董書(shū)言 邢志 尹苗 王堯 周雅莉 黃旭升 王超 王計(jì)平 李潤(rùn)植

摘 要 本文基于紫蘇基因組數(shù)據(jù)篩選獲得兩條 PfPAH1基因序列，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2。應(yīng)用生物信息學(xué)工具分析PfPAH1s蛋白理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化。定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè) PfPAH1s在紫蘇根、莖、葉、花及不同發(fā)育時(shí)期種子的表達(dá)譜。進(jìn)一步克隆到高表達(dá)的 PfPAH1-1基因的編碼序列并進(jìn)行煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化以鑒定其功能。結(jié)果表明， PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因的開(kāi)放閱讀框（ORF）長(zhǎng)度均為2 715 bp，編碼904個(gè)氨基酸殘基，含有Lipin_N 、Lipin_mid 和屬于HAD_like超家族的LNS2 三個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示紫蘇PfPAH1-1蛋白與唇形科植物一串紅的SsPAH1親緣關(guān)系最近，其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白則與唇形科的芝麻SiPAH1親緣關(guān)系最近，其次為油橄欖，紫蘇和芝麻均為油料作物，推測(cè)PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因均在開(kāi)花后40 d種子中表達(dá)量最高，預(yù)示著其可能參與油脂合成積累。煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化揭示過(guò)表達(dá) PfPAH1-1基因煙草葉片總脂肪酸及中性脂含量均高于野生型煙草，然而磷脂含量降低。

關(guān)鍵詞 紫蘇；磷脂酸磷酸水解酶；基因克隆；表達(dá)特性；煙草瞬時(shí)表達(dá)

紫蘇（Perilla frutescens （L.） Britt.）屬唇形科紫蘇屬1 a生草本植物，是一種傳統(tǒng)的藥食同源植物，在亞洲東部國(guó)家，特別是中國(guó)、韓國(guó)和日本廣泛種植［1］。 紫蘇種子出油率高達(dá)46%～58%，不飽和脂肪酸含量豐富（>種子中總含油量的90%），特別是α-亞麻酸含量（約60.7%）遠(yuǎn)高于大豆（5%～13%）、油菜（1%～8%）、玉米? （0.5%～2%）、向日葵? （0.5%～2.0%）等油料作物［2］。極低的ω-6/ω-3 FAs（linoleic acid/alpha-linolenic acid）比率（0.2∶1）使紫蘇油成為人類飲食中植物油的理想來(lái)源。此外，紫蘇油還可用于制作干燥油漆、清漆、油墨等［3］。因此，紫蘇作為一種多用途經(jīng)濟(jì)作物，在制藥、食品及工業(yè)等方面具有潛在的應(yīng)用前景。

植物細(xì)胞中，甘油脂合成具有兩條完全獨(dú)立的途徑，即真核途徑和原核途徑［4］。磷脂酸（PA，phosphatidic acid）是所有甘油酯從頭合成的共同前體物［5］。PA由甘油-3-磷酸（glycerol-3- phosphate，G3P）途徑合成，在磷脂酸磷酸水解酶（PAP/PAH，phosphatidic acid phosphatase/phosphatidic acid hydrolase）作用下生成二酰甘油（DAG，diacylglycerol）進(jìn)而合成三酰甘油（TAG，triacylglycerol）［6-7］，或由胞苷二磷酸-二脂酰甘油合酶（CDS，cytidinedi phosphate-diacylglycerol synthase）催化形成胞苷二磷酸-二脂酰甘油（CDP-DAG，cytidinediphosphatediacylglycerol），進(jìn)一步合成磷脂酰肌醇 （PI，phosphatidylinositol）、磷脂酰甘油（PG，phosphatidylglycerol）和磷脂酰絲氨酸（PS，phosphatidylserine）［4］。此外，PA經(jīng) PAP/PAH催化合成的DAG可經(jīng)核苷酸途徑形成磷脂酰膽堿（PC，phosphatidylcholine）及磷脂酰乙醇胺（PE，phosphatidylethanolamine），也可通過(guò)連續(xù)催化反應(yīng)合成半乳糖脂及硫代異鼠李糖甘油二酯（SQDG，sulfoquinovosyldiacylglycerol）［5］。因此，細(xì)胞中的PA及DAG含量的變化能夠影響細(xì)胞膜脂質(zhì)的合成代謝，同時(shí)DAG也是連接油脂和膜脂的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，可以直接調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)油脂、膜脂的? 平衡。

