丁寶鋒，王小爽，王 芳，余 佳

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 重大疾病共性機制研究全國重點實驗室，北京 100005

肥胖(obesity)以脂質(zhì)積累過多和低度慢性炎性反應(yīng)為主要特征,與當(dāng)今人類的許多健康問題密切相關(guān),如心腦血管疾病、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝[1-2]等。目前,由于飲食結(jié)構(gòu)的改變,全球已出現(xiàn)近20億肥胖和超重的個體[3],因此肥胖的高發(fā)病率已經(jīng)成為威脅公共健康的一個重要因素。肥胖發(fā)生的主要原因是能量的產(chǎn)生和消耗之間的不平衡,由于肥胖與多種疾病的發(fā)生高度相關(guān),因此全方面了解肥胖對人體造成的影響是非常重要的[4]。肥胖小鼠模型的建立,對于研究者探究肥胖的發(fā)生機制以及尋找潛在的治療靶點具有非常重要的作用。

肝臟是人體中最重要的代謝器官,是多種物質(zhì)代謝的主要場所[5]。糖類、脂類及氨基酸三大營養(yǎng)物質(zhì)的代謝過程均由肝臟完成,其中的生化過程對于維持代謝平衡、排出代謝廢物和維護生命健康等方面都具有極其重要的作用[6-7]。同時,肥胖會引起肝臟的功能異常,可能進一步誘發(fā)非酒精性脂肪肝,非酒精性脂肪性肝炎以及肝纖維化等多種疾病表現(xiàn)[8-10]。此外,肥胖一旦導(dǎo)致肝功能受損,機體多個重要臟器功能亦可能出現(xiàn)障礙。綜上,基于肝臟在代謝功能方面的重要性,從代謝的角度對肝臟及其相關(guān)疾病進行系統(tǒng)研究就顯得尤為重要。本研究通過對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟進行病理觀察以及代謝組學(xué)研究,揭示了肥胖小鼠肝臟的代謝改變,為后續(xù)對肝臟疾病的機制研究與臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及飼料:用于建模的C57BL/6J雄性小鼠(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)40只,飼養(yǎng)于中國疾病預(yù)防控制中心職業(yè)衛(wèi)生與中毒控制所動物實驗室;普通飼料(xt013,江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司);高脂飼料(D12492,Research Diets公司)。

1.1.2 主要試劑:4%多聚甲醛(P4500,Lablead公司);蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(C0105S,碧云天生物技術(shù)有限公司);天狼猩紅染色試劑(S8060,北京索萊寶科技有限公司);純甲醇(10014108,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型的建立:6周齡的小鼠隨機分成兩組:一組飼喂普通飼料(chow diet,CD),作為對照組;另一組飼喂高脂飼料(high-fat diet,HFD),作為實驗組。

1.2.2 肝臟組織病理學(xué)的檢測:取1 cm×1 cm×0.5 cm的小鼠肝臟組織,使用10倍體積的4%多聚甲醛固定后,進行石蠟包埋,取5 mm的切片進行HE染色和天狼猩紅染色,評估其病理學(xué)改變。

1.2.3 代謝組學(xué)檢測及分析:1)取樣:剪取一片小鼠肝臟組織于標記好的錫箔紙中,拍扁置于液氮速凍,隨后放入-80 ℃冰箱保存。2)樣本萃取及檢測:將凍存的肝臟組織置于干冰上,用預(yù)冷的鑷子取出5～20 mg組織于離心管中稱重并記錄。稱取完成后在管中放入研磨小鋼珠,然后置于震蕩研磨機中研磨成粉末。根據(jù)所取的肝臟組織質(zhì)量按照1∶40的比例加入80%甲醇(1 mg組織加入40 mL的80%甲醇)萃取,震蕩,使肝臟組織粉末充分溶解于甲醇中(全程干冰上操作,防止組織融化)。4 ℃,15 000 rpm離心30 min,取上清液于新管。4 ℃,15 000 rpm重復(fù)離心30 min,取50 mL上清于進樣瓶后通過超高效液相色譜-質(zhì)譜對肝臟代謝組進行檢測。3)代謝組分析:原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用El-MAVEN軟件進行峰檢測、峰對齊以及歸一化。進一步數(shù)據(jù)分析采用MetaboAnalyst(https://www.metaboanalyst.ca/)分析網(wǎng)站進行主成分分析(principal component analysis,PCA)、t檢驗和差異倍數(shù)分析(fold change analysis)。本研究結(jié)合差異倍數(shù)(fold change)和Pvalue值來篩選差異代謝物。篩選條件:fold change≤0.5或者≥2;P<0.05,兩者取交集得到差異代謝物。并基于生物學(xué)數(shù)據(jù)庫KEGG(https://www.kegg.jp/)進行代謝通路分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 正常組和高脂組小鼠體質(zhì)量變化和肝臟質(zhì)量變化

