋白和核酸合成；(5)噬菌體成熟；(6)子代噬菌體釋放期；(7)子代噬菌體在細胞外搜尋細菌進行吸附(擴散期)。

2 噬菌體制備與質量控制

2.1 噬菌體培養(yǎng)

目前已有專門的機構為臨床或研究提供大規(guī)模且高純度的噬菌體，如噬菌體技術中心(Center for phage technology, CPT)和第比利斯的Eliava研究所[25]。噬菌體擴增所用宿主菌通常是實驗室使用的菌株，但這將導致噬菌體應用范圍受到限制，因此在實際用于治療時，可通過使用更多宿主菌(包括一些臨床菌株)來生產制備高濃度噬菌體，并且在生產過程充分探索合適的生產條件，如培養(yǎng)溫度、時間、培養(yǎng)基組成、MOI和宿主菌引入密度等，這樣才可能實現大規(guī)模生產噬菌體制劑的目的。

2.2 噬菌體純化精制

噬菌體作為一種病毒，只能在細菌細胞內繁殖。因此，制備治療用噬菌體的一個主要障礙是將噬菌體從細菌粗裂解物(內毒素、肽聚糖、外毒素、鞭毛、核酸等)中分離出來，如果不充分除去這些雜質，將在人體中引發(fā)炎癥、敗血癥和感染性休克等嚴重后果[26-28]。

從粗培養(yǎng)物中獲取高純度噬菌體的傳統(tǒng)方法包括離心、過濾、超濾、聚乙二醇(Polyethylene glycol，PEG)沉淀，CsCl梯度超速離心和透析[29]。隨著技術的進步，科學家們將陰離子交換色譜(Anion exchange chromatography)[30]、體積排除色譜(Size exclusion chromatography，SEC)[31]、脫鹽柱(Desalting spin column)[32]、甲基丙烯酸酯整體柱(Methacrylate monolith column)[32]等方法用于噬菌體的純化，并得到了不錯的純化結果。

然而，單一的純化方法并不能立即得到高濃度純噬菌體，因此需根據不同純化方法的特點進行組合使用。通常將噬菌體從粗裂解物中純化噬菌體的第一步是運用離心、過濾去除較大雜質(如細胞碎片)，再通過透析、超濾等方法對體系進行濃縮。若宿主菌為革蘭陰性菌時，還應考慮去除內毒素或脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的步驟[29]。

2.3 噬菌體質量控制

噬菌體制劑的質量控制在參考我國現行藥典關于生物制品生產、制備及質量控制要求和EMA近年來對噬菌體治療藥物批準途徑的探索的基礎上，還應考慮到噬菌體的保存穩(wěn)定性及吸附效率。

2.3.1 穩(wěn)定性

維持噬菌體制劑的穩(wěn)定性對于實現長期有效的噬菌體給藥至關重要。許多科學家將穩(wěn)定性研究(例如溫度、pH值、離子強度、溶劑等)作為噬菌體的基礎研究，這些條件對噬菌體的濃度及感染活性等的影響和對生產及保存符合治療目的噬菌體制劑具有重要意義[33]。

噬菌體的穩(wěn)定性通常使用雙層平板測定噬菌體濃度來表征[34]。但該法耗時且費力，如果濃度變化能用更簡單方便，且快速的方法進行檢測，那將節(jié)約很多時間，為此，許多簡化的實驗方法如單層瓊脂平板測定噬菌斑等被開發(fā)并應用于濃度測定。

2.3.2 吸附效率

Bertozzi等[35]認為測定噬菌體對宿主細胞的吸附效率對應用(主要為治療用途)噬菌體時的有效性具有重要意義。作為治療用途的噬菌體必須具有高吸附效率才能在施用時快速裂解病原菌達到治療效果。因此，在表征新噬菌體時應及早驗證吸附效率以節(jié)省更多的時間和資源。而吸附效率通常又與宿主菌大小、噬菌體顆粒有效半徑、噬菌體擴散速率和噬菌體與宿主菌碰撞條件下附著的概率等有關。