植物中含有多種磷脂酸水解酶異構(gòu)體，這些酶的代謝功能一直是脂質(zhì)代謝研究的焦點(diǎn)［7］。PAP作為調(diào)控生物體內(nèi)PA和DAG含量的關(guān)鍵酶，根據(jù)其催化特性分為PAP1/PAH和PAP2/LPP，其中PAP1包括酵母Pah1p、植物PAH1、PAH2和動(dòng)物的Lipin 1～3。Reitman［8］研究表明Lipin 1過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠體內(nèi)TAG含量升高，體質(zhì)量增加；Han等［9］指出酵母PAH1與甘油酯合成有關(guān)，其 pah1Δ突變體中PA含量高于野生型植株，DAG和TAG含量較野生型減少；Mietkiewska等［10］將擬南芥PAH和油菜PAH在酵母 pah1Δ突變體中表達(dá)能夠在突變體酵母中重新合成TAG；Wang等［11］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥? Δ pah1 ?pah2雙突變體中PA、PC、PE、PI等磷脂含量較野生型顯著升高，雙半乳糖二脂酰甘油（DGDG）及糖脂單半乳糖二脂酰甘油（MGDG）低于野生型。目前，PAH在酵母中已被純化［12］，動(dòng)物L(fēng)ipin也得到較為廣泛的研究［5］，而有關(guān)植物PAH的研究報(bào)道相對(duì)較少。

本研究基于從紫蘇基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定獲得 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因序列，分析其基本理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR研究 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)特異性；對(duì)表達(dá)量較高的 PfPAH1-1基因進(jìn)行分子克隆，獲得完整編碼的CDS序列，并通過(guò)侵染野生煙草（Nicotiana tobaccum，Sumsun NN（SNN））葉片，瞬時(shí)表達(dá)目的基因，研究過(guò)表達(dá) PfPAH1-1基因的煙草脂質(zhì)組成變化，為深入探討紫蘇 PfPAH1-1基因在脂質(zhì)代謝中的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫蘇及煙草種子由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所保存。于2020年5月將紫蘇種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)基地，在適宜時(shí)期取其根、莖、葉、花及開(kāi)花后不同發(fā)育時(shí)期（開(kāi)花后10 d、20 d、30 d、40?? d）的種子，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。煙草置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，光照時(shí)間16?? h，光照度15 000? lx）。

1.2紫蘇 PfPAH1基因篩選及鑒定

以擬南芥AtPAH1（NP_001118604.1）蛋白序列為檢索序列，利用BioEdit軟件在紫蘇基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源比對(duì)，通過(guò)ORF（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）及CDD功能結(jié)構(gòu)域（Conserved Domains Datebase，http：//ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/Wrpsb.cgi）分析比對(duì)，篩選獲得紫蘇PAH1基因序列。

1.3 ?PfPAH1基因生物信息學(xué)分析

通過(guò)GSDS（Gene Structure Display Server，http：//gsds.gao-lab.org/index.php）在線軟件分析紫蘇 PfPAH1基因外顯子、內(nèi)含子分布情況；利用在線ExPasy網(wǎng)站中的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protgaram）分析 PfPAH1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用在線軟件TMHMM Server v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）、Signal 4.1（www.cbs.dtu.dk/services/Signal P-4.1/）和PSORTⅡ（https：//psort.hgc.jp/form2.html）對(duì)紫蘇PfPAH1蛋白的跨膜區(qū)域、信號(hào)肽切割位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)；依據(jù)SOPMA（http：//npsa- pr abi. ibcp.fr/cgi-bin/nspa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）分析PfPAH1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；通過(guò)在線軟件SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）對(duì)PfPAH1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析與同源建模；用Jalview軟件將紫蘇 PfPAH1氨基酸序列與其他物種進(jìn)行多序列比對(duì)；運(yùn)用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法（neighbor-joining，即N-J法）構(gòu)建紫蘇PfPAH1蛋白與其他物種PAH1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.4 ?PfPAH1基因的表達(dá)特性分析

采用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（RN09，北京艾德萊生物科技有限公司）提取紫蘇根、莖、葉、花及花后不同發(fā)育時(shí)期種子的RNA，并用核酸濃度儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量；用StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒（A222-10，北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

利用Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR特異性引物 PfPAH1-qPCR-F/R（表1）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR以 ?18S rRNA作為內(nèi)參基因，使用TaKaRa公司的TB Green○R Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus）試劑盒，通過(guò)CFX 96TM Optics Module實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（BIO-RAD）檢測(cè) PfPAH1基因在紫蘇不同組織器官中的表達(dá)模式。反應(yīng)體系為10?? μL，包含TB Green Premix Ex TaqTM? Ⅱ 5? μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA 0.8 μL；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性5 s，57 ℃退火34 s，共40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后升溫至95 ℃進(jìn)行溶解曲線分析。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.5 ?PfPAH1-1基因的克隆

