張艷娟　陳兆亮　郭建坤

稀釋涂布平板法是一種常見的微生物計數(shù)方法，該方法通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)推測樣品中活菌個數(shù)，其原理是將待測樣品稀釋適當倍數(shù)，使樣品中的微生物細胞分散開，再取一定量的稀釋液均勻涂布到固體培養(yǎng)基表面，讓分散開的單個細胞繁殖得到一個菌落，這樣就可以通過肉眼可見的菌落數(shù)推理肉眼不可見的微生物細胞數(shù)。稀釋涂布平板法計數(shù)微生物的計算公式為每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）xM，C代表某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數(shù)。學生對該公式的理解存在多種認知誤區(qū)，導致此類問題得分率低，現(xiàn)結(jié)合典型試題進行分析。

誤區(qū)一 對平均菌落數(shù)的理解

公式中的C不一定是所有實驗所得菌落數(shù)的平均值，為增強實驗說服力和減小實驗誤差，本實驗應設置對照實驗和重復實驗，此實驗的對照實驗是將未涂布菌液的培養(yǎng)基放置在相同條件下培養(yǎng)，其目的是排除培養(yǎng)基污染對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。若空白對照組平板出現(xiàn)菌落，則說明空白對照組的平板被污染，進而推測實驗組平板也可能被污染，這種情況不能直接將實驗組平板的菌落數(shù)取平均值，應重新進行實驗，只有空白培養(yǎng)基沒有出現(xiàn)菌落，實驗結(jié)果才可信，此實驗的重復實驗是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個平板（一般設置3-5個平板），選擇菌落數(shù)在30-300的平板計算平均菌落數(shù)。若重復實驗中某個平板的菌落數(shù)與其他差別甚遠，如四個平板的菌落數(shù)分別為42、200、256、234，菌落數(shù)42與其他數(shù)值差異過大，說明該平板操作過程有誤，則該菌落數(shù)應舍棄，若舍棄后不足三個平板，不能用菌落數(shù)相近的兩個平板取平均值，應找到原因并重做實驗。若計算每克樣品中的某種菌株數(shù)，則C應代表某一稀釋度下平板上生長的符合該菌菌落特征的菌落數(shù)的平均值，培養(yǎng)基上其他菌種形成的菌落數(shù)不能一并計算在內(nèi)。如檢測1L待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目只統(tǒng)計大腸桿菌菌落數(shù)的平均值。

例1 在5個細菌培養(yǎng)基平板上均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣品溶液0.1mL，培養(yǎng)一段時間后，平板上長出的細菌菌落數(shù)分別為13、150、160、170和591，每克土壤樣品中的細菌數(shù)量為____個。

解析 應選擇菌落數(shù)在30-300的平板計算平均菌落數(shù)，舍棄菌落數(shù)為13和591的平板，所以平均菌落數(shù)為（150+160+170）÷3=160，每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）xM=160÷0.1x105=1.6x108個。

誤區(qū)二 對稀釋倍數(shù)的判定

平板中菌落數(shù)過少會導致計數(shù)誤差過大，菌落數(shù)過多又會造成計數(shù)困難，為確保有效活菌數(shù)的準確測定，應合理設定稀釋倍數(shù)。待測樣品中微生物數(shù)量越多，所需稀釋倍數(shù)越大，而微生物數(shù)量越少，所需稀釋倍數(shù)越小，如測定土壤中細菌數(shù)量，一般選用104、105和106倍稀釋；測定放線菌數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋；測定真菌數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋；測定自來水中大腸桿菌數(shù)量，一般不稀釋，直接進行涂布培養(yǎng)。人教版高中生物教材給出的樣品稀釋的流程示范是將10g土樣加入到90mL無菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1mL加入到9mL無菌水中得到稀釋100倍的樣液，依次類推（圖1）。若取6g土樣配制成稀釋10倍的土壤溶液，則土壤占混合液的10%，土壤溶液總量為60mL，應添加54mL的無菌水。若取Ig土樣配制成稀釋100倍的土壤溶液，則土壤占混合液的1%，土壤溶液總量為100mL，應添加99mL的無菌水。

例2 佩戴口罩是預防病原體感染的有效措施之一。使用過的口罩，如果沒有妥善處理會對生態(tài)環(huán)境造成巨大威脅，某科研團隊欲從不同環(huán)境的土壤中篩選出能高效降解一次性口罩（主要成分是聚丙烯纖維）的細菌，請回答下列問題：

（1）運用圖2所示方法對土樣中的細菌計數(shù)，分別在3個平板上滴加0.1mL稀釋液，經(jīng)適當培養(yǎng)后，3個平板上菌落數(shù)分別是65、66和67，則1g土壤中的活菌數(shù)約為____個。