3 臨床前研究

目前，已建立了幾種最常見并且與人類細菌感染相關的動物模型，這些動物模型被用于測試新分離噬菌體及其在體內對抗病原菌的效力[36]。

3.1 動物模型

用于噬菌體治療研究的動物模型包括無脊椎動物或低等脊椎動物模型：線蟲(Caenorhabditis elegans)、果蠅(Drosophilamelanogaster)、蠟蛾(Galleriamellonella)和斑馬魚(Daniorerio)；和高等脊椎動物：雞(GallusGallus)、兔(Oryctolagus Cuniculas)、倉鼠(Mesocricetusauratus)和小鼠(musculus)模型[37](圖1)。

圖1 用于細菌感染和噬菌體治療應用的動物模型[46]

這些動物模型主要用于研究感染銅綠假單胞菌[38-42]、沙門菌[43]、金黃色葡萄球菌[43-44]、洋蔥伯克菌[45]、糞腸球菌[40-41]、艱難梭菌[46]、大腸埃希菌[47]和彎曲桿菌[48-49]等細菌后噬菌體治療的安全性及有效性，為噬菌體治療的有效性、不良反應的發(fā)生和與宿主相互作用等提供支撐。

3.2 給藥途徑

只有當足夠且合適數量的噬菌體到達感染部位并殺死病原菌時，噬菌體治療才算是成功的[50]。在運用噬菌體進行治療時，通常還與抗生素聯(lián)合使用[51]，這樣能減少抗生素的施用時間和劑量，緩解抗生素耐藥菌的發(fā)展和藥物對宿主的不良影響(包括破壞微生物群的平衡)。根據感染部位和類型，噬菌體治療包括：局部、靜脈和口服給藥途徑進行。

局部治療主要涉及：潰瘍、外科傷口或燒傷相關的細菌感染[52]。已有相關報道稱噬菌體治療能有效緩解糖尿病足部潰瘍[53-54]，這種治療方式有效地解決了患者免疫功能受損而不能長期施用抗生素的難題。另外，吸入噬菌體溶液已被證明可在人類[55]和小鼠模型中有效對抗多藥耐藥的細菌性肺部感染[56]。

靜脈注射是治療菌血癥的理想途徑。Speck等[57]的研究表明噬菌體治療是安全有效的，但當噬菌體宿主為革蘭陰性菌時應關注宿主菌可能釋放內毒素導致強烈的免疫反應和過敏反應。此外，在通過靜脈注射噬菌體時，其可能在血液中被免疫細胞清除，Dabrowska[58]的研究證明了這一點。

而口服途徑涉及胃腸轉運，這一過程可能會導致噬菌體失活，但已有相關研究[38,59]結果證明噬菌體可與食物一起服用并經胃腸道后仍有活性。

為了解決以上可能存在的問題，研究人員通過改變噬菌體給藥劑型來實現噬菌體到達感染部位并有效裂解病原菌。包括使用脂質體和轉運體實現噬菌體遞送[60-62]增強噬菌體活性。

4 展望

越來越多的研究表明噬菌體具有應用于人類感染治療的潛力，盡管目前為止沒有統(tǒng)一的噬菌體制劑監(jiān)管標準，但在臨床試驗和同情治療研究中，它們的使用越來越多。另外，如本文所述，在將噬菌體治療應用于人類臨床之前，應保證噬菌體制劑制備的濃度和純度，充分了解噬菌體文庫中每一株噬菌體的生物學特征，并獲得足夠多的動物模型研究數據以充分了解噬菌體治療的有效性、安全性及不良反應，為噬菌體應用于人類病菌感染治療提供更多的參考依據。

另外，值得注意的是，同為天然生物實體的益生菌早在2002年聯(lián)合國糧食及農業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織(Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization, FAO/WHO)就頒布了相關標準用于監(jiān)管生產，那么在研究噬菌體制備時或許也可以適當參考益生菌的生產標準，這樣就能往更符合藥物制劑生產標準的方向靠近。

考慮到目前抗生素耐藥形勢的嚴峻性，噬菌體作為潛在的替代療法應得到更多重視。在研究噬菌體治療時，可靠的噬菌體文庫是必不可少的，因此，此文庫所涉及的文庫構建、噬菌體藥物制備、安全性及有效性評價都應被充分考慮到。更完善且更系統(tǒng)地研究噬菌體制備過程涉及的各個方面、制備時與宿主菌的相互作用機制、施用時與病原菌的相互作用機制及對人體的影響(包括對原駐微生物組的影響及相互作用的機制)等對噬菌體的應用極其重要。因為只有具有全面有效的研究數據才能為噬菌體治療的廣泛應用提供可能。