以篩選比對(duì)出的 PfPAH1-1基因CDS序列為模板，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物 PfPAH1-1-ORF-F/R（表1）。參考TOYOBO公司的KOD-Plus-Neo說(shuō)明書(shū)，使用KOD酶（KOD DNA polymerase）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為50 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各1.5 μL，10×Pfu Buffer?? 5 μL，dNTP（2 mmol/L）5 μL，MgSO4（25?? mmol/L）2 μL，KOD- Plus-Neo 1 μL，dd H2O?? 32 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸2 min 30 s，循環(huán)35次；68 ℃終延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，將檢測(cè)正確的產(chǎn)物純化回收并連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取單克隆進(jìn)行PCR鑒定篩選陽(yáng)性克隆，送至北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.6 植物表達(dá)載體構(gòu)建及煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化

設(shè)計(jì)帶有XbaⅠ和KpnⅠ酶切位點(diǎn)的引物 PfPAH1-1-1303-F和 PfPAH1-1-1303-R（表1），擴(kuò)增 PfPAH1-1基因目的片段，同時(shí)對(duì)pCAMBIA1303載體（圖1-A）進(jìn)行雙酶切。采用Vazyme公司的ClonExpress○R Ultra One Step Cloning Kit克隆得到過(guò)表達(dá)重組質(zhì)粒pCAMBIA1303+ PfPAH1-1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，侵染煙草葉片（圖1-B），于2 d后取部分樣品提取RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，驗(yàn)證目的基因是否成功轉(zhuǎn)入，5 d后取剩余樣品真空冷凍干燥備用。

1.7 總脂肪酸含量測(cè)定及脂質(zhì)組成分析

總脂提取：稱取50 mg樣品粉末置于50 mL離心管中，加入4 mL甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液，37 ℃抽提4 h，4 000 r/min離心10 min后吸取上清液，并向剩余樣品沉淀中繼續(xù)加入甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液3.5 mL，提取? 2 h，4 000 r/min離心10 min收集上清，再次加入7.5 mL甲醇∶氯仿（V∶V，2∶1）混合液抽提? 12 h，4 000 r/min離心10 min；合并3次所得上清液于干凈的50 mL離心管，加入1％NaCl溶液和氯仿溶液，使得最終氯仿∶甲醇∶水（V∶V∶V）為? 2∶2∶1.8，充分混勻，離心吸取下層有機(jī)相至已稱量的玻璃管中。經(jīng)氮吹儀吹干后稱量管質(zhì)量，每個(gè)樣品3次重復(fù)。

總脂肪酸含量=（提取后管質(zhì)量-提取前管質(zhì)量）/樣品質(zhì)量。

脂質(zhì)分級(jí)：以一定體積的氯仿∶甲醇 （V∶V=1∶1）溶解上述已稱量的總脂，利用Cleanert Silica固相萃取小柱（Agela/博納艾杰爾科技有限公司，天津）進(jìn)行脂質(zhì)分級(jí)。先用1 mL氯仿活化硅膠柱，上樣。用10 mL氯仿洗脫得到中性脂，再用10 mL丙酮洗脫得到糖脂，最后用10 mL甲醇洗脫得到磷脂，收集每一組分于已稱量的玻璃管中，氮吹儀吹干至恒量，計(jì)算不同脂類組分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫蘇 PfPAH1基因的鑒定與結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥AtPAH1蛋白序列為檢索序列，在紫蘇基因組及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，通過(guò)ORF及CDD數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)一步分析，篩選獲得2個(gè)紫蘇 PfPAH1基因序列，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2。蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，PfPAH1-1和PfPAH1-2均含有3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別為L(zhǎng)ipin_N結(jié)構(gòu)域、Lipin_mid結(jié)構(gòu)域和屬于HAD_like（haloacid dehalogenase-like）超家族的LNS2結(jié)構(gòu)域（圖2-A）；基因結(jié)構(gòu)分析顯示（圖2-B）， PfPAH1-1基因含有8個(gè)內(nèi)含子和9個(gè)外顯子， PfPAH1-2基因含有9個(gè)內(nèi)含子和10個(gè)外顯子，與擬南芥和芝麻PAH1基因的內(nèi)含子、外顯子分布相似。

2.2 紫蘇 PfPAH1基因編碼蛋白的序列特征

通過(guò)ProtParam軟件預(yù)測(cè)分析（表2）表明：紫蘇 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因編碼氨基酸數(shù)為904，編碼蛋白的分子式分別為C4 375H6 819N1 191O1 419S32，分子質(zhì)量分別為? 10.08? ku和9.98? ku，理論等電點(diǎn)pI 分別為4.73和4.96，二者親疏水性系數(shù)均小于0，預(yù)測(cè)其為親水性水性蛋白質(zhì)。