分飲食飼養(yǎng)24周后HFD組小鼠體質(zhì)量明顯高于CD組,雖然在建模的不同時間點,CD組和HFD組小鼠平均體質(zhì)量均有所增長,但HFD組小鼠體質(zhì)量增長幅度更大。在建模第8周、第16周和第24周HFD組小鼠體質(zhì)量均顯著高于 CD 組(P<0.0001)(圖1A)。同時,HFD 組小鼠的肝臟較CD組明顯變大,泛白,表面出現(xiàn)明顯的脂滴沉積,并且肝臟質(zhì)量也顯著高于CD組(圖1B,C)。綜上,通過高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠在體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量上均較對照組有顯著增加。

A.body weight of HFD and CD group mice at different modeling time;B.liver of HFD and CD group mice;C.liver weight of HFD and CD group mice; *P<0.0001 compared with CD group.

2.2 正常組和高脂組小鼠肝臟病理特征觀察

2.2.1 肝臟的HE染色結(jié)果:CD組肝臟結(jié)構(gòu)完整,肝小葉輪廓清楚完整,肝細胞索排列整齊,肝竇清晰可見。未見炎性細胞浸潤和纖維組織增生。肝細胞呈圓形,細胞核位于肝細胞中央,肝臟間質(zhì)未見炎性反應(yīng)(圖2A)。

A.HE staining of hepatocytes in CD group mice (×10); B-D.HE staining of hepatocytes in HFD group mice (×40;×100;×400);Arrows indicate steatosis of liver;E.Sirius red staining of hepatocytes in CD group mice (×10);F-H.Sirius red staining of hepatocytes in HFD group mice (×40;×100;×400); Arrows indicate fibrosis of liver.

HFD組肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,未形成典型肝竇肝索結(jié)構(gòu),中央靜脈周圍和間質(zhì)見輕微單核性炎性細胞浸潤。肝細胞嚴重變性,細胞大小和形態(tài)不一,部分肝細胞呈空泡變性,且肝臟出現(xiàn)大面積脂肪變性(圖2B～D)。

2.2.2 肝臟天狼猩紅染色結(jié)果:CD組小鼠肝臟天狼猩紅染色呈陰性,肝細胞及間質(zhì)內(nèi)未見天狼猩紅陽性反應(yīng),肝細胞間和小葉間均未見纖維細胞增生,僅在血管壁(含膠原纖維)可見紅色染色的陽性細胞(圖2E～H)。

2.3 正常組和高脂組小鼠肝臟的代謝組學(xué)分析

為了進一步探究肥胖是否伴隨著肝臟代謝能力的改變,本研究對HFD和CD組小鼠的肝臟進行了非靶向代謝組學(xué)測序。首先,主成分分析(PCA)結(jié)果顯示HFD與CD組之間具有明顯的分離趨勢,提示兩組的肝臟代謝譜有顯著的差異(圖3A);同時,對HFD和CD組肝臟之間的差異代謝物進一步進行篩選(fold change≤0.5或≥2且P<0.05),共發(fā)現(xiàn)151個差異代謝物,其中HFD較CD組上調(diào)了40個代謝物,下調(diào)了111個代謝物(圖3B);最后,通過對兩組的差異代謝物進行KEGG通路富集,結(jié)果顯示HFD較CD組小鼠的肝臟差異代謝物主要集中在苯丙氨酸代謝、TCA循環(huán)、鞘脂類代謝、精氨酸生物合成和初級膽汁酸的生物合成等代謝通路中(圖3C)。

A.PCA analysis showed significant differences between HFD and CD group mice;B.volcanic map of HFD vs CD,up-regulated metabolites:40,down-regulated metabolites:111;C.enriched pathways of differential metabolites between HFD and CD group mice.

