張洋紅 李爽 陳昊偉 李佳 徐繼忠

關(guān)鍵詞：蘋果輪紋病：白藜蘆醇；轉(zhuǎn)錄組；差異表達基因

蘋果屬于薔薇科蘋果屬，是我國主要的栽培果樹之一，同時，我國也是蘋果的原生地之一，在蘋果屬35個種中，有24個種原生于我國。我國是世界上最大的蘋果生產(chǎn)和消費國，蘋果種植面積和產(chǎn)量均超過世界總量的50%，但出口量極低，僅占2.5%。而影響蘋果產(chǎn)量和品質(zhì)的重要病害之一就是蘋果輪紋病（apple ring rot），該病危害果實和枝干，嚴(yán)重時甚至造成幼樹枯死等，嚴(yán)重制約我國蘋果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前對蘋果輪紋病的防治主要以化學(xué)防治為主，但大量使用化學(xué)農(nóng)藥，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，而且危害人體健康和環(huán)境。因此，需要在研究蘋果抗病機制的基礎(chǔ)上，挖掘抗病基因，選育抗病品種，開發(fā)植物源藥劑，以對蘋果輪紋病進行綜合防治。

白藜蘆醇（resveratrol）是一種天然多酚類物質(zhì)，是植物體在抵御惡劣環(huán)境或病原侵害時分泌的一種抗毒素，主要存在于葡萄、花生和虎杖等植物中。目前，白藜蘆醇在蘋果輪紋病防治方面的研究尚未見報道，但在其它植物病原防治方面的研究已有報道。研究表明，白藜蘆醇可以抑制葡萄上灰霉菌、根霉菌、擬莖點霉等病原真菌的生長，對番茄早疫病菌、灰霉病菌、霉心病菌、炭疽病菌以及石榴果實黑斑病菌的菌絲生長也具有抑制作用，還對楊樹煙炭病菌、穿孔病菌、潰瘍病菌以及草莓病原真菌（灰葡萄孢菌、膠孢炭疽菌、立枯絲核菌）具有不同程度的抑制作用：白藜蘆醇處理碭山酥梨不僅具有一定的保鮮作用，還能顯著延緩碭山酥梨貨架期黑皮病的發(fā)生。此外，白藜蘆醇作為植物代謝中的次生代謝產(chǎn)物，其合成與苯丙氨酸代謝途徑密切相關(guān)，而苯丙氨酸代謝途徑參與木質(zhì)素、黃酮類、香豆素和芪類化合物等物質(zhì)的合成，其中，木質(zhì)素是植物組織的重要組成成分，可以保護植物免受各種致病菌的侵害。

轉(zhuǎn)錄組是指特定細胞或組織中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，目前，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于研究植物細胞對致病菌的脅迫應(yīng)答和病原菌的致病機理等方面。在蘋果輪紋病相關(guān)研究中，洪坤奇等在蘋果輪紋病菌侵染蘋果枝條階段的轉(zhuǎn)錄組研究中發(fā)現(xiàn)，與水解酶和果膠酶活性相關(guān)的基因以及與跨膜轉(zhuǎn)運、蛋白翻譯和糖類代謝相關(guān)的基因差異表達變化顯著；水楊酸（SA）誘導(dǎo)處理蘋果輪紋病不同抗性品種后的轉(zhuǎn)錄組表明，抗性品種的差異基因數(shù)量多，表明抗病品種的抗性相關(guān)基因更易受到SA的誘導(dǎo)。本研究通過對抗、感材料外源施加白藜蘆醇后針刺法接種蘋果輪紋病菌，觀察病斑大小的變化，并將0h和96h的樣品進行RNA-Seq測序分析，利用高通量測序技術(shù)探究白藜蘆醇處理并接種輪紋病菌后不同抗性材料的基因表達變化情況，以期為深入探究白藜蘆醇調(diào)控蘋果抗輪紋病機制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

抗病株系1-1-46和感病株系1-1-40，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果課題組從“雞冠”和“富士”的雜交后代中選出。2017年將兩種抗性株系分別嫁接于平邑甜茶上，常規(guī)管理。