采用TMHMM Server v2.0、Signal 4.1軟件對(duì)紫蘇PfPAH1蛋白的跨膜區(qū)域及信號(hào)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明（圖3）紫蘇PfPAH1蛋白無(wú)跨膜區(qū)域，且無(wú)信號(hào)肽存在，推測(cè)其為非分泌性蛋白。運(yùn)用SOPMA軟件對(duì)PfPAH1蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：紫蘇PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4種元件組成，PfPAH1-1包含無(wú)規(guī)則卷曲56.08%，α-螺旋23.01%，直鏈延伸16.37%，β-轉(zhuǎn)角4.54%；PfPAH1-2包含無(wú)規(guī)則卷曲56.75%，α-螺旋? 22.9%，直鏈延伸15.93%，β-轉(zhuǎn)角4.42%，推測(cè)無(wú)規(guī)則卷曲和α-螺旋為PfPAH1蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件。

通過(guò)SWISS-MODEL數(shù)據(jù)庫(kù)采用同源建模的方法預(yù)測(cè)紫蘇PfPAH1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖4所示，選擇6tzy.2［13］蛋白作為模板蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)果顯示：PfPAH1-1、PfPAH1-2蛋白與模板蛋白6tzy.2的序列覆蓋度分別為36.75%和35.05%，保守序列范圍分別為589～876 aa和578～878 aa。PfPAH1蛋白與模板蛋白均由一條多肽鏈（nuclear elongation and deformation protein：A）構(gòu)成，模板蛋白含有2個(gè)CA配體，而PfPAH1-1和PfPAH1-2蛋白僅含有1個(gè)CA? 配體。

2.3 PAH1蛋白氨基酸多序列比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過(guò)Jalview對(duì)紫蘇、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、芝麻（Sesamum indicum）、油橄欖?? （Olea europaea）、一串紅（Salvia splendens）的PAH1蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)（圖5-A）。分析可知，紫蘇PfPAH1蛋白存在已公布植物PAH1蛋白序列中的DXDX（T/V） 催化模體 ［14］，該序列在這些物種中高度保守，由此推斷DXDX（T/V）結(jié)構(gòu)域在PAH1蛋白中發(fā)揮重要功能。利用MEGA 7.0軟件對(duì)紫蘇PfPAH1蛋白和擬南芥、芝麻、煙草（Nicotiana tomentosiformis）和油橄欖等植物的PAH1 蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖5-B所示，紫蘇PfPAH1-1 蛋白與一串紅聚為一支，同屬唇形科植物，與葡萄、芥菜等其他物種關(guān)系較遠(yuǎn)，其進(jìn)化基本符合植物進(jìn)化分類，PfPAH1-2蛋白與芝麻SiPAH1親緣關(guān)系最近，其次為油橄欖，與山崳菜屬、辣椒等親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)紫蘇 PfPAH1-2基因的功能可能與芝麻SiPAH1基因相似。

2.4 ?PfPAH1基因在紫蘇不同組織中的表達(dá)? 特性

由圖6可知，? PfPAH1-1基因在紫蘇根、莖、葉、花及種子中均有表達(dá)，根中表達(dá)量顯著高于其他組織；該基因表達(dá)量在不同發(fā)育時(shí)期種子中存在顯著差異，隨著種子的成熟呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，開(kāi)花后20? d種子中的表達(dá)量最低，40? d表達(dá)量達(dá)到最高，是開(kāi)花后20 d表達(dá)量的3.2倍； PfPAH1-2基因在紫蘇根、莖、葉、花及開(kāi)花后10 d的種子中幾乎不表達(dá)，且隨著種子的成熟表達(dá)量逐漸增加，但與 PfPAH1-1基因相比表達(dá)均較低。王計(jì)平等［15］研究表明，紫蘇種子脂肪酸積累在開(kāi)花后40 d達(dá)到高峰，據(jù)此推測(cè) PfPAH1-1基因高表達(dá)可能與紫蘇種子脂質(zhì)合成代謝過(guò)程相關(guān)。

2.5 ?PfPAH1-1基因的克隆

以紫蘇各組織cDNA 混樣為模板，根據(jù)表達(dá)量高的 PfPAH1-1基因全長(zhǎng)ORF序列設(shè)計(jì)克隆引物（表1），使用KOD高保真酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將得到的目的片段經(jīng)純化、回收后連接到pMD18-T載體上，得到重組質(zhì)粒pMD18-T+PfPAH1-1，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)。挑取單克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)在2 000 bp以上得到1條特異性條帶，經(jīng)測(cè)序分析該序列與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)結(jié)果一致，未發(fā)生突變，表明成功分離得到 PfPAH1-1基因（圖7）。