3 討論

代謝組學(xué)分析技術(shù)已經(jīng)成為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要手段之一,能夠幫助研究人員更加深入地了解生物體內(nèi)的代謝環(huán)境和代謝網(wǎng)絡(luò)的運行規(guī)律,進而為患者提供更為準確的臨床診斷和個性化治療方案[11]。但是目前對于肥胖小鼠肝臟代謝組學(xué)的相關(guān)研究仍然較為缺乏。因此探究肥胖小鼠肝臟的病理特征和代謝組學(xué)改變是非常有意義的。

此外,由于人類飲食結(jié)構(gòu)的改變,全球肥胖人數(shù)逐年上漲。據(jù)研究報道,肥胖是導(dǎo)致非酒精性脂肪肝病等肝臟疾病的[1-2]的重要因素。本研究模擬人類肥胖的發(fā)生過程,利用高脂飲食成功誘導(dǎo)了小鼠肥胖模型,為研究者探究肥胖的發(fā)生機制以及尋找潛在的治療靶點提供了參考。本研究結(jié)果顯示 CD 組小鼠肝臟無明顯脂滴沉積,也未見脂肪變性;HFD組小鼠肝臟在建模 24 周時出現(xiàn)大面積脂肪變性和輕微纖維化。通過將HFD和CD組小鼠肝臟進行代謝組學(xué)檢測并輔以相應(yīng)的數(shù)據(jù)分析,進一步完成了兩組小鼠肝臟差異代謝物的篩選以及差異代謝通路的富集,發(fā)現(xiàn)與CD組相比,HFD組小鼠肝臟內(nèi)代謝物組成出現(xiàn)巨大改變,多種代謝物出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)的變化。其中發(fā)生顯著改變的肝臟代謝物富集于苯丙氨酸代謝、檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))、鞘脂類代謝、精氨酸生物合成和初級膽汁酸的生物合成等代謝通路。

雖然苯丙氨酸代謝、 檸檬酸循環(huán)以及鞘脂類代謝等在肝病中發(fā)生紊亂的證據(jù)已經(jīng)十分充足,但在目前的研究中尚不能確定這種代謝紊亂是由肝臟病變引起,還是僅僅與肥胖、胰島素抵抗有關(guān),這也是目前迫切需要解決的問題。不過研究者依然能夠通過調(diào)節(jié)這些代謝通路的穩(wěn)態(tài)來達到預(yù)防或治療肝臟病變的目的。已有報道指出肥胖人群的腸道菌群會發(fā)生紊亂,改善肥胖人群的腸道菌群能夠調(diào)節(jié)膽汁酸的合成與苯丙氨酸代謝,進而有助于肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝等代謝性疾病的治療[12-13]。也有報道發(fā)現(xiàn)Omega-3 多不飽和脂肪酸可以通過維持檸檬酸循環(huán)的穩(wěn)態(tài)來預(yù)防肥胖,進而保護肝臟[14]。所以,本研究發(fā)現(xiàn)的一系列肥胖狀態(tài)下肝臟代謝通路的異常,有望對臨床治療肥胖以及相關(guān)肝病提供新的思路。

總之,本研究通過一系列相關(guān)分析,為研究肝臟病變的調(diào)控因素,挖掘肝臟的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò),完善肝臟的代謝圖譜提供了參考,對正確認識人類肝臟發(fā)育及肝臟相關(guān)疾病的病變過程以及尋找肝臟疾病的治療靶點具有十分重要的意義。