1.2試驗方法

分別選取抗、感材料當(dāng)年生春梢頂端第5～7片完全展開的葉片，用500ug/mL白藜蘆醇浸泡30min（Res處理），以蒸餾水浸泡為對照（CK）；待葉片表面水分自然晾干后進行針刺法接種蘋果輪紋病菌，接菌方法參照韓林林的方法：觀察病斑的變化，并選取接種0h和96h抗、感材料的Res處理和CK樣品用于RNA-seq分析，每處理3個生物學(xué)重復(fù)，共24份樣品。由北京百邁客生物科技有限公司完成測序。

1.3轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析

1.3.1轉(zhuǎn)錄組測序用NanoDrop2000分光光度計檢測RNA的純度和濃度，用Agient2100/Lab-Chip GX精確檢測RNA的完整性；用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物mRNA；加入Fragmen-tation Buffer將mRNA隨機打斷：以mRNA為模板，合成第一條cDNA鏈及二鏈，并進行cDNA純化；純化的雙鏈cDNA再進行末端修復(fù)、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫；之后進行文庫質(zhì)控，再使用Illumina NovaSeq6000測序平臺進行PE150模式測序，測序工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3.2與蘋果參考基因組比對及基因功能注釋

利用HISAT2將clean reads與蘋果參考基因組（https：//iris. angers. inra. fr/gddh13/the-apple-ge-nome-downloads.html）進行比對得到Mapped Data后，進行文庫質(zhì)量評估、差異表達分析、基因功能注釋等。

1.4實時熒光定量PCR分析

為驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從差異基因數(shù)據(jù)庫選取9個基因，并利用Primer Premier 6.0設(shè)計引物（表1），分析實時熒光定量PCR結(jié)果是否與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。

2結(jié)果與分析

2.1白藜蘆醇處理后葉片接種輪紋病菌的病斑大小變化

由圖1可知，對照處理下，抗、感材料葉片接菌后，隨時間推移，病斑面積逐漸增大，其中感病材料1-1-40的病斑面積增長較快。接菌72h后感病材料的病斑面積顯著大于抗病材料，接菌144h時感病材料1-1-40的病斑面積為19.07mm2，顯著高于抗病材料1-1-46的病斑面積（9.81mm2）。

抗、感材料經(jīng)白藜蘆醇處理后，接種輪紋病菌96～144h的病斑面積顯著低于對照，均表現(xiàn)為抗病材料的病斑面積顯著低于感病材料；144h時，感病材料1-1-40的病斑面積為17.04mm2，抗病材料1-1-46的病斑面積為6.41mm2。

2.2轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

經(jīng)測序質(zhì)量控制，對白藜蘆醇和對照處理后接菌0h和96h的24個樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，共獲得173.80Gb Clean Data，各樣品CleanData均達到6.05Gb，GC含量在46.07%～47.46%之間．Q20和Q30值分別在98.13%及以上和90.67%及以上（表2）。說明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，可滿足后續(xù)分析。

2.3差異表達基因統(tǒng)計

以log2（Fold change）≥2且FDR（False Dis-covery Rate）<0.01作為篩選條件，對白藜蘆醇處理后抗、感材料接種輪紋病菌Oh和96 h的差異表達基因（DEGs）進行分析，結(jié)果（表3）顯示，感病材料1-1-40經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌0h時（CKl_vs_T1）共有443個DEGs，其中上調(diào)表達的有1 84個，下調(diào)表達的有259個；抗病材料1-1-46經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌Oh時（CK2-vs-T2）共有1855個基因差異表達，其中1240個上調(diào)表達，615個下調(diào)表達；感病材料經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌96h時（T3-vs-T5）共有1596個DEGs，其中455個上調(diào)表達，1141個下調(diào)表達：抗病材料經(jīng)白藜蘆醇處理后接菌96h時（T4-vs=T6）共有2683個DEGs，其中1391個上調(diào)表達，1292個下調(diào)表達。

綜合來看，白藜蘆醇處理后，抗、感試材中的DEGs均是接菌96h的多于0h的，抗病材料的DEGs多于感病材料的：抗病材料中上調(diào)表達的基因多于下調(diào)表達的基因，而感病材料中則相反，下調(diào)表達的基因更多。說明抗病材料經(jīng)白藜蘆醇處理并接種蘋果輪紋病菌后葉片內(nèi)的基因表達模式變化比較激烈，而感病材料的變化則相對溫和且以下調(diào)表達的基因較多。