2.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

利用XbaⅠ和KpnI對(duì)重組質(zhì)粒pCAMBIA1303+ PfPAH1-1進(jìn)行雙酶切，以空載作為對(duì)照。雙酶切后得到的目的基因條帶，長(zhǎng)度大小為2 715 bp，與 PfPAH1-1序列長(zhǎng)度大小一致，結(jié)果表明，植物表達(dá)載體pCAMBIA1303+ PfPAH1-1構(gòu)建成功（圖8-A）。菌液PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，在2 715 bp處有目的條帶（圖8-B），表明目的基因 PfPAH1-1成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

2.7 瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片脂質(zhì)含量分析

農(nóng)桿菌瞬時(shí)侵染2 d后，取煙草葉片提取總RNA，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè) PfPAH1-1基因是否有效表達(dá)，結(jié)果表明（圖9），瞬時(shí)轉(zhuǎn)化后的煙草葉片中目的基因

PfPAH1-1正常轉(zhuǎn)錄形成 mRNA。

取瞬時(shí)侵染5 d后的煙草葉片分析紫蘇 PfPAH1-1基因瞬時(shí)表達(dá)對(duì)煙草葉片各脂質(zhì)含量的影響。結(jié)果如圖10所示，野生煙草（WT）葉片中總脂肪酸占葉片干質(zhì)量的15.29%，轉(zhuǎn) pCAMBIA1303空載（EV）的煙草葉片中總脂肪酸占葉片干質(zhì)量（DW）的15.30%，而轉(zhuǎn) PfPAH1-1基因煙草葉片中總脂肪酸的含量為17.35%（占葉片干質(zhì)量），總脂肪酸含量顯著上升。分析其脂質(zhì)組成發(fā)現(xiàn)， PfPAH1-1基因瞬時(shí)表達(dá)煙草葉片中糖脂含量沒(méi)有明顯變化，約占葉片干質(zhì)量的? 3.55%～3.56%，磷脂含量較WT下降0.3%（占葉片干質(zhì)量），而中性脂含量提高1.86%（占葉片干質(zhì)量）。

3 討? 論

紫蘇作為一種多用途經(jīng)濟(jì)作物，因其含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及種子含油量和不飽和脂肪酸含量較高，越來(lái)越引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，是目前深海魚(yú)油的良好替代產(chǎn)品。三酰甘油（TAG）是油料作物種子油脂的主要貯存形式，PAH是TAG合成途徑中的關(guān)鍵酶，其介導(dǎo)反應(yīng)的底物PA是脂核苷酸CDP-DAG合成的直接前體，產(chǎn)物DAG是TAG合成的直接前體，這些脂質(zhì)中間體的代謝失調(diào)是導(dǎo)致脂質(zhì)性疾病產(chǎn)生的根本［16-17］。有研究表明，PAH 活性依賴于鹵代酸脫鹵酶樣結(jié)構(gòu)域（HAD_like）的DXDX（T/V）催化模體［9，17-18］。釀酒酵母PAH1 DXDX（T/V） 催化模體上的天冬氨酸D398和D400兩個(gè)位點(diǎn)同時(shí)突變時(shí)，其活性將降低99.9%以上［9］。本研究在紫蘇中鑒定獲得兩個(gè)編碼904個(gè)氨基酸殘基的 PfPAH1-1和 PfPAH1-2基因，均包含HAD_like 結(jié)構(gòu)域，同時(shí)具有PAH 特有的活性位點(diǎn)DXDX（T/V），且序列（DVDGT）與擬南芥、芝麻等已公布的植物相同，表明PfPAH1-1和PfPAH1-2能夠催化其蛋白質(zhì)功能。序列特征分析表明紫蘇PfPAH1蛋白無(wú)轉(zhuǎn)運(yùn)肽或跨膜區(qū)域，與Eastmond等［14］和Santos-Rosa等［19］研究結(jié)果? 一致。