解析 本題的關(guān)鍵是根據(jù)圖示判斷稀釋倍數(shù)，將1g土樣加入到99mL無菌水中，相當于直接將土樣稀釋了100倍，再從稀釋100倍的樣液中取1mL加入到9mL無菌水中得到稀釋1000倍的樣液，到圖中的第四個試管，土樣已經(jīng)被稀釋106倍，則每克樣品中的菌株數(shù)=（C÷V）×M=（65+66+67）÷3÷0.1×106=6.6×108個。

誤區(qū)三 對體積與質(zhì)量的單位換算

微生物計算公式中的V代表涂布平板時所用稀釋液的體積，通常為0.1mL，但若待測樣品中微生物數(shù)目較少，接種0.1mL經(jīng)培養(yǎng)后平板上菌落數(shù)達不到30，可增大接種量（如接種1mL）。試題中經(jīng)常改變涂布平板時所用的稀釋液和所求樣品的體積和質(zhì)量，要注意做好單位換算，如1cm3=103μL=1mL=10-3L體積和質(zhì)量的換算公式是體積=質(zhì)量÷密度（v=m/ρ），水的密度是1g/cm3，則質(zhì)量為1g的水的體積是1cm3即1mL。

例3 牛、羊等反芻動物具有特殊的器官——瘤胃，在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。圖3是研究人員從瘤胃提取物中獲得尿素分解菌的流程。

（1）實驗中初步估測甲瓶中細菌數(shù)為3×106個/mL，若要在每個平板上涂布100μL稀釋后的菌液，且保證每個平板上長出的菌落數(shù)不超過300個，則至少應將甲瓶的菌液稀釋____倍。

解析 1μL等于10-3mL，涂布100μL菌液則涂布0.1mL.設至少應將甲瓶的菌液稀釋X倍，則300÷0.1x10x=3×106，計算可得X=3，即至少應將甲瓶的菌液稀釋103倍。

誤區(qū)四 對統(tǒng)計誤差的分析

從稀釋涂布平板計數(shù)的原理分析，運用該方法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)日低，因為樣品一般不易完全分散成單個細胞，當兩個或多個活細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落，從稀釋涂布平板計數(shù)的過程分析，稀釋倍數(shù)是否合適、涂布是否均勻、培養(yǎng)環(huán)境是否能保證微生物正常生長、計數(shù)是否存在漏計或重復計數(shù)等情況都會影響統(tǒng)計結(jié)果。除此之外，還要考慮培養(yǎng)時間對菌落數(shù)目的影響，菌落數(shù)目需要每隔一段時間統(tǒng)計一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，防止因培養(yǎng)時間不足遺漏菌落的數(shù)目。

例4 中國科學家運用合成生物學方法構(gòu)建了一株嗜鹽單胞菌H，以糖蜜（甘蔗榨糖后的廢棄液，含較多蔗糖）為原料，在實驗室發(fā)酵生產(chǎn)PHA等新型高附加值可降解材料，期望提高甘蔗的整體利用價值，工藝流程如圖4，請回答問題。

（1）為提高菌株H對蔗糖的耐受能力和利用效率，可在液體培養(yǎng)基中將蔗糖作為____，并不斷提高其濃度，經(jīng)多次傳代培養(yǎng)（指培養(yǎng)一段時間后，將部分培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入新配的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)）以獲得目標菌株。培養(yǎng)過程中宜采用____法對樣品中的活菌進行接種和計數(shù)，以評估菌株增殖狀況。若某次取樣中，對菌液稀釋了105倍后，在每個平板上涂布菌液的體積為0.1mL，平板上的平均菌落數(shù)為220個，則菌液中H菌的細胞數(shù)為____個/L.菌落數(shù)目需要每隔一段時間統(tǒng)計一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果，這樣做的目的是____。

解析 該研究的目的是提高菌株H對蔗糖的耐受能力和利用效率，結(jié)合微生物的代謝需求，其液體培養(yǎng)基應該以蔗糖作為唯一碳源。稀釋涂布平板法可以用于統(tǒng)計樣品中的活菌數(shù)目，菌液中H菌的細胞數(shù)=（C÷V）×M=220÷0.1×105=2.2×108個/mL=2.2×1011個/L.選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的記錄作為結(jié)果是為了防止因培養(yǎng)時間不足而導致遺漏菌落數(shù)目，增加實驗結(jié)果的可信度。

基金項目：河北省教育科學“十四五”規(guī)劃課題“基于核心素養(yǎng)的高中生物學深度學習研究”階段性成果，No。2103372）

（收稿H期：2024-02-03）