進一步利用Venn圖比較4個組的DEGs．由圖2可知，對于上調(diào)表達的基因，在接菌Oh時，有105個僅在感病材料中特異表達，有909個僅在抗病材料中特異表達：接菌96h時，有292個僅在感病材料中特異表達，有1060個僅在抗病材料中特異表達。對于下調(diào)基因，接菌Oh時，有157個僅在感病材料中特異表達，有431個僅在抗病材料中特異表；接菌96h時，有894個僅在感病材料中特異表達，有1107個僅在抗病材料中特異表達。進一步說明抗病材料應(yīng)對病菌侵染的基因表達模式較多。

2.4差異表達基因的GO功能注釋

由表4可見，比較組CKl_vs_T1中的DEGs有373個注釋到生物過程，518個注釋到細胞成分，375個注釋到分子功能；CK2-vs-T2中的DEGs有1670個注釋到生物過程，有1961個注釋到細胞成分，有1648個注釋到分子功能；T3_vs_T5中的DEGs有1531個注釋到生物過程，有1888個注釋到細胞成分，有1467個注釋到分子功能：T4_vs_T6中的DEGs有2612個注釋到生物過程，有3082個注釋到細胞成分，有2406個注釋到分子功能。綜合來看，4個比較組中的DEGs均以注釋到分子功能中的結(jié)合能力和催化活性中的最多。

2.5差異表達基因KEGG通路富集分析

為進一步分析白藜蘆醇處理后蘋果輪紋病抗、感材料的DEGs在代謝通路中的功能，進行KEGG Pathway富集分析，結(jié)果（表5）顯示，在P<0.05的情況下，抗病材料比較組間DEGs富集的代謝通路多于感病材料，接菌96h的DEGs富集到的通路多于0h的。

接菌0h，感病材料CK1_vs_T1富集的通路只有3條，富集到植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（plant hor-mone signal transduction，k004075）途徑的基因數(shù)最多，為16個，其次是糖酵解／糖異生（glycolysis/gluconeogenesis，k000010）和花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism，k000590）途徑，分別有7個和3個基因；而抗病材料CK2-vs-T2富集到13個通路，富集到植物一病原互作（plant-patho-gen interaction，k004626）途徑的基因最多，為127個，其次是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路一植物（MAPK signaling

pathway-plant，k004016）、淀粉和蔗糖代謝（starch and sucrose metabolism，k000500）、苯丙素生物合成途徑（phenylpropanoid bi-osynthesis，k000940）。接菌96h，感病材料T3_vs_T5富集到6個通路，富集到植物一病原互作途徑的DEGs最多，為131個，其次是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路一植物、淀粉和蔗糖的代謝等途徑；抗病材料T4-vs-T6富集到14個代謝通路，同樣是富集到植物一病原互作途徑的DEGs最多，為138個。

綜合來看，富集到植物一病原互作通路的DEGs最多，其次是植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、MAPK信號通路一植物、淀粉和蔗糖代謝等通路。此外，抗病材料的比較組還富集到了與木質(zhì)素合成相關(guān)的苯丙素生物合成途徑，分別有39個和75個基因。

2.6轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證

為進一步明確轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，從涉及的主要代謝通路中挑選出9個變化明顯的差異基因進行qRT-PCR驗證，分別是與植物一病原互作相關(guān)的基因MD14G1077700、MD14G1170900、MD10G1286300、MD10G1333100和與植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因

MD03G1273300、MD15G1225800、MD16G1178100、MD02G1165500、MD09G1042400。結(jié)果如圖3所示，圖中柱形為轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，折線為qRT-PCR擴增結(jié)果?？梢?，兩種數(shù)據(jù)雖在差異倍數(shù)上存在差異，但總體趨勢相同，表明該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)確切、可靠。