Zimmermann等［20］分析擬南芥PAH1（At3G09560）基因表達(dá)譜顯示， 該基因在擬南芥各組織器官和不同發(fā)育階段種子中均有表達(dá)，并在成熟期的種子中表達(dá)量達(dá)到最高；Eastmond等［14］對(duì)擬南芥 [QX（Y15]PAH1的qRT-PCR 分析表明，該基因在幼苗、葉、根、莖、花中都有表達(dá)，在不同發(fā)育時(shí)期種子中的表達(dá)呈先降后升的趨勢(shì)，且在成熟種子中的表達(dá)量顯著高于其他組織；Nakamura等［21］研究結(jié)果表明PAH基因在擬南芥不同發(fā)育時(shí)期的花中均有表達(dá)。本試驗(yàn)分析了紫蘇 PfPAH1基因的時(shí)空表達(dá)模式，表明 PfPAH1-1在紫蘇各組織中均有表達(dá)，隨著種子的成熟， PfPAH1-1表達(dá)量先下降后升高，在種子發(fā)育前期（開(kāi)花后20 d）表達(dá)量最低，隨后逐漸升高，成熟種子中（開(kāi)花后40?? d）表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期； PfPAH1-2基因在紫蘇不同組織中表達(dá)量均較低。推測(cè)在紫蘇脂質(zhì)合成代謝調(diào)控過(guò)程中 PfPAH1-1起主導(dǎo)作用，且在發(fā)育中期（開(kāi)花后? 20 d、30 d）種子中可能更多參與以PA為底物合成PI及PG的反應(yīng)，而后在TAG及磷脂合成過(guò)程中同時(shí)發(fā)揮作用［4］。

PAH將PA轉(zhuǎn)化為DAG以提供磷脂和TAG生物合成的底物，是甘油酯組裝的重要步驟［22］。在釀酒酵母的研究中， pah1Δ突變體中磷脂生物合成相關(guān)基因（INO1、INO2、OPI）表達(dá)上調(diào)，磷脂水平增加，但DAG、TAG水平明顯下降，相反，PAH1的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致磷脂生物合成基因表達(dá)被抑制，磷脂生物合成受到損害，但可有效加強(qiáng)釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的油脂合成［9，19，23-24］；在植物中，擬南芥Δpah1 pah2雙突變體中含有的磷脂是野生型的2倍，編碼磷脂合成的幾種關(guān)鍵酶基因均被上調(diào)，且總脂肪酸含量降低15%［14，25］。為進(jìn)一步分析紫蘇 PfPAH1-1基因的功能，本研究通過(guò)農(nóng)桿菌侵染法將目的基因在煙草葉片中瞬時(shí)表達(dá)，測(cè)定瞬時(shí)表達(dá)后煙草葉片中各脂質(zhì)組分的含量，結(jié)果表明，轉(zhuǎn) PfPAH1-1基因煙草葉片中的總脂肪酸含量顯著升高，其脂質(zhì)組成也有所變化，其中中性脂水平提高，磷脂含量降低，而糖脂含量基本不變。由此推測(cè)，紫蘇 PfPAH1-1基因瞬時(shí)表達(dá)有效加強(qiáng)了TAG合成途徑中磷脂PA向DAG的轉(zhuǎn)變，中性脂水平升高；而該基因過(guò)表達(dá)可消耗磷脂合成底物PA，使得磷脂合成過(guò)程受阻，降低磷脂含量，結(jié)合前人研究結(jié)果，這一現(xiàn)象也可能與磷脂合成酶基因表達(dá)降低有關(guān)。在植物的長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，改變膜脂組分是植物適應(yīng)逆境脅迫的重要途徑［26］。其中，甘油酯是膜脂質(zhì)的主要成分，膜甘油脂由附著在sn-1和sn-2位置的兩種疏水性脂肪酸及甘油主鏈sn-3位置上的磷（磷脂）或糖（糖脂）分子組成［27］。 PfPAH1-1基因在煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)可引起煙草葉片中膜脂組分的變化，因此推測(cè)其在響應(yīng)植物逆境脅迫中可能具有一定調(diào)控作用。

4 結(jié)? 論

以擬南芥AtPAH1蛋白序列為參考序列，鑒定得到2個(gè)紫蘇 PfPAH1基因，分別命名為 PfPAH1-1和 PfPAH1-2，對(duì)其序列特征和表達(dá)特性進(jìn)行分析。通過(guò)RT-PCR技術(shù)成功獲得組織中高表達(dá)紫蘇 PfPAH1-1基因的cDNA克隆，并初步探討了該基因在煙草中異源表達(dá)對(duì)煙草脂質(zhì)組成的影響，為深入研究 PfPAH1-1基因在植物油脂合成積累中的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時(shí)為通過(guò)基因工程手段改變紫蘇及其他油料作物的脂質(zhì)組分提供有益基因元件。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ HOU T，NETALA VR，ZHANG H，et al.Perilla frutescens：A rich source of pharmacological active compounds［J］.Molecules，2022 ，27（11）：3578.