3討論與結(jié)論

天然的白藜蘆醇在植物遭到病原菌侵害時產(chǎn)生，對多種病原真菌具有顯著的抗菌作用，同時被發(fā)現(xiàn)具有抗氧化和抗癌等作用。有研究表明，白藜蘆醇和嘧霉胺聯(lián)合使用，對葡萄灰霉病具有協(xié)同抗性，可抑制菌絲生長和分生孢子萌發(fā)。經(jīng)白藜蘆醇處理后的番茄葉片再接種早疫病菌，葉片病斑面積顯著小于對照，且隨白藜蘆醇濃度的增大病斑面積逐漸減小，說明白藜蘆醇可以在一定程度上保護番茄葉片免遭早疫病菌的侵害。Schulze等研究表明白藜蘆醇對蘋果黑星病菌孢子萌發(fā)無抑制作用，但能抑制其孢子的入侵，提高蘋果葉片對黑星病菌的抵抗力。本研究用500ug/mL白藜蘆醇處理蘋果輪紋病抗、感材料的葉片后再接種輪紋病菌，相比于對照，病斑面積均減小，說明白藜蘆醇對葉片起到一定的保護作用。

植物激素是植物體內(nèi)合成的微量有機物，對其抗病性和生長發(fā)育具有顯著作用。有研究表明，植物可以利用體內(nèi)激素間的協(xié)同作用抵御病原菌的入侵。本研究中KEGG代謝通路的分析結(jié)果顯示，蘋果輪紋病抗、感材料中富集在植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的DEGs較多，抗病材料比較組接菌0h和96h富集到該途徑的DEGs分別為127個和138個，而感病材料0h和96h富集到該途徑的DEGs分別為16個和131個，說明抗病材料體內(nèi)有豐富的抗性系統(tǒng)，可在病原菌侵染后立刻做出反應(yīng)，而感病材料反應(yīng)相對緩慢。

苯丙烷代謝途徑在植物的抗病系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，其產(chǎn)物木質(zhì)素、類黃酮和植保素等是植物抗逆防御反應(yīng)不可或缺的，對真菌和細菌具有抑制活性。類黃酮可以提高植物自身的防御能力，如激活水楊酸、脫落酸等逆境響應(yīng)激素的信號通路，以應(yīng)對外界環(huán)境的刺激，提高植物的抗病性。本研究中白藜蘆醇處理后蘋果輪紋病抗性材料中DEGs在苯丙素和類黃酮生物合成途徑也有顯著富集，而感病材料中沒有，因此推測苯丙素和類黃酮生物合成途徑與蘋果輪紋病抗性相關(guān)。此外，有研究表明，部分ABC轉(zhuǎn)運蛋白影響病原真菌的致病力，葡萄孢菌中已克隆了14個ABC轉(zhuǎn)運蛋白，且已證實其中Bcatr B、Bcatr D和Bcatr K 3個蛋白與多藥抗性有關(guān)。而本研究中ABC轉(zhuǎn)運蛋白途徑也在抗病材料中被顯著富集。

遭受病原菌侵染時，不同植物的反應(yīng)機制不同。類鈣調(diào)蛋白（calmodulin-like protein，CML）是植物細胞中的鈣離子結(jié)合蛋白，在植物生長發(fā)育和逆境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要功能，主要通過調(diào)節(jié)各類靶點而在細胞信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，從而響應(yīng)植物脅迫應(yīng)答反應(yīng)和系統(tǒng)發(fā)育。本研究中，在植物一病原互作途徑發(fā)現(xiàn)多個CML基因（CML42、CML49、CML36、CML50），在抗病材料中，與對照相比，白藜蘆醇處理后除CML50呈現(xiàn)下調(diào)表達趨勢外，其他均呈顯著上調(diào)表達趨勢：而在感病材料中，這些基因的表達變化并不明顯，說明在抗病材料中Ca2+信號被激活，也參與了蘋果輪紋病菌入侵信號調(diào)控的抗病反應(yīng)。

綜上所述，白藜蘆醇處理能顯著降低蘋果輪紋病抗、感材料葉片接菌96～144h的病斑面積；白藜蘆醇處理后抗病材料各比較組的DEGs及其富集的代謝通路均多于感病材料。白藜蘆醇能在一定程度上提高蘋果的輪紋病菌抗性。