［2］ LIAO B N，HAO Y J，LU J X，et al.Transcriptomic analysis of Perilla frutescens seed to insight into the biosynthesis and metabolic of unsaturated fatty acids［J］.BMC Genomics，2018，19（1）：213.

［3］ PARK H，SA K J，HYUN D Y，et al.Identifying SSR markers related to seed fatty acid content in Perilla crop （Perilla frutescens L.）［J］.Plants-Basel，2021 ，10（7）：1404.doi：10.3390/plants10071404.

［4］ PRANNESHRAJ V，SANGHA M K，DJALOVIC I，et al.Lipidomics-Assisted GWAS （lGWAS） approach for improving high-temperature stress tolerance of crops［J］.International Journal of Molecular Sciences，2022，23（16）：9389.

［5］ 李一路，張晴晴，胡衛(wèi)芹，等.磷脂酸磷酸酶在脂質(zhì)代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用及其調(diào)控［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（6）：897-904.

LI Y L，ZHANG Q Q，HU W Q，et al.Roles and regulation of phosphatidic acid phosphatase in lipid metabolism and signaling［J］.Plant Physiology Journal，2017，53（6）：897-904.

［6］ COOK R，LUPETTE J，BENNING C.The role of chloroplast membrane lipid metabolism in plant environmental responses［J］.Cells，2021，10（3）：706.

［7］ BATES，PHILIP D.Understanding the control of acyl flux through the lipid metabolic network of plant oil biosynthesis［J］.Biochim Biophys Acta，2016：1214-1225.

［8］ REITMAN M L.The fat and thin of lipin［J］.Cell Metabolism，2005，1（1）：5-6.

［9］ HAN G S，SINIOSSOGLOU S，CARMAN G M.The cellular functions of the yeast lipin homolog Pah1p are dependent on its phosphatidate phosphatase activity［J］.Journal of Biological Chemistry，2007，282（51）：26-35.

［10］ MIETKIEWSKA E，SILOTO R M，DEWALD J，et al.Lipins from plants are phosphatidate phosphatases that restore lipid synthesis in a? [QX（Y15]pah1Δ? mutant strain of? Saccharomyces cerevisiae［J］.The FEBS Journal，2011，? 278（5）：764-775.

［11］ WANG L，KAZACHKOV M，SHEN W，et al.Deciphering the roles of Arabidopsis LPCAT and PAH in phosphatidylcholine homeostasis and pathway coordination for chloroplast lipid synthesis［J］.Plant Journal，2015， 80（6）： 65-76.

［12］ 柏 楊，章文華.二酰甘油從頭合成途徑的關(guān)鍵酶及其功能［J］.植物生理學(xué)報(bào)，2018，54（12）：1763-1773.

BAI Y，ZHANG W H.Key enzymes for de novo synthesis of diacylglycerol in plant cells［J］.Plant Physiology Journal，2018，54 （12）：1763-1773.

［13］ KWIATEK J M，HAN G S，CARMAN G M.Phosphatidate-mediated regulation of lipid synthesis at the nuclear/endoplasmic reticulum membrane［J］.Biochimicaet Biophysica Acta （BBA） - Molecular and Cell Biology of Lipids，2020，1865（1）：158434.

［14］ EASTMOND P J，QUETTIER A L，KROON J T M，et al.Phosphatidic acid phosphohydrolase 1 and 2 regulate phospholipid synthesis at the endoplasmic reticulum in Arabidopsis［J］.The Plant Cell，2010，22（12）：4216.

［15］ 王計(jì)平，張玲慧，趙 靜，等.紫蘇種子脂肪酸代謝及關(guān)鍵酶基因調(diào)控油脂合成規(guī)律的研究［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2016，31（3）：91-95.

WANG J P，ZHANG L H，ZHAO J，et al.Regulation of controlling oil synthesis by fatty acid metabolism of? Perilla seed and key enzyme gene［J］.Journal of the Chinese Cereals and Oils Association，2016，31（3）：91-95.

［16］ DEY P，HAN G S，CARMAN G M.A review of phosphatidate phosphatase assays-science direct［J］.Journal of Lipid Research，2020，61（12）：1556-1564.

［17］ KHAYYO V I，HOFFMANN R M，WANG H，et al.Crystal structure of a lipin/Pah phosphatidic acid phosphatase［J］.Nature Communications，2020，11（1）：1309.

［18］ ?PETERFY M，PHAN J，XU P，et al.Lipodystrophy in the fld mouse results from mutation of a new gene encoding a nuclear protein，lipin［J］.Nature Genetics，2001，27（1）：121-124.

［19］ SANTOS-ROSA H，LEUNG J，GRIMSEY N，et al.The yeast lipin Smp2 couples phospholipid biosynthesis to nuclear membrane growth［J］.The Embo Journal，2005， 24（11）：31-41.

［20］ ZIMMERMANN P，HIRSCH-HOFFMANN M，HENNIG L，et al.Arabidopsis microarray database and analysis toolbox［J］.Plant Physiology，2004，136（1）：21-32.

［21］ NAKAMURA Y，TEO N Z W，SHUI? G H，et al.Transcriptomic and lipidomic profiles of glycerolipids during Arabidopsis? flower development［J］.The New Phytologist，2014，203（1）：10-22.

［22］ CARMAN G M，HENRY S A.Phosphatidic acid plays a central role in the transcriptional regulation of glycerophospholipid synthesis in Saccharomyces cerevisiae［J］.The Journal of Biological Chemistry，2007，282（52）：37293-37297.

［23］ HAN G S，WU W I，CARMAN G M.The Saccharomyces cerevisiae? lipin homolog is a Mg2+-dependent phosphatidate phosphatase enzyme［J］.The Journal of Biological Chemistry，2006，281（14）：9210-9218.

［24］ 張昕昱，周海龍，李麗麗，等.磷脂酸磷酸酶在釀酒酵母中的過(guò)表達(dá)及表型分析［J］.大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2020， 39（2）：5.

ZHANG X Y，ZHOU H L，LI L L，et al.Expression of phosphatidate phosphatase in Saccharomyces cerevisiae strain and the phenotype analysis［J］.Joural of Dalian Polytechnic University，2020，39（2）：5.

［25］ CRADDOCK C P，ADAMS N，BRYANT F M，et al.Phosphatidic acid phosphohydrolase regulates phosphatidylcholine biosynthesis in Arabidopsis by phosphatidic acid-mediated activation of CTP：phosphocholine cytidylyltransferase activity［J］.Plant Cell，2015，27（4）：1251-1264.

［26］ 齊凌云.葉片膜脂組成變化與耐低氮脅迫的關(guān)系［D］.陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

QI L Y.The relationship between the leaf lipid composition changes and nitrogen-deficiency tolerance［D］.Yangling Shannxi：Northwest A&F University，2017.

［27］ YU L，ZHOU C，F(xiàn)AN J，et al.Mechanisms and functions of membrane lipid remodeling in plants［J］.The Plant Journal，2021，107（1）：37-53.

Identification and Functional Analysis of Phosphatidic Acid

Phosphohydrolase Gene （ PfPAH1） from Perilla frutescens

Abstract This enzymatic process plays an important role in plant lipid metabolism.? In this study，two? PfPAH1 genes （? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2） were retrieved from the perilla genome database.Bioinformatics tools were used to analyze the physicochemical properties，functional domains and phylogenetic tree of PfPAH1? proteins.? Quantative PCR （qRT-PCR） was employed to examine the expression profiles of the? PfPAH1 genes? in perilla roots，stems，leaves，flowers and seeds at different development stages. The coding sequence of the highly-expressed? PfPAH1-1 gene was cloned and and further used for transient transformation in tobacco to characterize? PfPAH1-1 function. The results showed that the? open reading frame （ORF） of? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2 gene sequences? were 2 715 bp in length，encoding 904 amino acid residues. The PfPAH1 protein contained three conservative domains（ Lipin_N，Lipin_mid and LNS2） the typical characteristics of? the HAD_like superfamily. Phylogenetic tree?? analysis indicated that? PfPAH1-1 protein exhibited the closest genetic relationship with? SsPAH1 from Salvia splendens of Labiatae，followed by PAH1s from Vitis vinifera and Capsella rubella，Similarly，PfPAH1-2 protein demonstrated the closest genetic relationship with? SiPAH1 from Sesamum indicum of Labiatae，followed by PAH1s from Olea europaea and Capsicum annuum. This suggested that? PfPAH1-2 and? ?SiPAH1? genes，which have similar functions，are present in oil crops from the same family. qRT-PCR analysis indicated that the highest expression levels of? PfPAH1-1 and? PfPAH1-2 genes were detected in the developing seeds at 40 days after flowering，suggesting their crucial role in lipid biosynthesis. The evaluation of transiently transformed tobacco plants showed higher contents of total fatty acids and neutral lipids? in the? PfPAH1-1 transgenic leaves compared to wild tobacco leaves，while the content of phospholipids was lower in the transgenics.

Key words Perilla frutescens; Phosphatidic acid phosphohydrolase （PAH1）; Gene cloning; Expression characteristics; Transient expression